МЕХАНІЗМИ ІНТОКСИКАЦІЙ

УДК 577.112: 577.122: 579.222: 636.2.612.015.33

Н.І. Руснак, Л.Г. Калачнюк, к.б.н., Л.М. Романишина, д.б.н., Г.І. Калачнюк, д.б.н.

ТОКСИЧНА ДІЯ ПЕНТАХЛОРФЕНОЛУ НА АКТИВНІСТЬ ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИХ ЕНЗИМІВ ЗМІШАНОЇ ПОПУЛЯЦІЇ БАКТЕРІЙ РУБЦЯ

Науково-дослідний інститут біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького,
Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського

Вступ. Про інгібуючу дію пентахлорфенолу (ПХФ) на метаболічні процеси в рубці вказувалося раніше [5—7, 10]. Зокрема, це чітко було показано на рівнях кінетики утворення кінцевих продуктів мікробної ферментації під впливом різних доз ПХФ [5, 7]. Встановлено, що токсичність ПХФ у певній мірі залежить не тільки від дози ПХФ, але й від мікроорганізмів-симбіонтів, які сформовують екосистему. Особливості інтенсивності впливу цього біоциду на різні ланки метаболізму, що зазвичай відмічаються при вивченні дії антибіотиків і токсинів (мембранний транспорт, енергетичний обмін, білковий біосинтез та ін.), залежать від видового складу мікробної популяції та метаболічного пулу інтермедіатів, які нагромаджуються на відповідному наборі біосубстратів, використаних за умов поширених програм біотехнології живлення [5]. Так, встановлено, що метаболізм змішаної мікробної популяції рубця, сформованої при збагаченні дієти зерноконцентратами, в порівнянні з такою, яка забезпечує високий вміст клітковини в раціоні, відрізняється підвищеною стійкістю до дії ПХФ, бо протікає на більш високому рівні і супроводжується підвищенням амілолітичної активності, утворенням лактату, аміаку й низькомолекулярних карбонових кислот при достовірному збільшенні молярного відсотку пропіонату [5—7].

Однак, ще залишається невідомим стан багатьох внутрішньоклітинних реакцій рубцевого бактеріального комплексу за умов впливу ПХФ, сорбентів й інших екзогенних факторів. З біохімічної точки зору найшвидшу відповідь можна одержати при вивченні активності ензимів, які швидко реагують на дію токсиканту. При цьому важливо знати, чи пом'якшує внесення у ростове середовище кліноптилоліту (Кл) токсичну дію біоциду на внутрішньоклітинну ензимну систему змішаної популяції бактерій, адже адсорбенти вважаються ефективними при отруєнні організму тварин токсикантами [3, 9]. На вирішення вказаних та інших питань й були спрямовані наші дослідження.

Матеріали та методи дослідження

Дослідження проводили в умовах in vivo та in vitro на зразках змішаних бактеріальних популяцій, які були сформовані на легкодоступних поживних біосубстратах (у добовому раціоні п'яти відгодованих бичків було 4—5 кг зерноконцентратів, 2,5—3 кг сіна, вволю силос кукурудзяний і 10 кг кормового буряку).

Рубцеву рідину відбирали носостравохідним зондом на 2—3 годині після ранкової годівлі і фільтрували через нейлонову тканину [1, 9]. Фільтрат змішували (1:2) з буфером McDougall й інкубували при 39°С в атмосфері СО2 протягом 12 годин [5]. Для оцінки токсичної дії біоциду ПХФ та виявлення протекторної здатності кліноптилоліту Сокирницького родовища було проведено три варіанти досліджень в умовах in vitro: 1 — контрольний (К), де ростове середовище із змішаною мікробною популяцією було без добавок ПХФ та Кл; 2 — ростове середовище з додаванням ПХФ (40 мкМ) і 3 — ростове середовище з добавками ПХФ (40 мкМ) та Кл (3 г/пробу) [6—8]. Мікробні культури росли до середини експоненціальної фази (log-фази). Клітини збирали диференційним центрифугуванням. Бактеріальну фракцію одержували при 5000 об/хв, 30 хв, 4°С. Потім двічі промивали 20 мМ К-Na-фосфатним буфером (рН 7,5), доводили концентрацію до 1 мг/мл й заморожували, додаючи до суспензії пісок (на одну третину об'єму). Руйнували клітини на холоді (4°С) з використанням планетарного вібратора К-23 (ФРН) при 1000 об/хв протягом 6 хв або ультразвукового диспергатора УЗДН-1 (22 кГц протягом 15 хв з інтервалом 30 с при 0°С). При цій же температурі центрифугуванням (18000 об/хв, 30 хв) одержували цитозолеву фракцію бактеріальних клітин. У останній визначали вміст білка [5] і спектрофотометрично — активність ензимів: лактатдегідрогенази — ЛДГ (КФ 1.1.1.27), форміатдегідрогенази — ФДГ (КФ 1.2.1.2), малатдегідрогенази — МДГ (КФ 1.1.1.37), ізоцитратдегідрогенази — ІЦДГ (КФ 1.1.1.42), малік-ензиму (КФ 1.1.1.40), аконітази (КФ 4.2.1.3) і фумарази (КФ 4.2.1.2) [2]. Активність ЛДГ, ФДГ, МДГ, ІЦДГ і малік ензиму оцінювали при l=340 нм й виражали в нМ НАД•H або НАДФ&3149;Н за хв на 1 мг білка [2, 5], активність аконітази — при l=240 нм, фумарази — при l=300 нм й виражали відповідно в нМ цис-аконітату або фумарату за 1 хв на 1 мг білка [5].

Всі аналізи проводили у п'яти повторностях, а одержані дані обробляли статистично й різниці між контрольними та дослідними варіантами вважали вірогідними за р<0,05.

Результати та їх обговорення

Одержані результати приведені у таблицях 1—3. Як видно із даних табл. 1, активність всіх досліджуваних внутрішньоклітинних ензимів змішаної популяції бактерій рубця під дією пентахлорфенолу (40 мкМ) суттєво знижується. Причому активність малатдегідрогенази й ізоцитратдегідрогенази зменшується на 20—30%, форміатдегідрогенази, малік-ензиму, аконітази й фумарази — у 2 рази, а лактатдегідрогенази — у 3 рази. Звідси виходить, що така сильна "отрута", як пентахлорфенол у кількості (40 мкМ) гальмує всі реакції, які каталізуються досліджуваними ензимами, але не в однаковій мірі. Це пояснюється тим, що у бактеріальнім комплексі рубця знаходиться велика кількість різновидів бактерій, які по-різному реагують на цей біоцид. Тому звідси й випливає потреба у вивченні токсичної дії пентахлорфенолу на окремі чисті штами бактерій, які знаходяться в рубцевій екосистемі, і зокрема, на їх ензиматичні властивості.

Раніше нами [5] було показано, що внесення в інкубаційне середовище різних концентрацій ПХФ (10, 20, 40, 100, 150, 300 мкМ) по-різному гальмує ріст бактерій. Так, мікробний комплес, що був сформований на раціонах із зниженим рівнем зерноконцентратів, є дуже чутливим навіть до низьких концентрацій біоциду (10, 20 і 40 мкМ). Середні дози ПХФ (100 і 150 мкМ) гальмують ріст бактерій на 80—90%, а високі (300 мкМ) — повністю інгібують їхній метаболізм. Це підтверджувалось результатами вивчення кінетичних кривих, які відображають рівень утворення кінцевих продуктів ферментації, тобто даними динаміки рН, низькомолекулярних карбонових кислот, азоту аміаку, лактату та багатьох інших показників інтенсивності бродіння. Значно витривалішою виявилася бактеріальна популяція рубця, яка була сформована на багатих крохмалем кормах — низькі дози ПХФ (10—40 мкМ) тільки частково гальмують метаболічні процеси, а середні (100 і 150 мкМ) інгібують метаболізм на 40—50%. Тільки у дозі 300 мкМ ПХФ бактеріальний метаболізм гальмується повністю.

У інших дослідах [6, 7] було виявлено, що добавки кліноптилоліту вірогідно знижують токсичну дію ПХФ і позитивний ефект їх є значно вищий тоді, коли мікробна популяція сформовується на більш доступних для бактерій кормах. На основі цього зроблено припущення, що Кл не тільки послаблює дію токсиканта, але й виступає у ролі своєрідного регулятора метаболічних процесів у мікробній екосистемі рубця.

Як свідчать дані табл. 2, внесення в інкубаційне середовище кліноптилоліту частково відновлює втрачену під дією біоциду активність усіх внутрішньоклітинних ензимів бактеріального комплексу (на 19—47%). Але до повного повернення початкової активності контрольного варіанту ще залишається відносно далека відстань (табл. 3). І якщо за умов кліноптилолітової протекції активність таких ензимів, як малатдегідрогеназа та ізоцитратдегідрогеназа, наближається до їх звичайних рівнів (різниці складають ~13%), то відмінності в активності інших (малік-ензиму, фумарази, аконітази і форміатдегідрогенази) ще коливаються в межах 30—40%, а лактатдегідрогенази — залишаються більш, ніж у 2 рази нижчими (~58%). Це ми пов'язуємо із різним ступенем ураження токсином клітин окремих груп бактерій у рубцевій екосистемі, яка сформувалася на біосубстратах концентратної дієти, що узгоджується із опублікованими результатами досліджень у цьому напрямку [5—7].

Висновки

1. Низькі дози (40 мкМ) біоциду пентахлорфенолу інгібують активність таких внутрішньоклітинних ензимів рубцевого бактеріального комплексу, як лактатдегідрогеназа, малатдегідрогеназа, ізоцитратдегідрогеназа, форміатдегідрогеназа, малік-ензим, аконітаза й фумараза.

2. Ступінь інгібірування реакцій, які каталізуються вказаними ензимами, залежить від кількісно-якісного бактеріального складу мікробних екосистем, сформованих за відповідних умов субстратного забезпечення їх життєдіяльності.

3. Внесення кліноптилоліту у культуральне середовище з біоцидом зменшує (на 19—47%) інгібуючу дію пентахлорфенолу на активність внутрішньоклітинних ензимів змішаної популяції бактерій рубця.

Література
1. Возна О.Є. Екзогенна регуляція метаболізму вуглеводів мікробною популяцією рубця. Автореф. дис. ... канд. с.-г. наук: 03.00.04. —Львів, 2002. —18 с.
2. Войтюк О.А. Перетворення форміату і його вплив на окремі метаболічні процеси в рубці. Автореф. дис... канд.біол.наук: 03.00.04. —Львів, 1995. —22 с.
3. Засекін Д.А., Захаренко М.О., Мельничук Д.О. Ефективності застосування адсорбентів при отруєнні організму тварин важкими металами // Наук. вісн. нац. аграрн. ун-ту. —2000. —Т. 29. —С. 33—37.
4. Калачнюк Г.І. Симбіоз і біотехнологічні основи підвищення продуктивності тварин // Наук. вісн. Львів. держ. акад. вет. мед. —2000. —Т. 2, №2, Ч. 2. —С. 104—112.
5. Калачнюк Л.Г., Возна О.Є., Калачнюк Г.І. та ін. Метаболізм рубцевих мікробних популяцій, сформованих на біосубстратах із різною доступністю, за дії пентахлорфенолу // Укр. біохім. журн. —2002. —Т. 74, №3. —С. 31—41.
6. Калачнюк Л.Г., Руснак Н.І. Рівень кліноптилолітової протекції за дії пентахлорфенолу на рубцеві мікробні популяції, які формуються на біосубстратах різної доступності // Наук. вісн. Львів. держ. акад. вет. мед. —2003. —Т. 5, №2, Ч. 2. —С. 34—40.
7. Калачнюк Л.Г. Руснак Н.І., Романишина Л.М. Нейтралізуюча здатність кліноптилоліту в умовах токсичної дії біоциду на змішані мікробні популяції рубця // Праці 3-го Західноукр. симпоз. з адсорбції та хроматографії. —Львів, 2003. —С. 167—170.
8. Лебода Р., Скубішевська-Зємба Я., Лебединець Л.О. та ін. Концентрування хлороформу з водних розчинів адсорбентами різної природи // Праці 2-го Західноукр. симпоз. з адсорбції та хроматографії. —Львів. 2000. —С. 141—151.
9. Kalachnyuk G.I. Influence of zeolites on the metabolism in ruminants // Recent progress on mineral requirements in ruminants. Proc. Inter. Meet. — Kioto-Japan, 1989. —P. 114—119.
10. Yokoyama M.T., Johnson K.A., Giersak J. Sensitivity of ruminal microorganisms to pentachlorophenol // Appl. Environ. Microbiol. —1988. —V. 54, N11. —P. 2619—2624.


| Зміст |