УДК 615.9 + 615.099 + 547.546 + 591.18

ПАТОМОРФОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ГОЛОВНОГО МОЗКУ БІЛИХ ЩУРІВ ПРИ ІНТОКСИКАЦІЇ НІТРОБЕНЗОЛОМ В ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД СТУПЕНЯ РОЗВИТКУ ГЕМІЧНОЇ ГІПОКСІЇ

Л.В. Степанова, Л.П. Широбокова, А.В. Матвієнко, к.м.н., В.В. Храпак, д.м.н.

Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ

Нітробензол відноситься до сильнодіючих отруйних речовин (СДОР) [9]. Можливість гострого та хронічного отруєння ним обумовлюється широким використанням у різних галузях промисловості [3, 8, 13, 14]. Обмежені можливості по технічному та фармакологічному захисту населення у випадку хімічних катастроф, що можуть бути викликані цією отрутою, свідчать про необхідність поглибленого вивчення впливу нітробензолу на організм для розробки ефективних схем профілактики.

Нітробензолу [HБ] притаманні висока токсичність, політропна дія, здатність проникнення в організм через неушкоджену шкіру та кумуляція в підшкірній жировій клітковині та паренхіматозних органах [12].

Гострі отруєння нітробензолом у патогенетичному відношенні представляють недостатньо вивчений варіант гемічної форми гіпоксії. Ряд експериментальних та клінічних досліджень свідчить, що однією з основних мішеней НБ є центральна нервова система [11]. В науковій літературі ми не знайшли даних, які характеризують глибину та характер нейротоксичних ефектів в залежності від ступеня гемічної гіпоксії (метгемоглобінемії), викликаної гострим отруєнням НБ, що і булометою наших досліджень.

Матеріали та методи дослідження

Експерименти проведені на статевозрілих щурах, масою 180—230 г, що пройшли карантин на протязі 2 тиж і утримувались на стандартному харчовому раціоні та питному режимі віварію. НБ тваринам уводили внутрішньошлунково, одноразово у вигляді водного розчину з додаванням емульгатору — Твін 85, за допомогою металевого зонду у дозі 682 мг/кг маси тіла (ЛД₅₀). Контролем слугувала група тварин, яким в/ш уводили відповідну кількість дистильованої води.

Для визначення токсичності НБ використовували методику [7].

Ступінь важкості гемічної гіпоксії оцінювали за вмістом метгемоглобіну (MtHb), гемоглобіну (Hb) в крові, враховували клінічний стан тварин. Відбір крові проводили через 1, 3, 5 год; 1, 2, 5, 7 діб після отруєння. Морфологічному та гістохімічному дослідженню піддавали головний мозок (ГМ) — неокортекс та підкоркові структури на рівні Ch.opticum. Шматочки ткані фіксували у 10 % розчині нейтрального формаліну, бромформолі. Після фіксації у формаліні ГМ проводили через спирти зростаючої концентрації і заливали в целоїдин. Для проведення загальногістологічних досліджень зрізи ГМ забарвлювали гематоксилин-еозином та тіоніном за Ніслем. Заморожені зрізи мозку після фіксації в бром-формолі імпрегнували за методом Рамон і Кахаля для виявлення астро-цитарної глії (АЦГ) [5].

Для характеристики особливостей порушень окисновідновних та енергетичних процесів в залежності від ступеня гемічної гіпоксії у ГМ тварин гістохімічними методами вивчали активність цитохромоксидази (ЦХО) за Зелігманом, сукцинатдегідрогенази (СДГ) за Нахласом, лактатдегідрогенази (ЛДГ) за Гесом, Скарпелі і Пірсом [6], лужної фосфатази (ЛФ) за Гоморі. Контролем слугували кріостатні зрізи, які піддавали інкубації в робочому розчині без субстрату. Дослідження проводили через 30, 60 хв; 1, 5, 7 діб після отруєння.

Результати обробляли математично за допомогою персональної ЕОМ з визначенням критерію Ст'юдента та показників вірогідності [1].

Результати та їх обговорення

Зовнішній огляд експериментальних тварин в ранні терміни дослідження (30—60 хв) показав, що їх стан був без суттєвих відхилень від норми. Тварини були рухливі, шерсть гладенька, блискуча. Шкіра без змін, на слизових оболонках патологічних проявів не знайдено. В той же час на розтині ГМ кров, що стікала, була шоколадного кольору.

При мікроскопічному вивченні гістологічних препаратів через 30 хв після отруєння в ГМ окремих тварин спостерігались застійні прояви в артеріальних та венозних судинах, дифузна реакція АЦГ з осередками навколосудинної проліферації. Зустрічались поодинокі нейрони неокортексу у стані світлого набряку. На кріостатних зрізах ГМ гістохімічними методами виявлено осередковане послаблення активності ЦХО і СДГ (рис. 1, а, б), у одних тварин гістохімічна реакція значно пригнічувалась, тоді як у інших вона знижувалась в меншій мірі. Активність ЛДГ і ЛФ суттєво не змінювалась.

Починаючи з першої години після отруєння зафіксовано статистично вірогідне збільшення вмісту MtHb крові у порівнянні з контрольною групою тварин. Кількість утвореного MtHb відповідала легкому ступеню гіпоксії (таблиця). За даними літератури [2, 4], — 18,5 % відповідає mthb легкому ступеню гіпоксії, 35,9 % mthb — середньому ступеню, 53,4 % mthb — тяжкій гіпоксії.

Через 1—3 год після отруєння в ГМ тварин зростали прояви циркуляторних порушень, збільшувалась кількість розширених, повнокровних судин, частіше зустрічались дистрофічно змінені нейрони в неокортексі і підкоркових утвореннях мозку. В структурах мозку збільшувалась кількість осередків навколосудинної проліферації АЦГ з гіпертрофією тіл та відростків клітин (рис. 2). Активність ферментів ЦХО та СДГ, в порівнянні з попереднім терміном спостереження, осередковано знижувалась, активність ЦХО пригнічувалась в більшій мірі, ніж СДГ. Активність ЛДГ та ЛФ осередковано слабшала. Якщо в інтактних тварин продукт гістохімічної реакції ЛФ забарвлював артеріальні судини в чорний колір, то у дослідних тварин виявлялись капіляри з більш блідим забарвленням.

Через 3 год клінічні прояви отруєння зростали, колір слизових оболонок та шкіри щурів з рожевого змінювався на сіросиній. В цей період реєстрували метгемоглобінемію середнього ступеня.

Через 1 добу після отруєння розвивалась тяжка гіпоксія, вміст MtHb в крові збільшився у 14 разів порівняно з контролем (P<0,05). У ВГМ щурів, які умертвлялись у тяжкому стані, на фоні виразних застійних явищ проліферативна реакція АЦГ зростала, особливо навколо судин, збільшувалась кількість дистрофічно та деструктивно змінених нейронів в основному по типу світлого набряку (рис. 3). У тварин, що умертвлялись у задовільному стані, дистрофічні зміни та циркуляторні порушення були менш виразними. Спостерігалось різке пригнічення активності ЦХО і СДГ (рис. 1, в) та осередковане зниження активності ЛДГ і ЛФ. Якщо у інтактних тварин продукти гістохімічної реакції на ЦХО, СДГ та ЛДГ в цитоплазмі клітин спостерігались у вигляді невеликих гранул приблизно однакових за розміром і рівномірно розташованих, то у отруєних тварин гранули продуктів реакції значно коливались за розмірами (поліморфізм) або були відсутні. Слід зазначити, що реакція на ферменти умертвлених тварин була дещо вищою, ніж у загиблих, але значно коливалась. Динаміка змін активності ферментів в неокортексі та підкоркових структурах ГМ свідчила про захисно-компенсаторну реакцію на екстремальну ситуацію, що виникла в організмі.

У тварин, які загинули через 40 год, головний мозок ціанотичний, тканина його брезкла, тягнеться за ножем при розрізі.

Через 5—7 діб в ГМ тварин гемодинамічні порушення помітно слабшали, зустрічаючись на окремих ділянках підкоркових структур. Зберігалась проліферативна реакція АЦГ. В порівнянні з попередніми термінами спостережень активність СДГ зростала, не досягаючи рівня інтактних тварин. Особливо повільно відновлювалась активність ЦХО в неокортексі щурів і була осередковано пригнічена. Виходячи з цього стан дослідних тварин можна оцінити, як неадекватний нормальному рівню метаболічних процесів в нейронах кори та підкоркових структур ГМ.

Не зважаючи на те, що порушення гемодинаміки, ферментативної активності в ГМ помітно слабшали, через 5 діб все ще реєструвалась тяжка гіпоксія, у зв'язку з тим, що НБ має високий індекс зв'язування з Hb [10]. На 7 добу спостерігали зменшення кількості MtHb у крові щурів у порівнянні з попереднім терміном, але вихідного рівня вона не досягала, ступінь гіпоксії оцінювався як середній. На протязі усіх досліджень спостерігали падіння рівня Hb в крові щурів; на 7 добу реєстрували анемію (Hb ~ 6,93 г/%, P<0,05), що ймовірно свідчить про порушення еритропоезу у отруєних щурів.

Таким чином, гостре отруєння НБ (ЛД₅₀) приводить до появи морфологічних змін та порушенню активності ферментів ЦХО, СДГ, ЛДГ, ЛФ неокортексу та підкоркових структур ГМ щурів. Гемічна гіпоксія викликає складний комплекс змін у метаболізмі мозку, що супроводжується пригніченням окислювальних процесів і активацією анаеробних. Морфологічні зміни розвивались в динаміці і залежали від ступеня важкості гіпоксії. Системні механізми (дихальна функція крові, гемодинамічні, тканинні) компенсації гіпоксичного процесу, обумовленого утворенням метгемоглобіну, були достатньо ефективні при легкій гіпоксії і гіпоксії середнього ступеня важкості (вміст MtHb ~ 12-37 %), вони забезпечували нормальний рівень споживання кисню тканинами, що проявлялось у відсутності деструктивно змінених нейронів ГМ (перші години досліджень). З розвитком тяжкої гіпоксії, яка утримувалась на протязі 5 діб (з рівнем MtHb в крові 57,3—59,8 %), ефективність компенсаторних механізмів виявляється недостатньою і відбувається різке пригнічення термінального окислення в ГМ тварин, результат цього — зменшення споживання кисню мозком з наступним розвитком дистрофічних та деструктивних змін нейронів. Динаміка змін активності ферментів також співпадала з підвищенням рівня MtHb крові. Пік порушень метаболічних процесів в організмі щурів реєстрували через 24 год після отруєння, в цей же час загинула майже половина дослідних тварин.

Відновлення активності ферментів відбувалось повільно, особливо ЦХО. Отримані результати дають мажливість зробити припущення, що НБ викликає суттєві зміни в механізмах аеробного дихання нервових тканин, зокрема, шляхом безпосереднього впливу на дихальні ферменти. Особливо страждало термінальне окислення в неокортексі щурів. В свою чергу, це негативно впливало на важливі функції ЦНС (у тварин спостерігали атаксію) з наступним ймовірним розвитком незворотніх патологічних змін. Роль гемічної гіпоксії, що швидко розвивалась, в патогенезі гострої інтоксикації НБ була провідною (тварини, в більшості, гинули в перші 24 год при явищах асфіксії). Проведені дослідження дозволяють зробити висновок, що рівень метгемоглобіну та гемоглобіну крові потерпілих може слугувати індикатором важкості гострого отруєння НБ у разі хімічної катастрофи.

Література
1. Григорьев С.Г., Левандовский В.В., Перфилов А.М. и др. Пакет прикладных программ STATGRAPHICS на персональном компьютере. —Санкт-Петербург, 1992. —104 с.
2. Иваницкая Н.Ф. Методика получения разных стадий гемической гипоксии у крыс введением нитрита натрия // Патол. физиол. и экспер. терапия. —1976. —№3. —С. 69-71.
3. Казанина С.С. Морфология и гистохимия гемохориальных плацент белых крыс при интоксикации материнского организма нитробензолом // Бюллетень эксперимент биол. и медицины. —1968. —№6, Т. LXV. —С. 93-95.
4. Лановенко И.И., Миняйленко Т.Д., Середенко М.М. Системные механизмы развития и компенсации острой гемической гипоксии при экспериментальной метгемоглобинемии у собак // Патол. физиол. и экспер. терапия. —1986. —№3. —С. 50-53.
5. Меркулов Г.А. Курс патологической техники. —Л.: Медгиз, 1961. —339 с.
6. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. —М.: изд. ИЛ., 1962. —962 с.
7. Прозоровский В.Б. Табличный экспресс-метод определения средних эффективных мер воздействия на биологические объекты // Токсикологический вестник. —1998. —№1. —С. 28-32.
8. Фесенко И.Т., Чаплий О.В., Омельченко Н.И., Калиниченко Л.М. Об острых отравлениях амидо- и нитропроизводными бензола // Врачебное дело. —1982. —№7. —С. 112-113.
9. Характеристика аварій на хімічно-небезпечних об'єктах /Дубицький А.Ю., Чепкий Л.П., Семенов І.О., Кагліченко В.В., Кожевніков В.Н. // Современные проблемы токсикологии. —1999. —№2. —С. 14-17.
10. Albrecht W., Neumann H.G. Biomonitoring of aniline and nitrobenzene. Hemoglobin binding in rats and analysis of adducts // Arch. Toxicol. —1985. —57, №1. —Р. 1-5.
11. ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry). 1990. Toxicological Profile for Nitrobenzene. Prepared by Life Systems, Inc., under Subcontract to Clement Associates, Inc., for ATSDR, U.S. Public Health Service under Contract 205-88-0608. ATSDR/TP-90-19.
12. Beauchamp R.O., Irons R.D., Rickert D.E., et al. A critical review of the literature on nitrobenzene toxicity. CRC Crit. Rev. Toxicol. —1982. —11. —P. 33-84.
13. Cattaneo A., Furiosi D., Bolis C., Cannavo R. Intossicazione acuta da sostanze metaemoqlobinizzanti // Minerva med. —1987. —78, №15. —Р. 1167-1176.
14. Oliver L.Ch., Weber R.P. Chest pain in rubber chemical workers exposed to carbon disulphide and methemoglobin formers // Brit. J. Ind. Med. —1984. —41, №3. —P. 296-304.