miscellanea
activities services contacts zvitnist journal miscellanea


Компьютерная регистрация и анализ результатов тонкослойной хроматографии.
Шандренко С.Г., Головин А.С., Дмитренко Н.П., Юрченко А.И., Бабичева А.Ф.
Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя МЗО Украины.

Предложен метод компьютерного фотоденситометрирования для оценки результатов тонкослойной хроматографии. Изображение поверхности пластинки после разгонки и проявления вещества оцифровуется с помощью сканера с последующей математической обработкой изображения. Определяется площадь пятна, площадь на полвысоты и интегральная оптическая интенсивность. По этим данным автоматически рассчитывается количество определяемого вещества. Математически определяются параметры фронтов пятна, с помощью которых можно проводить дополнительную идентификацию вещества и анализировать сложное хроматографическое изображение. Для реализации этого метода разработана компьютерная программа "ДенситоАнализ".
 
Computer registration and analysis of thin-layer chromatography results.
Shandrenko S.G., Golovin A.S., Dmitrenko N.P., Yurchenko A.I., Babicheva A.F.
Medved's institute of Ecohygiene and Toxicology, Kyiv, Ukraine.

The method computer photodensitometry for evaluation of thin-layer chromatography outcomes is offered. An image of a plate surface is quantized with scanner. The digital image is mathematically processed for determination of the square of a spot, square on half-heights and integrated optical intensity . By this way it is automatically calculated an amount of tested substance. Mathematically calculated parameters of spot fronts can be used for additional identification of substances and for analysis of mathematically calculated complicated chromatography images. For this purpose it has been created the computer program "DensitoAnalyze".

Комп'ютерна реєстрація та аналіз результатів тонкошарової хроматографії.
Шандренко С.Г., Головін А.С., Дмитренко М.П., Юрченко А.І., Бабичева О.Ф.
Інститут екологічної гігієни та токсикології ім..Л.І.Медведя МОЗ України.

      Сьогодні немає необхідності розглядати вкрай важливе значення методу хроматографії в тонких шарах (ТШХ) для проведення науково-практичних досліджень в різноманітних галузях науки та охорони здоров'я. Цей метод один з найстаріших, беручи свій початок в 1938 році [1] тонкошарова хроматографія розвивається й досі. За останні десятиліття активно вдосконалюються засоби для кількісного аналізу результатів ТШХ. При досить розвинутих методах підготовки та нанесення проб, проявлення речовин, при використанні сучасних сорбційних матеріалів, саме кінцевий етап аналізу — оцінка результатів гальмує використання методу для проведення точного кількісного аналізу. Зараз використовується суб'єктивний метод оцінки — візуальне порівняння з градуювальними плямами або геометричне вимірювання розмірів плями. Тому перспективним направленням є розвиток засобів для автоматизованого фотоденситометрування (ФД). Цей метод аналізу складається з двох етапів: сканування робочої поверхні пластинки для ТШХ — отримання цифрової копії зображення та комп'ютерний розрахунок кінцевого результату. В якості приклада реалізації такого підходу можна навести комплекс "Scaner 3" фірми CamagTLC (Швейцарія) з програмним забезпеченням "Cats"[2]. Дозволяюча спроможність скануючого пристрою складає 25 мкм. Сканування поверхні відбувається в монохроматичному освітленні з кроком зміни довжини хвилі – 5 нм. Для оптичного діапазону 350-900 нм це становить 110 градацій кольорів, при 16 біт-ному вимірюванні освітлення загальна ступінь градації признаку колір – освітлення становить 7,2 млн. За допомогою програмного забезпечення проводиться розрахунок Rf, визначення кольору плями, ідентифікація речовини за цими параметрами та обчислення параметрів плями: площі, оптичної густини. За градуювальними даними автоматично розраховується кількість речовини, яку визначають. Саме така методика реєстрації та обчислення результатів дозволяє перетворити ТШХ в метод точного кількісного аналізу. Основний недолік — значна вартість обладнання, що значно гальмує впровадження ФД в практику досліджень для багатьох лабораторій України. Наприклад, вартість вищенаведеного комплексу складає приблизно 125 тис. грн.
     На наш погляд всі переваги ФД можна реалізувати використовуючи сучасну оргтехніку, яка за останнє десятиліття швидко розвивається за рахунок використання новітніх технологій електронного виробництва. Тим більше, при стрімкому вдосконаленні вартість обладнання постійно зменшується. Для прикладу розглянемо сканер "CanoScan 670U" фірми Canon [3]. Його вартість складає 400 грн. Розподільна здатність &ndash 600 dpi (42 мкм). Такої точності для проведення ТШХ-аналізу в більшості випадках більш, ніж достатньо. При лінійних розмірах плями -1 см, похибка сканування зображення складе, менш ніж 0.5%. В спеціальних ТШХ-аналізах високої точності можна використати професійні сканери зі здатністю 1200 dpi (21 мкм), вартість яких складе приблизно 1.5 тис.грн. Інтенсивність кольорів передається 24-бітним значенням. Таким чином, параметр колір-освітлення має 16 млн. градацій, що достатньо для проведення спектрального аналізу ТШХ. Для подальшого аналізу зображення пластинки в цифровому вигляді можна використовувати сучасні графічні пакети комп'ютерних програм, наприклад Adobe PhotoShop, Corel Draw або розробити спеціалізовану програму.
     Проведене порівняння між професійним денситометром та сучасним сканером показує можливість для широкого впровадження комп'ютерного варіанту ФД реєстрації результатів ТШХ за рахунок зменшення вартості обладнання.
     Мета роботи — експериментально перевірити можливість застосування методу ФД з використанням сканера.

Методи та матеріали.

     Для демонстрації запропонованого методу ФД були взяті ТШХ-пластинки після застосування класичної розгонки речовин для визначення формальдегіду (ФА) [3] та фенолу [4] в водних витяжках. Побудовані градуювальні графіки для визначення концентрації речовин в діапазоні від 0.5 мкг до 5 мкг.
     Для сканування поверхні пластинок використовували сканер "CanoScan 670U" з оптичним дозволом 600 dpi. Результат сканування записували в графічному форматі ВМР. Для аналізу графічної інформації нами розроблена комп'ютерна програма "ДенситоАналіз"*.

Результати.

     На рисунках 1 та 2 показано зображення поверхні просканованих пластинок після розгонки речовин. За допомогою сканера отримано цифрове представлення зображення, що дозволяє застосувати математичні методи розрахунку. Розглянемо деякі можливості математичної обробки. Кожна точка на площині характеризується числовим значенням (Е), пропорційним до оптичної густини в даній точці. Вздовж вказаного направлення визначається розподіл оптичної густини. На рис.1 показано розподіл вздовж напрямку розгонки речовини (А) та поперек цього напрямку (В). Отримані графіки дозволяють більш коректно вивчити розподіл речовини на пластинці та розрахувати площу плями. Використовуючи комп'ютерну програму площа плями визначається як добуток квадрату розподільної здатності сканера на кількість точок на площині, для яких оптична густина Е більша за встановлене порогове значення Епор (висота на графіку розподілу речовини, на якій розраховується площа плями): . Дійсна "висота" плями (піку розподілу речовини) визначається як ΔE=Emax-E0 (рис.1).

Рис.1. Зображення хроматографічної пластинки при визначенні фенолу та розподіл оптичної густини вздовж напрямків А та В.

Площу можна розраховувати при Епор=E0+1/n(Emax-E0), n=2; 2,7; 5. На рис.1 схематично показана площа S (n→∞) – площа всієї плями та S1/2 (n=2) – площа на піввисоті. Наявність "шлейфу" на хроматограмі, дефектів пластинки в більшості випадках не дозволяє точно визначити Е0, що суттєво підвищує похибку розрахунку S. Метод визначення площі "S1/n" дозволяє суттєво збільшити точність кінцевого результату, за рахунок зменшення впливу фонового забарвлення пластинки. Наприклад, була визначена концентрація ФА (рис.2а) при розрахунку площі плями при різних Епор : К(S)=2.9 мкг; K(S1/2)=2.5 мкг; K(S1/e)=2.5 мкг; K(S1/5)=2.5 мкг. З отриманих результатів видно, що наявність фону пластинки, "шлейфу" підвищує значення S. Визначення площі на піввисоті дозволяє отримати більш коректні результати. За однаковою методикою розраховуються градуювальні та експериментальні дані. Відносну похибку визначення площі (S=πx2) можна розрахувати як: δS/S=2•δx/x. У разі плями 5 мм та розподільній здатності сканера 600 dpi (δx=42 мкм) похибка складе 0.0084 (0.84%). Для плям більших розмірів похибка буде меншою. Таким чином, похибка аналізу зображення значно менша ніж похибка за рахунок підготовки та нанесення робочих та градуювальних проб.
Рис.2. Зображення хроматографічної пластинки при визначенні формальдегіду (А) та розподіл оптичної густини вздовж напрямку розгонки (В).

     Площа хроматографічної плями при фіксованій кількості речовини залежить від багатьох чинників, наприклад: від типу адсорбційного матеріалу на пластинці, розчинника, температури, часу розгонки. Кількості речовини на пластинці більше відповідає не площа плями, а оптична інтенсивність (інтенсивність забарвлення) плями (I) – площа плями помножена на розподіл оптичної густини. В даному випадку для розрахунку I необхідно знайти суму оптичних густин всіх точок, для яких Еi>Eпор та помножити на квадрат розподільної здатності: На рис.2 графічно показано приклад разрахунку площі па піввисоті (1) та оптичної інтенсивності (2). При розрахунку градуювальних даних автоматично визначається декілька параметрів: загальна площа плями, площа на піввисоті та оптична інтенсивність. За кожним параметром комп'ютерна програма будує градуювальний графік. В залежності від вибору користувача програми застосовується лінійна апроксимація за методом "найменших квадратів" або апроксимація поліномом п-ступеня (при наявності п+1 градуювальних точок). При визначенні одного з параметрів плями проби автоматично розраховується кількість речовини за відповідною градуювальною апроксимацією. Таким чином, даний метод дозволяє оптимізувати градуювальні графіки та проводити автоматичний розрахунок кількості речовини.
     На рис.1 показано класичний приклад ТШХ. Пляма добре візуалізується, має правильну форму з чіткими краями. Аналіз такого зображення дуже спрощено та застосування класичного методу візуального порівняння з градуювальними плямами дає задовільний результат. Але в багатьох випадках при розгонці реальних об'єктів хроматографічне зображення більш складне. Фон пластинки, дефекти, наявність "шлейфу" – все це погіршує умови для візуального аналізу, а в певних випадках робить неможливим визначення контурів плями. На рис.2А показано складне хроматографічне зображення. Пляма (1) локалізується чітко, але решту плям, особливо (4), візуально визначити дуже важко. На графіку розподілу речовини (рис.2В) межа плями чітко локалізується навіть візуально. Комп'ютерний аналіз цифрового зображення дозволяє точно визначити Е0, відповідну площу та провести розрахунок кінцевого результату.
     Оцифровка зображення дозволяє проводити математичний аналіз розподілу оптичної густини (речовини) в плямі. На краях плями цей параметр змінюється за певним законом від максимального значення до Е0. Вивчення розподілу оптичної густини на фронтах плями може дати додаткову інформацію про речовину. Наприклад, на хроматограмі, представленій на рис.1, виділено чотири фронта (1-4). Ми зробили припущення, що оптична густина змінюється за експотенційним законом: (e-E0)=(Emax-E0)*exp(-a*Δx). На рис.3 показано розподіл натурального логарифму оптичної густини на відповідних фронтах та лінійна апроксимація отриманих даних методом "найменших квадратів".
Рис.3. Лінійна апроксимація розподілу логарифму оптичної густини на фронтах плями. А=ln(E).

Високий коефіцієнт кореляції (r=0.99-0.98) між апроксимацією та даними вказує на доцільність такого припущення. Для кожного фронту таким шляхом були визначені характеристичні коефіцієнти а: а1=0.33мм-1; а2=0.17мм-1; а3=0.37мм-1; а4=0.36мм-1. Фізичне значення коефіцієнта а: зворотна величина 1/a [мм] характеризує відстань, на якій оптична густина фронту зменшується в е (2,7) разів. Параметр а для фронтів, які лежать перпендикулярно напрямку розгонки (3,4), однаковий. Але для фронтів, які співпадають з напрямком розгонки (1,2), параметр а відрізняється майже в 2 рази. Математична модель формування фронтів складна, необхідно вирішувати диференційне рівняння з обмеженим джерелом. Але мета цієї роботи показати принципову можливість проведення такого аналізу. Розглянемо більш спрощену модель. На рис.3 показані сили, які діють на частки речовини, що розганяються. Це дрейфова складова (dr) – відображає дрейф речовини під дією висхідного потоку розчинника, дифузна (df) – діє за рахунок наявності градієнту кількості речовини в плямі, тяжіння (g) – дія сили тяжіння на частки речовини (розгонка проводиться в вертикальному положенні пластинки). Для фронту 1 дифузна сила та тяжіння діють в напрямку формування фронту, а дрейфова сила в протилежному. Для фронту 2 інше співвідношення сил: дрейфова та дифузна – в напрямку фронту, а тяжіння – в протилежному. Характеристичні коефіцієнти а можна записати як: a1=df+g-dr; a2=df+dr-g. Підставивши значення а1 та а2 отримаємо: (dr-g)=0.25 мм-1. Дрейфова складова характеризує тип розчинника, який використовується для розгонки речовини, та тип абразивного матеріалу пластинки. В дослідах, де розчинник та пластинка однакові, складова dr повинна бути постійною. Складова g залежить від молярної маси речовини. Тому параметр (dr-g) може бути використаний (разом з Rf) для ідентифікації речовини за молярною масою. Напрямок фронтів 3 та 4 лежить перпендикулярно напрямку розгонки, впливом дрейфової сили та тяжіння можна знехтувати (а34). Таким чином, параметр а3 та а4 характеризує тільки дифузну складову сили, яка є виключно характеристикою речовини, та також може бути використана для ідентифікації цієї речовини.
     Визначення характеристичних параметрів фронтів а14 при стандартних умовах експерименту може допомогти в аналізі складного хроматографічного зображення. Наприклад, на рис.4 наведено розподіл оптичної густини на хроматографічній пластинці.
Рис.4. Розподіл оптичної густини на пластинці при визначенні формальдегіду (А) та графік піку ФА з відновленим фронтом ((y [мм]).

Мета дослідження — визначити кількість ФА. Але все зображення на пластинці за рахунок інтенсивного "шлейфу" виглядало як суцільна пляма, візуально було неможливо локалізувати пляму, відповідну за ФА. При класичному візуальному аналізі цей дослід вважався б невдалим. На відповідному графіку інтенсивний "шлейф" обумовив великі значення Е0 в порівнянні з величиною Еmax-E0. На графіку видно криву, відповідну за ФА, але цей пік накладений на більш широкий. Тому застосувати цифрову методику розрахунку площі, навіть на піввисоті, неможливо. Для аналізу необхідно відновити фронт 2. З попередніх досліджень був розрахований характеристичний коефіцієнт фронту 2 для ФА: а2=7.6 мм-1. На кривій вибрана опорна точка Е1 та від неї розрахована форма фронту: е=(E1-E0)•exp(-7.6 *Δy)-E0. Таким шляхом було повністю відновлено криву ФА, що дало змогу застосувати метод розрахунку S1/2 та визначити кількість речовини (1.6 мкг ФА).

Висновки.

     Методика оцифровки зображення пластинки ТШХ дозволяє застосувати математичний апарат для точного розрахунку кінцевого результату. Використання сканерів, зважаючи на низьку вартість обладнання, відкриває шлях до широкого застосування методу фотоденситометрування в ТШХ та перетворює його в об'єктивний метод дослідження. Розробка математичної моделі формування фронтів дозволить створити принципово нові методики ідентифікації речовини за результатами ТШХ.

Література

1. Э.Шталь. Хроматография в тонких слоях.-Москва: Мир, 1965.- 508 с.
2. Technical manual Scaner3, CamagTLC, 1997.
3. Паспорт сканера "CanoScan 670U", 2000.
4. Методические указания по санитарно-гигиенической оценке резиновых изделий и латоксных изделий медицинского назначения.- М., 1988. - 117 с.
5. Инструкция по санитарно-химическому исследованию изделий из полимерных материалов, предназначенных для использования в хозяйственно-питьевом водоснабжении и водном хозяйстве. -М.,1987- 61 с.


* Щоб завантажити програму "ДенситоАналіз" (версiя програми 2.0, розмiр – 270 КБ), натиснiть тут


| Home | Дiяльнiсть | Сертифiкацiя | Послуги | Контакти | Звітність |
| Журнал "Сучаснi проблеми токсикологiї" | Рiзне |