ВЛИЯНИЕ ХЛОРИДА КАДМИЯ НА РАЗВИТИЕ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА В ЛЕГКИХ КРЫС

Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Украина

Установлено, что введение хлорида кадмия (1,4 мг/100 г массы тела) приводит к развитию оксидативного стресса в легких крыс, о чем свидетельствуют повышение активности гемоксигеназы-1 — стрессорного белка и увеличение содержания ТБК-активных продуктов (МДА) через 24 ч после воздействия. Причиной развития оксидативного стресса является накопление в клетках легких мощного прооксиданта — гема, образовавшегося в результате внутрисосудистого гемолиза, что подтверждается увеличением содержания общего гема в сыворотке крови крыс. Показано также повышение уровня МДА в сыворотке через 2 ч, 6 ч и 24 ч и увеличение уровня спонтанного гемолиза эритроцитов, свидетельствующего о состоянии мембран красных клеток крови.

В структуре общей заболеваемости населения хронические неспецифические заболевания легких в настоящее время занимают третье место, что объсняется, прежде всего, повышенной загрязненностью окружающей среды и, в частности, атмосферы. Широкое использование тяжелых металлов в производстве, увеличение объема их добычи и переработки привели к значительному накоплению тяжелых металлов и их солей в окружающей среде. Поступление тяжелых металлов в организм вызывает нарушение метаболизма с развитием различных патологий, в том числе органов дыхания. Данные литературы о влиянии ионов кадмия на метаболизм в легких остаются малочисленными и противоречивыми [1].

Установлено, что ионы кадмия вызывают лизис эритроцитов с дальнейшим накоплением гема в кровяном русле [2], который за счет своей липофильности поступает в периферические ткани, минуя рецептор-опосредованные пути. Являясь мощным прооксидантом, гем активирует процессы свободнорадикального окисления с последующим повреждением биомолекул и развитием оксидативного стресса [3]. Защиту от прооксидантного действия гема осуществляет гемоксигеназа — микросомальный фермент, катализирующий первую скоростьлимитирующую реакцию деградации гема с образованием билирубина, монооксида углерода (СО) и железа. В настоящее время известны три изоформы данного фермента, являющиеся продуктами различных генов. ГО-2 и ГО-3 — конститутивные формы энзима, а ГО-1 индуцируется в ответ на действие различных агентов, таких как УФ-радиация, бактериальные токсины, тяжелые металлы, гипоксия и другие факторы, вызывающие развитие оксидативного стресса [4]. Продукты гемоксигеназной реакции являются биологически активными соединениями и участвуют в защитных реакциях при оксидативном стрессе [5]. Так, билирубин проявляет антиоксидантные свойства, СО является важной регуляторной молекулой, а железо стимулирует активацию экспрессии гена ферритина, в результате чего происходит связывание Fe²⁺ и выведение его из реакции Фентона. Однако малоизученным остается вопрос о роли гемоксигеназной системы в защите клеток легких от повреждающего действия гема, образующегося при гемолизе в результате воздействия на организм различных токсических агентов.

Целью данной работы стало исследование влияния гема, высвободившегося из лизированных эритроцитов при введении хлорида кадмия, на гемоксигеназную активность и содержание гема в легких крыс. О наличии внутрисосудистого гемолиза судили по содержанию общего гема в сыворотке крови, а о состоянии мембран эритроцитов — по степени спонтанного гемолиза эритроцитов. Учитывая способность свободного гема активировать процессы ПОЛ, в работе исследовали также содержание ТБК-активных продуктов (МДА) в сыворотке крови и в легких крыс.

Материалы и методы исследования

В работе использовали крыс-самцов линии Wistar с массой тела 200—250 г. Хлорид кадмия вводили подкожно в дозе 1,4 мг на 100 г массы тела за 0,5 ч, 2 ч, 6 ч и 24 ч до декапитации. Интактным животным вводили соответствующий объем физиологического раствора. Животных декапитировали под легким эфирным наркозом.

Кровь собирали для получения сыворотки и отдельно со стабилизатором для получения чистых эритроцитов. Легкие перфузировали in situ холодным 0,15 М физиологическим раствором через сердце. Навеску ткани гомогенизировали с 0,1 М К,Nа-фосфатным буфером.

Гемоксигеназную активность определяли в гомогенате легких крыс по количеству образовавшегося билирубина с использованием коэффициента экстинции 40 мМ^-1см^-1 и выражали в нмоль билирубина на 1 мг белка за 1 мин [6].

Содержание гема в сыворотке и гомогенате легких определяли спектрофотометрически с помощью пиридингемохромного метода, используя коэффициент экстинции 32,4 мМ^-1см^-1, и выражали в нмоль гема на 1 мл сыворотки и нмоль гема на 1 мг белка в гомогенате ткани [7].

Степень спонтанного гемолиза эритроцитов определяли по методу Ягера.

Содержание ТБК-активных продуктов (МДА) в сыворотке и в гомогенате легких определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой, используя коэффициент экстинции, равный 1,56•10⁵М^-1см^-1, и выражали в нмоль МДА на 1 мл сыворотки и в нмоль МДА на 1 мг белка в гомогенате легких.

Содержание белка в гомогенате определяли по методу Лоури в модификации Миллера, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Статистически результаты были обработаны непараметрическим тестом Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение

Из табл. 1 видно, что введение хлорида кадмия вызывает увеличение содержания общего гема в сыворотке крови через 2 ч и особенно к 24 ч. Это свидетельствует о наличии внутрисосудистого гемолиза при вышеуказанном воздействии, причем через 1 сут происходит большее накопление продуктов гемолиза в сыворотке по сравнению с 2 ч. Однако степень спонтанного гемолиза эритроцитов, свидетельствующая о состоянии мембран красных клеток крови, повышается уже через 0,5 ч (табл. 2). Это может быть связано с тем, что ионы кадмия, связываясь с sh-группами белков мембраны эритроцитов [8], вызывают конформационные изменения и частичные повреждения мембран этих клеток, снижая при этом их устойчивость к пероксидному гемолизу. Через 1 сут содержание общего гема в сыворотке выше контрольного значения в 3 раза (табл. 1), хотя уровень спонтанного гемолиза эритроцитов не отличается от контроля (табл. 2). Это можно объяснить тем, что гем и гемоглобин медленно выводятся из кровяного русла, а большая часть эритроцитов уже заменена на вновь образованные. Это предположение подтверждается тем, что гипоксия, возникшая вследствие внутрисосудистого гемолиза, активирует эритропоэз, о чем свидетельствует появление в крови большого количества ретикулоцитов [9].

После введения хлорида кадмия содержание МДА в сыворотке крови увеличивается на 23% через 2 ч, на 35% через 6 ч и на 46% через 24 ч (табл. 1). Повышение содержания ТБК-активных продуктов может быть обусловлено тем, что несвязанный гем является источником свободного железа, который стимулирует образование свободных радикалов и активирует перекисное окисление липидов [3].

Накапливаясь в большом количестве в кровяном русле, гем способен проникать в клетки различных тканей, в том числе легких. Содержание гема в клетках легких увеличивается через 6 ч после введения хлорида кадмия в 4 раза, а через 24 ч почти в 7 раз (табл. 3), что, скорее всего, связано с поступлением этого прооксиданта из кровяного русла. Увеличение содержания гема в легких приводит к повышению содержания МДА в клетках — через 1 сут 212% от контроля. Эти результаты согласуются с данными литературы о способности гема проявлять прооксидантные свойства и активировать процессы перекисного окисления липидов [3].

Увеличение содержание гема в клетках легких приводит к индукции гемоксигеназы-1. Повышение гемоксигеназной активности в легких наблюдается через 24 ч после введения хлорида кадмия (табл. 4), что может быть обусловлено синтезом фермента de novo [4]. Было установлено, что индукция гемоксигеназы в легких после введения хлорида кадмия может осуществляться также через последовательную активацию пути р38 киназы и nrf2 [10]. В результате гемоксигеназной реакции появляются продукты, участвующие в поддержании клеточного гомеостаза. Так, образующийся с помощью биливердинредуктазы билирубин, способный перехватывать активные формы кислорода, обладает антиоксидантными свойствами; СО, являясь регуляторной молекулой и проявляя антифибринолитические свойства, обеспечивает противовоспалительный и антиапоптозный эффект в легких; железо, образующееся в результате гемоксигеназной реакции, индуцирует синтез ферритина, который связывает fe²⁺ и ограничивает его прооксидантное действие [5].

В настоящее время не вызывает сомнения, что ГО-1 играет важную роль в адаптации клеток и тканей к различным видам стресса. Накопление ТБК-активных продуктов и повышение гемоксигеназной активности может свидетельствовать о том, что хлорид кадмия вызывает развитие оксидативного стресса в тканях легких крыс, обусловленого повышением содержания в клетках мощного прооксиданта — гема, поступившего из кровяного русла в результате внутрисосудистого гемолиза.

Литература
1. Kitajima H, Hirano S, Suzuki KT. Upregulation of heme oxygenase gene expression in rat lung epithelial cells following exposure to cadmium // Arch. Toxicol. —1999. —V. 73, N3. —P. 410—412.
2. Sarkar S., Yadav P., Bhatnagar D. Lipid peroxidative damage on cadmium exposure and alterations in antioxidant system in rat erythrocytes // Biometals. —1998. —N11. —P. 153—157.
3. Wagener F.A.D.T.G.A., Eggert А., Boerman O.C., Oyen W.J.G., Verhovstad A. Heme is potent inducer of inflammation in mice and is counteracted by heme oxygenase // Blood. —2001. —N6. —P. 1802—1811.
4. Maines M.D. The heme oxygenase system: a regulator of second messenger gases // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. —1997. —V. 37. —P. 517—554.
5. Otterbein L.E., Choi A.M.K. Heme oxygenase: colors of defense against cellular stress // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. —2000. —V. 279, N6. —P. 1029—1037.
6. Maines M.D., Kappas A. Prematurelly evoked synthesis and induction of d-aminolevulenat synthetase neonatal. Evidence for metal ion repression of enzime formation // J. Biol. Chem. —1978. —V. 253. —P. 2312—2336.
7. Paul K.G., Teorell H., Akeson A. // Acta Chem Scand. —1953. —N7. —P. 1284—1287.
8. Yang M. Effect of sulfhydryl reagent on spectrin states on the erythrocyte membrane // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1993. —V. 192. —P. 918—925.
9. Kostic M.M., Ognjanovich B., Dimitrijevich S., Zikic R.V., Stajn A., Rosic G.L., Zivkovich R.V. Cadmium-induced changes of antioxidant and metabolic status in red blood cells of rat: in vivo effects // Eur. J. Haematol. —1993. —V. 51, N2. —P. 86—92.
10. Alam J., Wicks C., Stewart D., Gong P., Touchard C., Otterbein S., Choi A.M.K., Burow M.E., Tou J. Mechanism of heme oxygenase-1 gene activation by cadmium in MCF-7 mammary epithelial cells // J. Biol. Chem. —2000. —V. 275, N36. —P. 27694—27702.

| Зміст |