РОРІДИН Н ІЗ STACHYBOTRYS CHARTARUM

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного, Київ

Раніше [1] при порівняльному дослідженні токсигенного потенціалу штамів родів Myrothecium, Dendrodochium i Stachybotrys із застосуванням високоефективної рідинної хроматографії у одного з штамів Stachybotrys chartarum був виявлений швидко рухливий компонент, не характерний для токсигенних представників цього роду. Він давав властиве для макроциклічних трихотеценів (МЦТЦ) забарвлення з 4р-(нітробензил)піридином (4-ПНПБ) [2], але його не можна було ідентифікувати з жодним із відомих на сьогодні метаболітів Stachybotrys [3].

З огляду на невизначеність або ж неоднозначність трактування можливої ролі окремих мікотоксинів цього гриба в розвитку стахіботріотоксикозу як у людей, так і тварин, було доцільним провести більш детальне дослідження виявленої сполуки.

Матеріали та методи дослідження

В роботі був використаний S. chartarum 13959а, виділений з соломи в 1960 р. в Албанії. Культивування гриба здійснювали протягом 21 доби в стандартних умовах на просі [4].

Виділення комплексу мікотоксинів проводили згідно відпрацьованої раніше схеми [5]. Подальшу очистку і фракціонування препарату здійснювали за допомогою колонкової хроматографії на Al₂O₃ (ІІ ступеню активності за Брокманом, з розміром часток 100/160 мкм), використовуючи скляну колонку (190х20 мм).

Частково очищений екстракт (800 мг) розчиняли в хлороформі та сорбували його на невеликій кількості (1,5—2,0 г) окису алюмінію, ретельно випаровували під вакуумом і наносили на колонку.

Фракціонування стахіботріотоксинів здійснювали за допомогою ступеневої елюції різними розчинниками та їх системами в порядку зростання полярності. Системи розчинників були наступними: н-гексан-хлороформ (9:1); н-гексан-хлороформ (6:4); н-гексан-хлороформ (1:1); н-гексан-хлороформ (1:2); хлороформ; хлороформ-ізопропанол (95:5); ацетон. Всі розчинники попередньо піддавали ретельній дистиляції. Швидкість виходу з колонки була постійною (2 мл/хв). На першому етапі хроматографії збирали фракції об'ємом 50 мл, а в подальшому — 25 мл.

Вихід речовин з колонки контролювали за вмістом сухого залишку після упарювання фракції за допомогою роторного випарювача "Rotadest" (Угорщина), а також за допомогою тонкошарової хроматографії (ТШХ) на пластинах "Silufol" UV 254 ("Kavallier", Чехія) з використанням систем розчинників хлороформ-ізопропанол (96:4); бензол-ефір (5:2) і етилацетат-н-гексан (2:1).

Візуалізацію плям на пластинах здійснювали шляхом обробки їх 1,5%-ним розчином 4-ПНПБ в ацетоні та концентрованим розчином аміаку. Поява плям, забарвлених в блакитний колір, свідчила про наявність трихотеценових метаболітів, характерних для Stachybotrys. Поряд з цим здійснювали також УФ-детекцію виділених сполук.

За еталонні зразки мікотоксинів слугували такі МЦТЦ, як веррукарин А, рорідин А фірми "Serva" (США), а також веррукарин J, рорідин Е і рорідин Н, виділені нами раніше з D. toxicum [6]. Точки плавлення індивідуальних кристалічних речовин визначали за Кофлером [7, 8] і представляли їх як середні з 5—6 вимірювань.

УФ-спектри індивідуальних речовин реєстрували у вигляді етанольних розчинів на спектрофотометрі "Specord" UV (Німеччина), а інфрачервоні спектри (ІЧ) — у вигляді таблеток KВr на "UR-10" (Німеччина).

Високоефективну рідинну хроматографію окремих фракцій стахіботріотоксинів проводили на хроматографі "Beckman System Gold" (США), оснащеному УФ-детектором "Bio-Rad" (США) зі змінною довжиною хвилі, з застосуванням оберненофазової аналітичної колонки "Hi-Pore" розміром 250х4,6 мм і систем метанол-вода (8:2) і метанол-вода (2:8) при довжині хвилі 263 нм і швидкості протоку 0,5 мл/хв.

¹³С-ЯМР спектри реєстрували за допомогою ЯМР-спектрометра "Jeol" FX-60 (59,797 i 15,036 MHz, CDCl3) з використанням тетраметилсилану як внутрішнього стандарту при температурі 250°С. Хімічний зсув (в мільйонних долях, м.д.) розраховували на основі отриманих відмінностей (точність ±0,005 і 0,006 м.д., відповідно). Індекс подібності (S) отриманих ЯМР-спектрів розраховували згідно Bremser et al. [9].

Для оцінки біологічної активності окремих фракцій застосовували ряд тест-систем, зокрема Kluyveromyces marxianus 724 (антифунгальна активність) та Chlorella vulgaris 62 (фітотоксична активність). При цьому використовували загальноприйнятий метод дисків [4].

Результати та їх обговорення

Основними токсичними метаболітами Stachybotrys, як свідчать літературні дані [3, 10—12, 14], є МЦТЦ такі, як сатратоксини F, G i H, рорідин Е, веррукарин J, а також триховерроїди А і В. Поряд з цим, показано, що окремі штами Stachybotrys продукують спіролактони і спіролактами [15], циклоспорин [13] та ряд інших мікотоксинів. Однак, значна частина метаболітів цього гриба все ж залишається неідентифікованою, на що вказує Jarvis [16], а роль окремих з них в розвитку стахіботріотоксикозу не до кінця визначеною.

Проаналізувавши існуючі методи виділення стахіботріотоксинів, а також досвід, накопичений в нашій лабораторії, ми застосували принципово нові підходи щодо їх ізоляції, фракціонування та очистки, зосередивши основну увагу на низькомолекулярній фракції, в якій, як вже було сказано, був виявлений швидкорухливий компонент, не характерний для метаболітів Stachybotrys.

На рис. 1 представлений одержаний нами профіль фракціонування позаклітинних метаболітів s. сhartarum 13959а, який засвідчує наявність 4-х піків вмісту речовин, позначених нами як А, В, С і d, відповідно. При цьому, як видно з кривої зміни біологічної активності досліджуваних фракцій, пік А, представлений слабополярними речовинами, мав досить значну як антифунгальну, так і фітотоксичну дію. Значно нижча активність була властивою для більш полярних метаболітів, зосереджених в піках В, С і d. При цьому важливо зазначити, що вихідний бруто-препарат не проявляв цих активностей, що може свідчити про очистку та концентрування активних компонентів. Так, за допомогою ТШХ (рис. 2) у фракціях 1—5 (пік А) було виявлено 5 компонентів, які за значеннями rf в системі етилацетат-н-гексан (2:1) розподілялись в ряд: 0,95; 0,92; 0,82; 0,74; 0,60. При цьому лише компонент з rf 0,95 давав з 4р-(нітробензил)піридином нехарактерне коричневе забарвлення, в той час як всі інші засвідчували їх трихотеценову природу. Великі зони затримки росту тест-культури на біоавтограмі також відповідали розташуванню саме цих плям.

Відомо, що представники родів Dendrodochium, Myrothecium i Stachybotrys утворюють ряд спільних метаболітів, зокрема веррукарин J і рорідин Е. Однак в числі компонентів фракцій 1—5 цих токсинів не було виявлено. Контрольна ж хроматограма з іншими МЦТЦ, таким як веррукарин А, рорідин А і рорідин Н, вказувала на можливу ідентичність компонента з Rf 0,92 з останнім. Це припущення підтверджувалось також даними хроматографічної рухливості цих речовин в трьох різних системах розчинників.

Наступна високоефективна рідинна хроматографія об'єднаних фракцій 1—5 виявила три піки виходу речовин, позначених нами як 1а, 2а і 3а (рис. 3). При цьому було показано, що час утримання на колонці компонента 2а і рорідину Н співпадають, що також було додатковим свідченням їх ідентичності.

Цей факт вельми цікавий, з огляду на те, що досі рорідин Н не значився в переліку метаболітів, утворюваних представниками Stachybotrys. В намаганні остаточно визначитись щодо цього нами була проведена серія додаткових досліджень.

Перш за все був напрацьований в достатній кількості компонент 2а і здійснена його кристалізація з суміші н-гексан-діетиловий ефір (32,3 мг). Визначення температури плавлення компонента 2а за Кефлером засвідчило відсутність фіксованого показника, оскільки речовина розкладалась без плавлення при температурі, що перевищувала 325°С, що є також характерним для рорідину Н [6]. Подальші порівняльні дослідження деяких спектральних характеристик компонента 2а і рорідину Н, таких як УФ-, ІЧ-, 13С-ЯМР-спектри, наведені в табл. 1 і 2, повністю переконують в ідентичності цих речовин. Так, максимум поглинання в області 260—263 нм обумовлений присутністю в макролідній частині МЦТЦ a,b,g,d-ненасиченого естерифікованого угрупування, яке є характерним для всіх досліджених макроциклічних трихотеценів.

Аналіз ІЧ-спектрів (табл. 1) досліджуваних компонентів засвідчує наявність спільних смуг поглинання обох речовин при 3590 (ОН), 1710 (С=О), 1645 (С=С) см^-1, які також є характерними для МЦТЦ. ¹³С-ЯМР дані засвідчують також присутність в обох компонентах кон'югованих ефірних карбонілів (166,1 і 165,9 м.д.) та ацетильованого атому вуглецю (101,1 м.д.). Наведені структурні особливості компонента 2а вказують на його ідентичність рорідину Н. Остаточно в цьому переконують саме дані ¹³С-ЯМР (табл. 2). Таким чином, нами вперше з s. сhartarum 13959a виділений і охарактеризований за фізико-хімічними та спектральними параметрами рорідин Н, який проявляє сильні дерматоцидні, цитотоксичні та антибіотичні властивості. Поряд з цим, рорідин Н є токсичним для теплокровних. Слід сподіватись на його істотний внесок в розвиток стахіботрітоксикозу.

Інші виявлені нами метаболіти трихотеценової природи вимагають подальших досліджень.

Досі рорідин Н, емпірична формула якого наведена на рис. 4, вважався метаболітом, характерним для представників родів dendrodochium i myrothecium [6, 17].

Література
1. Губен-Вейль. Методы органической химии. —М.: Госхимиздат, 1963. —1032 с.
2. Зайченко А.М. Биосинтез дендродохинов микроскопическими грибами: Автореф.дис. … д-ра биол. наук: 03.00.07. —Киев, 1989. —47 с.
3. Зайченко А.М., Рубежняк И.Г. Химическая природа дендродохинов // Мікробіол. журн. —1999. —Т. 61, №1. —С. 46—59.
4. Зайченко О.М., Менджул М.І., Лисенко Т.Г. та ін. Використання ціанобактерій для індикації токсичної дії стахіботріотоксинів // Мікробіол. журн. —2002. —Т. 64, №4. —С. 31—39.
5. Лазуревский Г.В., Терентьев И.В., Шамшурин А.А. Практические работы по химии природных соединений. —М.: Высшая школа, 1966. —335 с.
6. Методы экспериментальной микологии / Под ред. Билай В.И. —Киев: Наук. Думка, 1982. —550 с.
7. Смірнов В.В., Зайченко О.М., Андрієнко О.В. Біологічно активні метаболіти грибів роду Stachybotrys Corda // Совр. проблемы токсикологии. —2002. —№3. —С. 15—24.
8. Ayer W.A., Miao S. Secondary metabolites of the aspen fungus Stachybotrys cylindrospora // Can. J. Chem. —1993. —№71. —P. 487—493.
9. Bata A., Harrach B., Vanyi A., Lepom P. Macrocyclic trichothecene toxins produced by Stachybotrys atra // Acta Vet. Hung. —1988. —V. 36, №3-4. —P. 221—227.
10. Bohner B., Fetz E., Harri E. Verrucarins and roridins. VIII. Uber die isolierung von verrucarin H, verrucarin J, roridin D und roridin E aus Myrothecium-arten // Helv. Chim. Acta. —1965. —V. 48, №5. —S. 1079—1097.
11. Bremser W., Klier M., Meyer E. Mutual assignment of subspectra and substructures structure elucidation by 13C-NMR spectroscopy // Organic Magnetic Resonance. —1975. —V. 7, №1. —P. 97—105.
12. Eppley R.M. Chemistry of stachybotryotoxicosis // Mycotoxins in human and animal health. —Park Forest South: Pathotox. Publishers, 1977. —P. 285—293.
13. Harrach B., Bata A., Bajmocy E. et al. Isolation of satratoxins from the bedding straw of a sheep flock with fatal stachybotryotoxicosis // Appl. Environ. Microbiol. —1983. —V. 45, №5. —P. 1419—1422.
14. Jarvis B.B., Stahly G.P., Pavanasasivam G., Midiwo J.O., DeSilva T., Holmlund C.E., Mazzola E.P., Geoghegan R.F. Isolation and Characterization of the trichoverroids and new roridins and verrucarins // J. Org. Chem. —1982. —V. 47, №11. —P. 1117—1124.
15. Jarvis B.B. Macrocyclic trichothecenes // Mycotoxins and Phytoalexins [Eds. Sharma R.P., Salunkhe D.K.]. —Boca Raton, Florida: CRC Press, 1991. —P. 361—421.
16. Sakamoto K., Eisaku T., Miyauchi M., Nakanishi T. et al. FR901459, a novel immunosuppresant isolated from Stachybotrys chartarum No. 19392. Taxonomy of the producing organism, fermentation, isolation, physico-chemical properties and biological activities // J. Antibiotics. —1993. —V. 46, №12. —P. 1788—1798.
17. Takitani S., Asabe T., Kato M., Suzuki M., Ueno Y. Spectrodensitometric determination of trichothecene mycotoxins with 4-(p-nitrobenzyl)pyridine on silica gel thin layer chromatograms // J. Chromatogr. —1979. —V. 175, №3. —P. 335—342.

| Зміст |