УДК 615:632.95

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИНИТРООРТОКРЕЗОЛА В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ

В.Д. Лукьянчук, д. м. н., проф., Д.С. Кравец

Луганский государственный медицинский университет

Высокий уровень применения пестицидных препаратов является одной из необходимых мер повышения эффективности сельскохозяйственного производства. Однако общеизвестны и негативные стороны влияния химических средств защиты растений на организм лиц, контактирующих с ними как в условиях промышленного производства, так и использования в аграрном секторе. Поступая в организм теплокровных, в том числе и человека, пестициды обладают материальной и/или функциональной кумуляцией, оказывая неблагоприятное в токсикологическом отношении влияние на различные органы и системы организма.

Для разработки высокоэффективных средств лечения и профилактики острых и хронических отравлений ксенобиотиками различного химического строения важное значение имеют токсикокинетические исследования, направленные прежде всего на оценку содержания токсических веществ в различных биосредах организма. Это в полной мере относится и к динитрофенольным пестицидам, среди которых особую опасность в плане развития острых смертельных отравлений представляет динитроортокрезол (ДНОК).

В литературе [1] описан метод количественного определения ДНОК только в крови. Однако для более полного суждения о судьбе ксенобиотика в организме необходимо располагать сведениями о характере распределения яда в различных органах и тканях. В связи с этим, целью настоящей работы была разработка высокочувствительного метода количественной индикации ДНОК в различных органах и тканях.

Существующий метод идентификации ДНОК в крови [1] основан на его экстракции из плазмы крови метилэтилкетоном с последующим определением концентрации фотоэлектрокалориметрическим методом, однако он не пригоден для индикации соединения в органах и тканях. Это, с нашей точки зрения, может быть объяснено связыванием ДНОК (как биполярного соединения) с высокомолекулярными биомолекулами и прежде всего с тканевыми белками, что является главным препятствием для проведения необходимой экстракции вещества метилэтилкетоном.

С целью расщепления высокомолекулярных белков и липопротеидов, составляющих основу клеточных и субклеточных мембран органов и тканей, нами был использован фармакопейный препарат из группы протеолитических ферментов – химопсин (производства п/о «Ленмясокомбинат»), который содержит комбинацию альфа-химотрипсина и трипсина.

Трипсин, как известно, весьма активно гидролизует как низко-, так и высокомолекулярные белки. Он особенно легко расщепляет связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы аргинина и лизина. Если трипсин расщепляет только 1/3 всех пептидных связей в белковой молекуле, то химотрипсин гидролизует также и пептоны с образованием относительно низкомолекулярных пептидов, при этом химотрипсин расщепляет преимущественно те пептидные связи, на которые трипсин не действует. Химотрипсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками триптофана, тирозина и фенилаланина, он обладает более широкой (по сравнению с трипсином) субстратной специфичностью, катализируя гидролиз не только пептидов, но и эфиров, гидроксаматов, амидов и других ацилпроизводных [2, 3].

Предлагаемый нами метод основан на экстракции ДНОК метилэтилкетоном из органов и тканей, предварительно обработанных протеолитическим ферментом.

Ход количественного определения ДНОК в органах и тканях:
навеска анализируемой биосреды массой 0,5 г подвергается гомогенизации с использованием кварцевого песка. К полученному гомогенату добавляют 1 мл фосфатного буфера с рН 7,6–7,8 (при данных значениях рН реализуется наиболее высокая активность протеолитических ферментов), 0,1 мл 1 % раствора химопсина; интенсивно встряхивают в течение 3 мин, затем инкубируют в термостате при температуре 37±0,5 °С в течение 8–12 ч, после чего добавляют 1 мл метилэтилкетона (х. ч.). Для предупреждения испарения метилэтилкетона пробирки закрывают притертыми пробками, встряхивают на протяжении 5–8 мин. Затем пробы центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5–6 мин. Надосадочную жидкость (раствор ДНОК в метилэтилкетоне) переносят в кювету толщиной 0,8 мм и спектрофотометрируют при длине волны 440 нм. Концентрацию ДНОК (мг/мл) определяют по калибровочному графику, который строится на результатах спектрофотометрирования различных концентраций ДНОК с использованием общепринятых приемов. Затем концентрацию ксенобиотика (С) в мг/г вычисляют по формуле:

C =C₁•1 мл / 0,5 г ,

где С₁ — концентрация ДНОК в мг/мл; 1 мл — количество метилэтилкетона, применяемого для экстракции ДНОК в одной пробе; 0,5 г — масса исследуемого биоматериала.

Чувствительность разработанного метода составляет 3,85•10^-3 мг/г. Экспериментальная апробация разработанного нами метода проведена в лаборатории кафедры фармакологии ЛГМУ на модели острой интоксикации, развивающейся у белых нелинейных крыс обоего пола массой 170–220 г при однократном пероральном введении 1 % раствора аммонийной соли ДНОК в дозе 40 мг/кг (LD₅₀). Контролем служила группа интактных животных, которым вводили аналогичный объем питьевой воды. Содержание ДНОК определяли через 6 ч после введения яда в следующих органах: почки, сердце, легкие, печень, мышечная ткань. Результаты представлены в таблице. Таким образом разработан высокочувствительный метод определения ДНОК в различных органах и тканях организма.

ЛИТЕРАТУРА
1. Буркацкая Е.Н., Иванова З.В., Лысина Г.Г. Медицинское обследование лиц, работающих с пестицидами. –К.: Здоров`я. 1978. –184 с.
2. Айсина Р.Б., Казанская Н.Ф., Лукашева Е.В. Получение и свойства микрокапсулированного альфа-химотрипсина // Биохимия. –1976. –Т. 41, вып. 9. –С. 1656–1661.
3. Веременко К.Н. Современное состояние и основные задачи медицинской энзимологии // Врачебное дело. –1982. –N 8. –С. 8–14.