УДК 577.352.33.0112

Ю.І. Губський, чл.-кор. АМН України, Н.В. Літвінова, д.м.н., Г.Г. Горюшко, к.х.н., В.П. Даниленко, к.х.н., О.М. Марченко, к.б.н., Т.М. Курапова, Н.М. Курська, О.М. Величко

МЕМБРАНОСТАБІЛІЗУЮЧІ ВЛАСТИВОСТІ ПОХІДНОГО ПІРИДИНКАРБОНОВОЇ КИСЛОТИ СПОЛУКИ ПВ-20 ЗА УМОВ ХІМІЧНОГО ПОШКОДЖЕННЯ КЛІТИН ПЕЧІНКИ ЩУРІВ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ

Інститут фармакології і токсикології АМН України, м. Київ

Головним механізмом пошкодження клітин печінки тетрахлорметаном (ТХМ) є поява вільно-радикальних метаболітів, які ініціюють процеси ліпопереокислення у мембранах клітин [1-3], що, в свою чергу, призводить до порушення структурно-функціональної стабільності останніх, зміни властивостей їх поверхні, мікров'язкості ліпідного бішару, стану білково-ліпідного контакту та активності мембранозв'язаних ферментів. Ефективним засобом захисту від таких уражень є застосування антиоксидантів — біологічно активних речовин (БАР), що мають антирадикальні або антиокислювальні властивості [4, 5]. Серед БАР, що впливають на вільно-радикальне окислення ліпідів, є сполуки класу нестероїдних протизапальних речовин (НПЗР) — ацетилсаліцилова кислота, похідні піридинкарбонових кислот та інші [6—8]. Препарат амізон (похідне піридинкарбонової кислоти) завдяки антиоксидантним та мембраностабілізуючим властивостям [5—12] був успішно застосований у комплексній терапії хронічного токсичного гепатиту [9].

Сполука ПВ-20 є структурним аналогом амізону, тому метою дослідження було вивчення механізму мембранозахисної дії сполуки ПВ-20 за умов її лікувально-профілактичного введення при отруєнях ТХМ тваринам.

Матеріали та методи дослідження

Сполука ПВ-20 (орто-[N-метил-ізонікотиноїл] метилсаліцилат йодиду) була синтезована у Інституті фармакології та токсикології АМН України.

Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар віком 3 міс з масою 150—200 г, які знаходились на стандартному раціоні віварію і отримували питво та їжу ad libitum.

ТХМ вводили тваринам внутрішньоочеревинно у дозі 1 ЛД₅₀ (1,75 мл/кг маси тіла). Сполуку ПВ-20 вводили також внутрішньоочеревинно двічі у дозі 1/10 ЛД₅₀ (5,2 мг/кг маси тіла) за 24 год до отруєння та через 1 год після отруєння ТХМ.

Контрольну групу складали інтактні тварини, дослідні групи — тварини, отруєні ТХМ, та отруєні ТХМ на фоні лікувально-профілактичного введення речовини ПВ-20.

Мембрани ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) печінки щурів виділяли методом диференційного центрифугування [13]. Стан процесів ПОЛ оцінювали, як описано у роботі [10], за вмістом кон'югованих дієнів та продуктів ПОЛ, що флуоресціюють. Вивчали також швидкість накопичення малонового діальдегіду (МДА) за методом індукованого НАДФН (НЗП) та аскорбатом (АЗП) ліпопереокислення. Структурний стан мембран ЕР печінки трьох груп експериментальних тварин вивчали методами флуоресцентного зондування [14] поверхневим зондом АНС (С_анс=10^-5 М), глибинним зондом піреном (С_пірен=5•10^-6 М) та методом гасіння власної білкової (триптофанової) флуоресценції мікросомальних мембран дифузійним гасником акриламідом, визначали значення констант Штерна-Фольмера (K_sv), що відображують щільність структури білків, швидкість дифузії акриламіду до флуорофорів [15]. Флуоресцентні дослідження проводили на спектрофлуориметрі Hitachi MPF-4 (Японія).

Одержані експериментальні дані піддавали статистичній обробці [16, 17].

Результати та їх обговорення

В табл. 1 наведені дані, що відображають вміст продуктів ПОЛ у мембранах ЕР клітин печінки трьох груп щурів: интактних, отруєних ТХМ та отруєних ТХМ за лікувально-профілактичного введення сполуки ПВ-20. Аналіз даних свідчить, що у мембранах ЕР клітин печінки отруєних ТХМ тварин має місце активація процесів ПОЛ. Вміст кон'югованих дієнів у гептановій фазі ліпідного екстракту мембран ЕР відносно показників інтактних тварин зростає майже на 30%, підвищується вміст кінцевих продуктів ПОЛ — шифових основ — на 46,8%. За умов отруєння ТХМ у мембранах ЕР гепатоцитів щурів вірогідно зростає швидкість накопичення ТБК-активних продуктів ПОЛ у системах спонтанного ліпопереокислення (на 55,2%) та АЗП (на 30,8%). Спостерігається тенденція до збільшення ТБК-активних продуктів також у системі НЗП.

Введення отруєним тваринам сполуки ПВ-20 призводить (табл. 1) до зниження у порівнянні з групою отруєних щурів рівня продуктів ліпопереокислення у мембранах ЕР клітин печінки тварин на 19—38%. Тобто, лікувально-профілактичне введення отруєним ТХМ тваринам сполуки ПВ-20 супроводжується антиоксидантну дією.

У табл. 2 наведені значення фізико-хімічних показників мембран ЕР клітин печінки досліджуваних груп тварин, що характеризують структуру поверхні мікросомальних мембран (значення інтенсивності флуоресценції аніонного поверхневого зонду АНС при вбудовуванні на поверхні мембран — f_анс, відн. од.), розпушеність структури білків (константа гасіння власної білкової флуоресценції акриламідом — константа Штерна-Фольмера, k_sv, М^-1), стан білково-ліпідного контакту — вірогідності індуктивно резонансного переносу енергії (ІРПЕ) — w, ум. од., а також мікров'язкості фосфоліпідного бішару — латеральної дифузії пірена, вбудованого в бішарі, яка визначається як співвідношення інтенсивностей флуоресценції його мономерної форми та ексимера (димера) — І₃₉₂/І₄₆₅, відн. од.

Як видно із даних табл. 2, зниження, порівняно з контролем, інтенсивності власної білкової флуоресценції мембран, F₃₃₀, а також інтенсивності флуоресценції зонда АНС, Fанс, вбудованого в мікросомальні мембрани з клітин печінки отруєних ТХМ щурів, свідчить про структурну модифікацію поверхні мембран та погіршення умов для вбудовування поверхневого зонду АНС. Лікувально-профілактична дія сполуки ПВ-20 призводить до часткової корекції показника F330 та вірогідно поліпшує вбудовування зонду АНС, нормалізує властивості поверхні мембран ЕР. Введення сполуки ПВ-20 позитивно впливає на показник Ksv (щільність структури білків), значення якого знижуються порівняно з отруєнням ТХМ та наближується до контролю.

Дослідження мембран ЕР за допомогою зонду пірену за методом ІРПЕ свідчать, що гідрофобна зона бішару мембран, де локалізований пірен, під впливом сполуки ПВ-20 зазнає змін, які призводять до ще більшого послаблення білково-ліпідного контакту, ніж при інтоксикації ТХМ. Однак, при цьому збільшення мікров'язкості ліпідного бішару мікросомальних мембран (параметр І₃₉₂/І₄₆₅, відн. од.), яке відбувається за умов отруєння ТХМ, частково коригується при лікувально-профілактичному введенні тваринам сполуки ПВ-20.

Таким чином, за умов отруєння тварин ТХМ та лікувально-профілактичного застосування сполуки ПВ-20 має місце мембраностабілізуюча дія останньої: корекція стану поверхні мікросомальних мембран, щільності структури білків, частковій нормалізації мікров`язкості. Наявність у сполуки ПВ-20 антиоксидантних здібностей та мембраностабілізуючої дії — складових гепатопротекторних властивостей — знаходить підтвердження у зниженні показника загибелі тварин під впливом ТХМ: лікувально-профілактичнє введення отруєним ТХМ щурам речовини ПВ-20 знижує цей параметр з 49,0% (отруєння ТХМ без введення ПВ-20) до 14,7%, тобто у 3,3 рази. Таким чином, в результаті проведених експериментів встановлено, що сполука ПВ-20 здатна нормалізовати стан ПОЛ та ряд структурно-динамічних показників мембран ЕР клітин печінки, порушених при отруєнні ТХМ. Застосування цієї сполуки в умовах отруєння щурів ТХМ достовірно знижує загибель тварин.

Література
1. Губский Ю.И. Коррекция химического поражения печени. —Киев: "Здоров'я", 1989. —168 с.
2. Губский Ю.И., Долго-Сабуров В.Е., Храпак В.В. Химические катастрофы и экология. —Киев: "Здоров'я", 1993. —224 с.
3. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. —Москва: "Наука", 1972. —252 с.
4. Моругова Т.В., Лазарева Д.Н. Влияние лекарственных средств на свободно-радикальное окисление // Экспер. и клин. фармакол. —2000. —Т. 63, N1. —С. 71—75.
5. Губский Ю.И., Тринус Ф.П., Бухтиарова Т.А., Горюшко А.Г., Даниленко В.Ф., Саченко Л.Г. Структурная модификация мембран мононуклеарных клеток крови крыс в условиях экспериментального артрита и фармакотерапии нестероидными противовоспалительными средствами // Журн. АМН України. —1999. —Т. 5, N1. —С. 110—120.
6. Губський Ю.І., Горюшко Г.Г., Курапова Т.Н., Вистунова И.Є., Даниленко В.П., Саченко Л.Г. Антиокислювальна та антирадикальна активність амізону, ацетілсаліцилової кислоти та ортофену // Ліки. —1999. —N3—4. —С. 55—59.
7. Губский Ю.И., Горюшко А.Г., Вистунова И.Е. и др. Антирадикальные и антиокислительные свойства нестероидных противовоспалительных средств —производных пиридинкарбоновых кислот // Укр. біохім. журн. —1999. —Т. 71, N5. —С. 85—89.
8. Подплетня О.А. Дозозалежний вплив ненаркотичного анальгетика амізону на процеси перекисного окислення ліпідів в утвореннях головного мозку щурів // Ліки. —1999. —N5—6. —С. 105—108.
9. Фролов В.М., Терьошин В.О., Бухтіарова Т.А. та інш. Ефективність нового українського препарату "Амізон" при хронічному токсичному гепатиті та його вплив на показники пероксидації ліпідів і системи антиоксидантного захисту // Ліки. —2000. —N5. —С. 3—6.
10. Губський Ю.І., Літвінова Н.В., Левицький Е.Л. та ін. Вплив препарату амізон на стан ушкодженних тетрахлорметаном хроматину та мембран клітин печінки щурів // Мед. хімія. —2000. —Т. 2, N3. —С. 5—10.
11. Губський Ю.І., Горюшко Г.Г., Літвінова Н.В. та ін. Вплив деяких похідних піридинкарбонових кислот на структурну модифікацію ізольованих мембран ендоплазматичного ретикулуму печінки щурів за умов інтоксикації тетрахлорметаном // Cовр. пробл. токсикол. —2002. —N1. —С. 68—72.
12. V.N. Kovalenko, Yu.I. Gubskiy, E.L. Levitskiy at all. .A stady of derivaties of arylamides of pyridinecarboxylic acids as potential hepatoprotectors under chemical lesion of a liver // Toxicol. Letters. —2001. —V. 123 (Suppl 1). —P. 126—127.
13. Карузина М.И., Арчаков А.И. Выделение микросомальной фракции и характеристика её окислительных систем // В кн.: "Современные методы биохимии". —Москва: "Наука", 1977. —С. 49—62.
14. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. —Москва: "Наука". —1989. —277 с.
15. Демченко А.П. Люминесценция и структура белков. —Киев: "Наукова думка", 1988. —280 с.
16. Ойвин И.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований // Патофиз. и эксп. тер. —1960. —N4. —C. 76—85.
17. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel. —Киев: "Морион", 2000. —320 с.