УДК [611.832:615.065]-616-092.9

МОРФОМЕТРИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА МІЄЛІНОВИХ НЕРВОВИХ ВОЛОКОН ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ ВІНКРИСТИН-ІНДУКОВАНІЙ ПЕРИФЕРІЙНІЙ НЕЙРОПАТІЇ

С.Б. Геращенко, к.м.н.

Івано-Франківська державна медична академія, Україна

Вінкристин (ВК) — препарат, який широко використовується в онкологічній клініці для лікування гострого лейкозу, лімфогранульоматозу і неходжкінських лімфом, нейробластоми, пухлини Вільямса, саркоми Юінга, сарком м'яких тканин, меланоми та інших пухлин [1]. Нейротоксичність є фактором, який частіше від інших побічних ефектів лімітує збільшення сумарної дози препарату. Ураження нервової системи проявляється парaстезіями, невралгічними болями, атаксією, арефлексією, випадінням глибоких сухожильних рефлексів, звисанням стопи, м'язовою слабістю [2]. Незважаючи на постійний інтерес дослідників до проблеми ВК-індукованих ятрогенних периферійних нейропатій та численні роботи, присвячені вивченню різних аспектів їх морфології, пато- і морфогенезу [3–7], механізми нейротоксичності цього препарату залишаються недостатньо зрозумілими [8]. У зв'язку з цим метою даного дослідження було вивчення характеру змін компонентів мієлінових нервових волокон (МНВ) у динаміці формування експериментальної ВК-індукованої периферійної нейропатії за допомогою методів комп'ютерного морфометричного аналізу.

Матеріали і методи дослідження

Об'єктом дослідження були сідничні нерви (СН) 27 білих нелінійних щурів масою 200-220 г, яким протягом 2 тижнів щоденно (понеділок-п'ятниця) довенно вводили вінкристин (Vincristinum sulfuricum, виробництво Гедеон Ріхтер, Угорщина), розчинений в ізотонічному розчині NaCl, у дозі 100,0 мкг/кг маси тіла — всього 10 ін'єкцій, сумарна доза 1000,0 мкг/кг [6]. Матеріал забирали на 3, 7, 21 доби після останнього введення ВК. В якості контролю служили СН 15 щурів, яким довенно вводили еквівалентну кількість розчинника. Утримання та маніпуляції з тваринами проводились у відповідності до положень "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах", ухвалених Першим національним конгресом з біоетики (Київ, 2001). Препарати дослідних та контрольних тварин готували однотипно — матеріал фіксували в 1 % розчині OsO₄ на 0,1 М какодилатному буфері (рН 7,4) протягом 2 год. Відмивання, дегідратацію та заливку шматочків нервів у суміш епону-812 з аралдитом проводили згідно загальноприйнятих правил. Поперечні зрізи нервів товщиною 1 мкм, забарвлені толуїдиновим синім, вивчали на світлооптичному рівні за допомогою аналізатора зображень на базі програмного забезпечення UTHSCSA Image Tool^® for Windows^® (version 2.00). Визначались показники площі МНВ (Sв) та осьового циліндра (Sа), периметри МНВ (Pв) та аксона (Ра), коефіцієнти форми нервового волокна

Cв = 4pSв / Рв²

та аксона

Ca = 4pSa / Pa²,

площі мієлінової оболонки (Sм = Sз — Sв, де Sз і Sв — площі фігур, обмежених зовнішньою і внутрішньою поверхнями мієлінової оболонки). Отримані результати обробляли методами параметричної статистики в системі Statistica. Результати вимірювань вказаних параметрів у контрольних та інтактних тварин не виявили статистично достовірних відмінностей, що співпадає з даними авторів використаної експериментальної моделі [6].

Результати та їх обговорення

На поперечних зрізах СН на 3 і 7 доби виявляються однотипні зміни, які проявляються набуханням осьових циліндрів волокон різного діаметра та набряком мієлінової оболонки окремих із них. На 7 добу, поряд із втягненням у патологічний процес значно більшої кількості МНВ, виявляються чіткі відмінності в ступені пошкодження між пучками, що формують СН. За рахунок цього ураження набуває мозаїчного характеру. На 21 добу характер патоморфологічних змін МНВ змінюється. Окремі пучки представлені переважно волокнами дрібного і середнього калібру зі зморщеними або деформованими осьовими циліндрами. В інших домінують МНВ великого діаметра з набряклою аксоплазмою. Рідше зустрічаються пучки, в яких поєднуються вказані патологічні зміни. Пошкодження мієлінової оболонки носить поверхневий характер і проявляється переважно набряком.

Морфометричний аналіз мієлоархітектоніки СН на 3 добу після завершення введення ВК вказує на зміну характеру розподілу МНВ за величиною показника площі волокна. Відбувається достовірне зниження відсотка волокон з площею поперечного перерізу, що не перевищує 40,0 мкм², від 65,4 % до 45,0 %. При цьому особливо помітне перекалібрування дуже дрібних волокон площею до 20,0 мкм² — МНВ вказаної субпопуляції складають у тварин цієї групи 9,19±0,08 % (у контролі — 21,44±0,96, р<0,05). Незначно зростає число волокон середнього діаметра (40,0–80,0 мкм²) — від 32,2 % до 35,9 %, та збільшується відсоток волокон великого діаметра з площею поперечного перерізу понад 80,0 мкм² — з 2,4 % до 19,1 %. З'являються МНВ дуже великого діаметра, в яких значення показника Sв перевищують 120,0 мкм² (рис. 1). На 7 добу характер розподілу МНВ за величиною показника площі волокна змінюється і наближається до бімодального за рахунок зростання, порівняно з попереднім терміном, кількості волокон площею до 20,0 мкм² (14,51±0,41 %, р<0,05), прогресуючим зниженням відносної кількості МНВ, які належать до метричних груп 20,0-40,0 мкм² та 40,0-60,0 мкм², відсоток яких складає, відповідно, 31,16±0,42 і 21,21±0,16 (на 3 добу — 35,82±0,03 % та 25,96±0,17 %, р<0,05). Частка волокон площею до 60,0 мкм² залишається достовірно меншою, ніж у СН контрольних тварин. Кількість волокон середнього діаметра наближається до показників контролю, тенденція до зростання числа волокон великого діаметра зберігається — МНВ площею понад 80,0 мкм² складають 24,0 % їх загальної кількості. На 21 добу спостерігається збільшення кількості дуже дрібних волокон. Частка МНВ цієї субпопуляції наближається до показників контролю і становить 21,2±0,03 % (на 7 добу — 14,5±0,41 %, р<0,05). Число волокон, які належать до метричної групи 20,0-60,0 мкм², зростає незначно. Відносна кількість волокон площею понад 80,0 мкм² знижується майже вдвічі і становить 12,7 % загальної кількості МНВ.

При аналізі змін величини показника площі осьових циліндрів МНВ (рис. 2) виявляється подібна динаміка — на 3 добу після завершення введення ВК відбувається зниження до 60,0 % частки осьових циліндрів площею поперечного перерізу до 20,0 мкм² (у контролі — 84,2 %). Одночасно зростає кількість осьових циліндрів, значення показника sа яких знаходиться в метричному інтервалі 20-40 мкм² та перевищує 40,0 мкм², і становить, відповідно, 26,0 % та 14,1 % (у контролі — 15,3 % та 0,5 %). Привертає увагу поява численної субпопуляції волокон з осьовими циліндрами площею понад 50,0 мкм², частка яких становить 6,4 %. На 7 добу кількість волокон із тонкими осьовими циліндрами площею до 10,0 мкм² зростає порівняно з попереднім терміном з 22,76±0,08 % до 35,07±0,01 % (р<0,05). Частка волокон, які належать до метричних груп 10,0-20,0 мкм² та 20,0-40,0 мкм², навпаки, зменшується, і становить, відповідно, 24,32±0,21 % та15,09±0,03 % (на 3 добу — 37,19±0,2 4% і 18,32±0,001 %, р<0,05). Відносна кількість волокон з осьовими циліндрами площею понад 40,0 мкм² зростає порівняно з попереднім терміном від 21,8 % до 25,5 %. На 21 добу тенденція до збільшення відносної кількості волокон з осьовими циліндрами площею до 20,0 мкм² продовжує зберігатись — їх частка зростає від 59,4 % у попередній термін до 75,1 %, хоча залишається меншою, ніж у контрольних тварин (84,2 %). Таке перекалібрування відбувається за рахунок зниження кількості волокон з аксонами як середнього, так і великого діаметра.

Співставлення динаміки зміни показників площ МНВ та осьових циліндрів вказує на високий ступінь позитивної кореляції між ними і описується, відповідно, формулами: Sа=-2,8+0,5Sв (3 доба), Sа=-3,6+0,5Sв (7 доба), Sа=-2,6+0,4Sв (21 доба). Значення коефіцієнту кореляції становлять, відповідно, 0,97; 0,97 та 0,95.

Дослідження кореляційних співвідношень між показниками площ осьового циліндра і мієлінової оболонки, яка його оточує, вказує на тісний взаємозв'язок між ними — зростання площі поперечного перерізу аксона супроводжується збільшенням площі мієлінової оболонки (рис. 3). Характер цих співвідношень описується, відповідно, формулами: в контролі — sм=8,6+1,2sа (коефіцієнт кореляції r=0,86), на 3 добу — sм=8,9+1,1sа (r=0,90), на 7 добу — sм=10,5+1,1sа (r=0,90), на 21 добу — sм=10,2+1,2sа (r=0,84). На 3 добу після завершення введення ВК осьові циліндри площею 10,0-30,0 мкм² оточуються мієліновою оболонкою, площа якої достовірно нижча від показників контролю (табл. 1). Це свідчить про те, що набухання осьових циліндрів малого і, частково, середнього діаметра не супроводжується вираженими змінами мієлінової оболонки. У МНВ з осьовими циліндрами площею понад 30,0 мкм² спостерігається достовірне зростання площі мієлінової оболонки, зумовлене її набуханням. На 3 і 7 доби набряк мієлінової оболонки розвивається в більшості МНВ.

Важливе значення для розуміння характеру патологічних змін МНВ має аналіз динаміки величини значень коефіцієнту форми осьового циліндра. На 3 добу осьові циліндри площею до 10,0 мкм² деформуються, площею 10,0-20,0 мкм² не зазнають суттєвих змін. Значна частина осьових циліндрів більшого діаметру набуває форми, яка наближається до округлої, внаслідок набряку аксоплазми (табл. 2). На 7 добу вказані тенденції продовжують зберігатися. На 21 добу коефіцієнт форми осьових циліндрів усіх метричних груп зменшується порівняно з попереднім терміном. Особливо вираженої деформації зазнають осьові циліндри площею до 20,0 мкм².

Отримані результати свідчать про те, що головним фактором, який зумовлює зміну характеру мієлоархітектоніки СН у динаміці розвитку ВК-індукованої периферійної нейропатії, є ураження осьових циліндрів. Це узгоджується з традиційними поглядами на морфогенез ятрогенної нейропатії, викликаної ВК [3—5]. Однак, слід погодитись із деякими авторами [9], які в дослідах на кролях, вводячи ВК у сумарній дозі 500,0-750,0 мкг/кг, виявили ураження шваннівських клітин, яке спостерігалось протягом 3 міс після припинення введення препарату.

Аналізуючи динаміку змін морфометричних характеристик компонентів МНВ СН після заверешення ведення ВК (табл. 3), слід вказати на найбільш виражені зміни середніх значень метричних співвідношень між площами волокон, осьових циліндрів та мієлінової оболонки на 3-7 доби. На 21 добу показники sв та sа наближаються до контрольних, однак відбувається це на фоні деформації МНВ. Явища набряку аксоплазми спостерігаються лише у волокнах площею понад 100,0 мкм². З'являються численні популяції МНВ різного діаметру з метричними показниками, які в контролі не визначаються (рис. 4).

Підсумовуючи результати морфометричного дослідження змін мієлоархітектоніки СН, які виникають під впливом вінкристину, слід зазначити, що на 21 добу після останнього введення препарату в периферійному нерві виникає патологічний стан, який характеризується появою численних популяцій МНВ з порушеними метричними характеристиками волокон, їх компонентів — осьових циліндрів, мієлінової оболонки, та їх співвідношеннями. Співставляючи отримані дані з результатами інших дослідників, які використовували схожі методичні підходи [10—12], можна стверджувати, що на 21 добу завершується формування ВК-індукованої периферійної нейропатії, яка виникає внаслідок зриву компенсаторно-пристосувальних можливостей нейрона. Особливо виражені зміни спостерігаються в МНВ великого діаметра. Вони проявляються набуханням аксоплазми і мієлінової оболонки, що узгоджується з даними попередніх досліджень [4]. Одночасно нами виявлено феномен атрофії волокон дрібного та середнього калібру, в основі якого лежить зморщення осьового циліндра, що спростовує думку про низьку чутливість МНВ цього класу до дії ВК. У наших експериментах не спостерігалось вираженого набряку ендоневральної сполучної тканини, тому ми не поділяємо думки названих авторів про суттєве значення порушень ендоневральної мікроциркуляції в патогенезі ВК-індукованої периферійної нейропатії. Однак високий ступінь позитивної кореляції між площами осьового циліндра та мієлінової оболонки підтверджує висновок цих дослідників про цитотоксичний характер вказаних змін. При цьому динаміка розвитку ВК-індукованої нейропатії вказує на важливий компенсаторний характер перерозподілу рідини між аксоплазмою та цитоплазмою нейролеммоцита, який дозволяє досить тривалий час (у наших дослідах — до трьох тижнів після припинення введення ВК) забезпечити відносну морфологічну цілісність і попередити атрофію осьових циліндрів. В основі виникнення порушень структурно-функціональної організації МНВ під впливом ВК можуть лежати процеси порушення антероградного і ретроградного аксонного транспорту, зумовлені дезорганізацією та порушенням орієнтації мікротрубочок осьового циліндра [4, 5].

Таким чином, периферійна нейропатія, викликана тривалим систематичним введенням вінкристину в сумарній дозі 1000 мкг/кг, характеризується прогресуючою дезорганізацією мієлінових нервових волокон. Провідним морфологічним проявом уражень МНВ є набухання аксоплазми осьових циліндрів волокон різного діаметру, яке поєднується із набряком мієлінової оболонки. Період відносної компенсації тривалістю до трьох тижнів поступово змінюється фазою декомпенсації, при якій частина осьових циліндрів зморщується і деформується.

Література
1. Булкина З.П. Противоопухолевые препараты: Справочник / Отв. ред. Пинчук В.Г. —Киев: Наук. думка, 1991. —304 с.
2. Блохин Н.Н., Переводчикова Н.И. Химиотерапия опухолевых заболеваний. М.: Медицина, 1984. —304 с.
3. Ogawa T., Mimura Y., Kato H., Ootsubo S., Murakoshi M. The usefulness of rabbits as an animal model for the neuropathological assessment of neurotoxicity following the administration of vincristine // Neurotoxicology. —2000. —V. 21, №4. —P. 501-511.
4. Topp K.S., Tanner K.D., Levine J.D. Damage to the cytoskeleton of large diameter sensory neurons and myelinated axons in vincristine-induced painful peripheral neuropathy in the rat // J. Comp. Neurol. —2000. —V. 424, №4. —P. 563-576.
5. Tanner K.D., Levine J.D., Topp K.S. Microtubule disorientation and axonal swelling in unmyelinated sensory axons during vincristine-induced painful neuropathy in rat // J. Comp. Neurol. —1998. —V. 395, №4. —P. 481-492.
6. Aley K.O., Reichling D.B., Levine J.D. Vincristine hyperalgesia in the rat: a model of painful vincristine neuropathy in humans // Neuroscience. —1996. —V. 73, №1. —Р. 259-265.
7. Fiori M.G., Schiavinato A., Lini E., Nunzi M.G. Peripheral neuropathy induced by intravenous administration of vincristine sulfate in the rabbit —an ultrastructural -study // Toxicologic pathology. —1995. —V. 23, №3. —P. 248-255.
8. Lipp H.-P. Prevention and management of anticancer drug toxicity. The significance of clinical pharmacokinetics. Jena: Univ.-Verl., 1995. —130 p.
9. Dambska M., Muzylak M., Maslinska D. The features of peripheral nerve lesions in young and adult rabbits after vincristine administration // Folia Neuropathol. —1995. —V. 33, №1. —P. 21-24.
10. Bardosi A., Friede R.L., Ropte S., Goebel H.H. A morphometric study on sural nerves in metachromatic leucodystrophy // Brain. —1987. —V. 110, Part 3. —P. 683-694.
11. Мuller H., Shibib K., Modrack M., Friedrich H. Nerve regeneration in synthetic and autogenous interfascicular grafts. II. Morphometric analysis // Experimental Neurology. —1987. —V. 98, №1. —P. 161-169.
12. Pfeiffer G., Friede R.L. A morphometric study of nerve fiber atrophy in rat spinal roots // J. Neuropath. Exp. Neurol. —1985. —V. 44, №6. —P. 546-558.