ОБОСНОВАНИЕ ГЕПАТОПРОТЕКТЕРНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТА БИОМЕЛАН В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Г.А. Сайфетдинова, А.М. Шаяхметова, к.б.н., В.Н. Коваленко, д.б.н., Е.С. Волошина, к.б.н., А.К. Воронина, к.б.н.

Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, г. Киев

Одним из осложнений современной фармакотерапии являются лекарственные поражения печени. Насчитывается более 1000 фармакологических средств, способных оказывать повреждающее действие на печень, среди них более 200 являются потенциально гепатотоксичными веществами. Именно к таким препаратам относится широко применяемый аналгетик и антипиретик — парацетамол. Его гепатотоксичность обусловлена образованием свободных радикалов и реактивных метаболитов электрофильной природы. Основной метаболит парацетамола — N-ацетил-п-бензохинонимин — способен ковалентно связываться с важнейшими макромолекулами гепатоцитов и вызывать центролобулярную некротизацию печени [1]. Не только передозировка парацетамола, но и длительное применение его в терапевтических дозах, особенно при наличии сопутствующих заболеваний (диабет, гепатиты, алкоголизм), несбалансированности питания, контакте с органическими растворителями, вызывает острое токсическое поражение печени [2].

В качестве антидотов при отравлении парацетамолом широко используют метионин и N-ацетилцистеин, но их недостатком является реализация детоксицирующего эффекта только в пределах второй фазы детоксикации. В связи с этим в последнее время предпринимаются попытки найти дополнительные средства детоксикации парацетамола, обладающих полифункциональными свойствами. Довольно широкий спектр биологической активности присущ природным клеточным пигментам — меланинам [3].

Нами проведено экспериментальное изучение некоторых биохимических показателей при остром отравлении парацетамолом в условиях использования нового оригинального препарата биомелан, разработанного ОАО "Фармак". Биомелан относится к классу меланинов — соединений полимерной природы с большой молекулярной массой. Создан биомелан на основе микомеланина Cladosporium cladosporioides. Препарат представляет собой порошок темно-коричневого цвета, без запаха, практически нерастворимый в воде, обладает свойствами сорбента.

Эксперименты проводили на крысах-самцах линии Вистар массой тела 190-260 г, которых содержали в условиях вивария на стандартном пищевом рационе и свободном доступе к воде. Длительность опыта составляла 12 суток. Животные были разделены на пять групп: 1 — интактная; крысам 2-5 групп на протяжении 2 сут внутрижелудочно вводили парацетамол в дозе 1,25 мг/кг массы тела в виде взвеси в 2 % крахмальном геле [4]; 2-я группа служила отрицательным контролем; животным 3-й, 4-й и 5-й групп в лечебно-профилактическом режиме (10 сут до и параллельно с затравкой) внутрижелудочно с помощью зонда вводили, соответственно, биомелан в виде водной суспензии из расчета 10 мг/кг и препараты сравнения: метионин производства АТ "Киевский витаминный завод", 25 мг/кг массы тела и полисорб производства МНТК "Хімія поверхні" НАНУ в дозе 50 мг/кг.

Через 24 ч после последнего введения препаратов животных декапитировали под легким эфирным наркозом. Печень перфузировали охлажденным раствором KCl и гомогенизировали в 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 7,4. Постмитохондриальную фракцию печени получали общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Все процедуры выполняли при температуре +4°С. Состояние монооксигеназной системы печени оценивали по содержанию цитохромов P-450 и b₅ в постмитохондриальной фракции согласно методу [5].

В гомогенате печени определяли содержание белковых SH-групп с помощью реактива Эллмана [6] и активность каталазы [7]. В сыворотке крови определяли содержание холестерина [8] и активность аланинаминотрансферазы с помощью биотестов НПП "Филист диагностика" (Украина). Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Excel. Достоверность полученных данных оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

Парацетамол в организме метаболизирует при участии цитохром Р-450-зависимых ферментов [9]. Результаты наших исследований, характеризующие состояние монооксигеназной системы, свидетельствуют, что при остром отравлении парацетамолом содержание цитохрома Р-450 в постмитохондриальной фракции печени крыс снижалось почти вдвое по сравнению с интактной группой (рисунок). Подобное уменьшение содержания этого важнейшего компонента первой фазы детоксикации может происходить за счет активации свободнорадикальных процессов и изменения структуры липидного микроокружения, способных влиять на биосинтез НАДФН-цитохром-Р450-редуктазы и самого цитохрома Р-450 на уровне транскрипции, трансляции или встраивания в мембрану. Кроме того, причиной этого может быть ковалентное взаимодействие реактивного метаболита парацетамола с цитохромом Р-450, сопровождающееся изменением его конформации [10]. Аналогичные результаты были получены и при исследовании уровня содержания цитохрома b₅ в постмитохондриальной фракции печени отравленных животных (рисунок).

Лечебно-профилактическое введение биомелана и полисорба способствовало сохранению содержания цитохромов Р-450 и b₅ на уровне интактных животных. Метионин в данном случае не оказывал нормализующего влияния на эти показатели, что свидетельствует о целесообразности применения в токсикогенной стадии острого отравления парацетамолом веществ, обладающих сорбционными свойствами.

Отравление парацетамолом приводило к снижению содержания SH-групп белков в гомогенате печени на 31 %, что может быть связано с непосредственным их химическим взаимодействием с N-ацетил-р-бензохинонимином (таблицa). При применении биомелана данный показатель сохранялся практически на уровне интактных животных, что, возможно, обусловлено способностью исследуемого препарата обезвреживать токсичные метаболиты парацетамола, предотвращая тем самым их ковалентное взаимодействие с sh-группами белков. Эффективность биомелана в данном случае была сопоставима с таковой полисорба.

Учитывая, что развитие токсических гепатитов зачастую сопровождается нарушением липидного обмена, нами исследовано содержание общего холестерола в сыворотке крови и влияние на этот показатель лечебно-профилактического введения препарата биомелан. Отмечено, что уровень общего холестерола сыворотки крови отравленных парацетамолом животных был на 19 % ниже по сравнению с интактными крысами (таблицa). Применение биомелана способствовало его повышению на 34 %, тогда как при применении полисорба и метионина нормализация данного показателя по сравнению с контролем отмечалась в меньшей степени — на 29 % и 15 % соответственно.

Согласно данных таблицы, введение крысам высоких доз парацетамола сопровождалось снижением каталазной активности гомогената печени на 14 %, что может происходить вследствие дестабилизации плазматических и пероксисомных мембран гепатоцитов, где сосредоточено основное количество фермента [11]. При введении животным биомелана активность каталазы возрастала на 42 % по сравнению с отрицательным контролем. Полисорб оказывал менее выраженное действие на этот показатель (увеличение составило 32 % относительно контроля). При этом, в группе животных, которым вводили метионин, была выявлена тенденция к дальнейшему снижению активности каталазы.

Через 24 ч после внутрижелудочного введения крысам парацетамола активность маркерных ферментов повреждения паренхимы печени АлАТ и АсАТ в сыворотке крови увеличивалась по сравнению с данными показателями интактных животных в 2,5 и 1,7 раза соответственно (таблица). Это можно рассматривать как результат мембранодеструктивного действия реактивных метаболитов парацетамола, в том числе и свободнорадикальной природы [8]. В группе крыс, которые получали биомелан, активность аминотрансфераз в сыворотке крови сохранялась на уровне интактных животных, что свидетельствует о высоких гепатопротекторных свойствах исследуемого препарата. Метионин в этом плане оказался не эффективен.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что лечебно-профилактическое применение нового оригинального препарата биомелан при остром поражении печени парацетамолом способствует значительному ослаблению токсического действия аналгетика, усиливая детоксицирующую функцию печени путем сохранения уровня содержания основных компонентов монооксигеназной системы — цитохромов Р-450 и b₅. Применение биомелана позволяет предупредить структурные нарушения жизненноважных белковых молекул гепатоцитов, препятствуя связыванию электрофильных метаболитов парацетамола со свободными SH-группами протеинов, оказывает протекторное действие в отношении активности важнейшего ферментативного антиоксиданта — каталазы, корригирует нарушения липидного обмена и ограничивает проявления гепатоцитолиза. Эффективность биомелана по ряду показателей превосходит действие полисорба и метионина, что, возможно, обусловлено наличием у него, наряду с сорбционными свойствами, антирадикальной и антиоксидантной активности, характерной для меланинов [12]. Полученные нами данные позволяют сделать вывод о том, что биомелан является эффективным средством антидотной терапии при отравлении парацетамолом.

Литература
1. Cohen S.D., Hoivik D.J., Khairallah E.A. Acetaminophen induced hepatotoxicity /Toxicology of the Liver. —Raven Press, New York, 1998. —Р. 159-186.
2. Lieber C.S. Cytochrome P-4502E1: its physiological and pathological role. //Physiological reviews. —1997. —V.77, N 2. —P. 518-544.
3. Запрометов М.Н. Биохимия фенольных соединений. —М.: Наука, 1993. —272 с.
4. Методические рекомендации по экспериментальному изучению желчегонной, холеспазмолитической, холелитиазной и гепатопротекторной активности новых лекарственных средств / Дроговоз С.М., Сальникова С.И., Скакун Н.П., Слышков В.В. —Киев: ФКМЗ Украины, 1994. —46 с.
5. Omura T., Sato R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature //J.Biol.Chem. —1964. —V. 239. —P. 2370-2378.
6. Sedlak J., Lindsay R. Estimation of total, protein-bound and nonprotein sulfhydryl gpoups in tissue with Ellmanўs reagent //Analit. Biochem. —1968. —25, N 1. —P. 192-205.
7. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Определение активности каталазы. //Лабораторное дело. —1988. —№ 1. —С. 16-19.
8. Колб В.Г., Камышников В.С. Клиническая биохимия. —Минск: Беларусь, 1976. —312 с.
9. Zaher H., Buters J.T.M., Ward J.M. et al. Protection aganist acetaminophen toxicity in CYP1A2 and CYP2E1 double-null mice //Toxicol. and Appl. Pharmacol. —1998. —V. 153. —P. 119-132.
10. Thomsen M.S. Oxidative metabolism of acetaminophen (paracetamol) to a reactive species: Involved cytochrome P-450 enzymes and target toxicity related to covalent binding //Ugeskr. Laeger. —1996. —V. 158, N 28. —P. 4095-4096.
11. Гонский Я.И., Корда М.М., Клищ И.Н., Фира Л.С. Роль антиоксидантной системы в патогенезе токсического гепатита //Пат. физиол. и эксперим. терапия. —1996. —№ 2. —С. 43-45.
12. Борщевская М. И., Васильева С.М. Развитие представлений о биохимии и фармакологии меланиновых пигментов //Вопр. мед. химии —1999. —Т. 45, № 1. —С. 13-24.

| Зміст |