МЕХАНІЗМИ ІНТОКСИКАЦІЙ

УДК 577.152.6

В.В. Сумбаев, к.б.н., И.М. Ясинская, к.б.н.

АКТИВНОСТЬ КСАНТИНОКСИДАЗЫ, СИНТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА И ПРОТЕИНКИНАЗЫ С В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ПОДОСТРОМ ВВЕДЕНИИ ФЕНОБАРБИТАЛА

Одесский Национальный университет им. И.И. Мечникова

Известно, что многие индукторы биосинтеза ферментов, относящихся к семейству цитохрома Р450, являются промоторами канцерогенеза, а также факторами, тормозящими апоптоз клеток. В частности, к таким соединениям относятся полихлорированные ароматические углеводороды — индукторы изоформ 1А1, 1А2 и 1В1 цитохрома Р450 [1], фенобарбитал — индуктор изоформ 1В1, 2В1 и 2С6 [1].

Установлено, что полихлорированные ароматические углеводороды — полихлорбифенилы и полихлордибензодиоксины ингибируют ксантиноксидазу (КФ: 1.2.3.2), связываясь с ферментом и подавляя при этом образование им супероксидного радикала [2]. С другой стороны, эти же соединения ингибируют экспрессию генов индуцибельной синтазы оксида азота (1.14.13.19) [3, 4]. Кроме того, ингибирование образования одного из радикалов — супероксида или NO на фоне гиперпродукции второго может быть причиной ингибирования апоптоза клеток — эти соединения по отдельности индуцируют апоптоз в клетках, активируя р53 через посредство МАР-киназного каскада [5], а также вызывая дисфункцию митохондрий [6]. Индукция биосинтеза изоформ 1А1, 1А2 и 1В1 цитохрома Р450 сопровождается активацией протеинкиназы С [1] — группы серин/треониновых протеинкиназ, играющих важную роль в процессах сигнальной трансдукции и особенно в индукции клеточного деления [7].

Данные о влиянии фенобарбитала на активность ксантиноксидазы и синтазы оксида азота практически отсутствуют. Установлено, что индукция цитохрома Р450, вызванная фенобарбиталом, сопровождается активацией образования диацилглицерола — аллостерического модулятора протеинкиназы С [7, 8]. Однако не выяснено, активируется ли протеинкиназа С под действии фенобарбитала.

Целью настоящей работы явилось исследование активностей ксантиноксидазы, синтазы оксида азота и протеинкиназы С в печени крыс при подостром введении фенобарбитала.

Материалы и методы исследования

В опытах in vivo использовали 20 крыс самцов линии Вистар в возрасте 5 мес, массой 200±30 г. Крыс делили на две группы по 10 животных в каждой. Животные первой группы были контрольными и получали перорально по 0,2 мл дистиллированной воды. Животные второй группы получали перорально суспензию фенобарбитала в дистиллированной воде из расчета 20 мг/кг массы. Инъекции производили ежедневно в течение 30 дней с интервалом в 24 часа. Через 2 ч после последней инъекции крыс под эфирным наркозом декапитировали и немедленно изолировали печень, которую гомогенизировали в 0,1 М трис — HCl буфере (рН 7,4) в соотношении 1:5.

В печени контрольных и опытных крыс определяли активность ксантиноксидазы, синтазы оксида азота, уровень цитохрома Р450 а также активность протеинкиназы С.

Активность ксантиноксидазы в гомогенатах печени определяли, как описано ранее [9], и характеризовали количеством мочевой кислоты, образуемой из ксантина (рН 8,2; 40°С) в течение 1 мин на 1 мг белка. Активность синтазы оксида азота определяли методом [10], основанном на регистрации количества продуктов аэробного окисления NO, образующихся в реакционной системе, содержащей гомогенат (в качестве ферментного препарата), аргинин (субстрат), 0,1 M трис — HCl — буфер (рН 7,4, буфер изначально содержал 2 мM СаCl2) и НАДФН+Н+ — донор электронов. Продукты аэробного окисления NO определяли при помощи реакции Грисса с последующим спектрофотометрическим анализом [10].

Уровень цитохрома Р450 в микросомах печени определяли методом дифференциальной спектрофотометрии [11].

Активность протеинкиназы С определяли по методике [12], основанной на изменении направления движения в агарозном геле (движется к аноду вследствие приобретения кислых свойств после фосфорилирования) щелочным пептидным субстратом нейрогранином после фосфорилирования протеинкиназой С, в нашей модификации (использовали 2% агарозный гель, приготовленный на 1 М трис-НCl буфере).

На втором этапе изучали in vitro влияние фенобарбитала на активность ксантиноксидазы и синтазы оксида азота. Для исследований был получен препарат ксантиноксидазы из печени крыс методом, основанном на аффинном осаждении фермента на ксантин-агарозе после предварительной очистки [13]. Фермент гомогенен по данным диск-электрофореза в ПААГ [13]. Активность ксантиноксидазы определяли в отсутствии и в присутствии 1—10 мкМ фенобарбитала [9]. Активность характеризовали количеством мочевой кислоты, образуемой из ксантина (рН 8,2; 40°С) в течение 1 мин на 1 мг белка. Для проверки возможности связывания фенобарбитала с ксантиноксидазой по аналогии с кортикостероидами и полихлорбифенилами производили следующие эксперименты. Известно, что барбитураты, связанные с белком любым типом химических связей, не могут быть аналитически определены без разрушения этих связей. Поэтому после 30-минутной инкубации определяли содержание свободного фенобарбитала [14] до и после обработки реакционной среды соляной кислотой [2] для того, чтобы подтвердить их связывание с ксантиноксидазой. Кроме того определяли содержание свободного фенобарбитала в реакционных системах, не содержавших ксантиноксидазу.

Ингибирование превращения субстрата ксантиноксидазой не всегда сопровождается значительным угнетением образования ею свободных супероксидных радикалов. Поэтому изучали влияние фенобарбитала на образование ксантиноксидазой супероксида методом, основанным на востановлении последним нитротетразолиевого синего в бисформазан, количество которого определяли спектрофотометрически [15] в описанных выше реакционных системах (концентрация ксантина в них составляла 4 мМ, фенобарбитала — 5 мкМ).

Влияние фенобарбитала на активность синтазы оксида азота in vitro изучали на гомогенатах печени крыс в реакционных системах, содержавших 1—10 мкМ этого препарата. Статистическую обработку результатов исследований производили в соответствии с t-критерием Стьюдента.

В работе использовали фенобарбитал фирмы ICN (США), агарозу и АТФ — фирмы SIGMA (США), остальные реактивы — фирмы REANAL (Венгрия).

Результаты и их обсуждение

В печени крыс, получавших фенобарбитал, активность ксантиноксидазы и синтазы оксида азота была достоверно снижена, а содержание цитохрома Р450 и активность протеинкиназы С достоверно повышены по сравнению с контрольной группой (таблица).

В исследованиях in vitro фенобарбитал ингибирует активность ксантиноксидазы при концентрациях 1—10 мкМ (рис. 1). При этом наблюдается угнетение образования ферментом супероксидного радикала (в отсутствии фенобарбитала оно составляет 314±15, а в присутствии — 146±7 нмоль/мин на 1 мг белка). Изучение кинетики ингибирования при концентрациях ксантина 1, 2, 3, 4, 10 и 20 мМ показало, что оно носит неконкурентный характер (рис. 2). Кi составила 6,14 мкМ.

Количество свободного фенобарбитала в реакционных системах после 30-минутной инкубации было гораздо меньше внесенного. После обработки реакционных систем раствором HCl количество свободного ингибитора возвращалось на исходный уровень. Следует отметить, что количество ингибитора, определенное экспериментально в реакционных системах, не содержавших ксантиноксидазу, соответствовало его количеству, внесенному в реакционную систему. Эти результаты подтверждают связывание фенобарбитала с ксантиноксидазой. Зависимость содержания связанного фенобарбитала от его количества, внесенного в реакционную систему, отображали в обратных координатах (рис. 3) и рассчитывали соответствующие величины средней константы диссоциации комплекса (kd) и максимальной величины связывания (bmax). Они составляют 5,3 мкМ и 35 молекул на 1 молекулу фермента, соответственно. В отношении механизма связывания, можно предположить, что он аналогичен таковому для кортикостероидов и полихлорированных ароматических углеводородов [2] — лиганды взаимодействуют со свободными sh-группами фермента (60—62 на мономер), вызывая изменение его конформации.

В условиях in vitro фенобарбитал при концентрациях 1—10 мкМ не изменяет активность синтазы оксида азота.

Итак, индуктор биосинтеза изоформ 1В1, 2В1 и 2С6 цитохрома Р450 фенобарбитал ингибирует активность ксантиноксидазы и снижает активность NO-синтазы (супероксид и NO, образующиеся в результате реакций, катализируемых этими ферментами, соответственно, являются индукторами апоптоза и ингибиторами цитохрома Р450). Возможно, снижение NO-синтазной активности in vivo является результатом подавления экспрессии генов индуцибельной изоформы фермента фенобарбиталом. С другой стороны, возможно, что в связи с фенобарбиталзависимой индукцией биосинтеза цитохрома Р450 происходит расход большого количества гема (все изоформы цитохрома Р450 — гемопротеиды) и возникает его дефицит для образования каталитически активной синтазы оксида азота. Кроме того, фенобарбитал вызывает активацию протеинкиназы С, возможно, вследствие индукции изоформы 1В1 цитохрома Р450. Биосинтез данного фермента активируется благодаря взаимодействию индуктора с Ah-рецепторами (aromatic hydrocarbone) [16]. Комплекс Ah-рецептор — лиганд является субстратом протеинкиназы С и фосфорилируется ею [17]. В этих условиях наблюдается стабильная активация протеинкиназы С. С другой стороны, активация протеинкиназы С может быть вызвана снижением содержания оксида азота, ингибирующего данный фермент, путем образования S-нитрозотиолов с реактивной SH-группой в составе его регуляторного домена [7].

Литература
1. Кобляков В. А. Индукторы суперсемейства цитохрома Р 450 как промоторы канцерогенеза // Биохимия. —1998. —63, №8. —C. 1043—1059.
2. Сумбаев В. В. In vitro влияние кортикостероидов, ДДТ и 4,9-дихлордибензодиоксина на активность ксантиноксидазы печени крыс. Обратная зависимость активности ксантиноксидазы и количества цитохрома Р450 в печени крыс in vivo // Биохимия. —2000. —65, №8. —С. 1146—1150.
3. Хаценко О. Взаимодействие оксида азота и цитохрома Р 450 в печени // Биохимия. —1998. —63, №7. —С. 984—992.
4. Sumbayev, V. V. and Yasinska, I. M. (2000) Comparative studies of the different natured unsteroid estrogens effects on xanthine oxidase (XOD), nitric oxide synthase (NOS), proteinase, deoxyribonuclease and poly-(ADP-riboso)-polymerase (PARP) activities, cytochrome P450 isoforms level and cell proliferative activitiy in the rat liver. 18-th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in Birmingham, Abstract Book, UK, July 2000. —321 p.
5. Sumbayev, V. V., Yasinska I. M. Nitric oxide activates Apoptosis signal regulating kinase 1 forming S-nitrosothiols with reactive thioredoxin SH-groups // LAMSO Biochem. —2000. —1. —P. 95—100.
6. Sastre J, Pallardo FV, Vina J. Mitochondrial oxidative stress plays a key role in aging and apoptosis // IUBMB Life. —2000. —49, №5. —P. 427—435.
7. Azzi, A., Boscoboinik, D. and Hensey, C. Regulation of protein kinase C // Eur. J. Biochem. —1992. —208. —P. 547—554.
8. Ляхович В. В., Цырлов Б. И. Индукция ферментов метаболизма ксенобиотиков. —Новосибирск: Наука, 1981. —242 с.
9. Сумбаев В.В., Розанов А.Я. Влияние кофеина на активность ксантиноксидазы // Укр. биохим. журн. —1997. —69, №5—6. —С. 196—200.
10. Hevel S. M., White K. A., Marletta M. A. Purification of the inducible murine macrophage nitric oxide synthase. Identification as a flavoprotein // J. Biol. Chem. —1991. —266. —P. 22789—22791.
11. Omura T., Sato R. The carbon monoxide binding pigment of liver microsoms. Solubilization, purification and properties // J. Biol. Chem. —1964. —239. —Р. 2379—2385.
12. Uchida N., Okamura S., Kuwano S. Protein kinase C activity in human gastric carcinoma // Oncol. Rep. —2000. —7. —P. 793—796.
13. Пат. № 22683 A 6C 12N 9/02 Сумбаев, В.В. (1998) Способ очистки ксантиноксидазы. Опубл. 4/7/1998, Bull. №3 UA.
14. Лабораторные работы по фармацевтической химии. Под ред. В. Г. Беликова. —М: Высшая школа, 1989. —376 с.
15. Elferink, J. G. R. (1984) Measurement of the metabolic burst in human neutrophils: a comparison between cytochrome c and nitroblue tetrazolium reduction // Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. —1984. —43. —P. 339—342.
16. Omura, T. Forty years of cytochrome P450 // Biochem. Biophys. Res. Commun. —1999. —266. —P. 690—698.
17. Гужаева Е. Л., Осташкина Н. М. Кондаленко В. Ф., Кобляков В. А. Различные пути передачи митогенного и иднуцирующего сигналов индукторами цитохрома Р450 // Биохимия. —1999. —64. —С. 1105—1109.


| Зміст |