УДК 615.357.631:577.611.657

МЕМБРАНОСТАБИЛИЗИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ТАБЛЕТОК СПИРУЛИНЫ В УСЛОВИЯХ ОСТРОГО ТОКСИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ

Н.В. Литвинова, д.м.н., А.Н. Марченко, к.б.н., Е.Л. Левицкий, д.б.н.,
Ю.И. Губский, чл.-корр. АМН Украины, А.Г. Горюшко, к.х.н., Р.Г. Примак, к.х.н.,
А.В. Матвиенко, к.м.н., Н.М. Курская, Л.А. Мангадаш

Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, г. Киев
ЗАО «Веронекс», г. Донецк

Неблагоприятные экологические условия в современной Украине поставили на повестку дня ряд неотложных задач перед специалистами в областях теоретической и практической токсикологии. Эффект повреждающих факторов окружающей среды в значительной мере обусловлен действием токсических химических веществ и радиации. Их влияние на клетку обусловлено свободными радикалами, прямо или опосредовано поражающими субклеточные структуры, непосредственным взаимодействием ядов и клеточных компонентов, кислород-зависимым повреждением азотистых оснований нуклеиновых кислот и некоторыми другими механизмами [1, 2].

Важнейшими мишенями повреждающих факторов в клетке живых организмов являются биологические мембраны и ядерный генетический аппарат (хроматин). Нарушение их структурной целостности и точности функционирования под влиянием химического и радиационного воздействия приводит к разрегулировке биохимических реакций, циклов, структурных внутриклеточных ансамблей, что является клеточно-молекулярной основой возникновения ряда заболеваний, связанных с неблагоприятной экологией: сердечно-сосудистыми, онкологическими, нервно-психическими, нарушениями функций иммунитета. Токсическому воздействию свободных радикалов, возникших под влиянием химических и радиационных факторов, подвержены все органы и системы организма, однако, первичной мишенью является печень, где происходит генерализация, накопление и потенцирование их токсического эффекта.

В связи с вышеизложенным, актуальной проблемой современной токсикологии и фармакологии является создание лекарственных средств, призванных обеспечить нейтрализацию свободных радикалов химической и радиационной этиологии. В ряду препаратов, обладающих подобной фармакологической активностью, важнейшее место принадлежит комплексам биологически активных веществ (БАВ), находящихся в лекарственных растениях. В ряде работ, опубликованных в последнее время, была показана эффективность подобных БАВ и созданных на их основе препаратов в качестве гепато-, геномо- и мембранопротекторов [3–6]. Особо важное значение в последнее время придается препаратам-гепатопротекторам на основе водорослей, так как было показано, что они содержат целый ряд БАВ: белков, нуклеиновых кислот, антиоксидантов (витаминов, биофлавоноидов, полифенолов), микроэлементов, обладающих довольно высокой реакционной способностью, благодаря чему происходит эффективное обезвреживание свободных радикалов, а также наблюдается значительный защитный эффект по отношению к биомембранам и ядерному хроматину, как вследствие образования с этими биоструктурами защитных комплексов, так и непосредственной нейтрализации токсинов [7, 8].

В ряду подобных препаратов была показана эффективность использования исходного сырья из сине-зеленых, диатомовых водорослей, хлореллы, спирулины. Последнему растению сейчас уделяется особо важное значение, на его основе были созданы различные пищевые добавки и ряд препаратов, обладающих, в числе прочих, и гепато-, геномо- и мембранопротекторной активностями. Исследованиями, проведенными в Институте геронтологии АМН Украины, был обнаружен широкий спектр фармакологических свойств спирулиносодержащего препарата, среди которых особое внимание заслуживает именно вышеупомянутая фармакологическая активность [9].

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось изучение гепатопротекторного, мембраностабилизирующего и антиоксидантного действия таблеток спирулины отечественного производства (ЗАО «Веронекс», Донецк) в условиях острого химического повреждения печени тетрахлорметаном (ТХМ). В работе использовали белых крыс, объектами биохимических, физико-химических и патоморфологических исследований являлась печень и выделенные из нее мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭР).

Материалы и методы исследования

Опыты проводили на белых крысах линии Вистар массой 220–280 г. Животные были распределены на три группы: интактные, отравленные ТХМ (1 ЛД₅₀ внутрибрюшинно, однократно); третью группу составляли животные, получавшие спирулину с кормом в течение 7 сут до отравления в дозе 500 мг/кг массы тела и продолжавшие получать препарат в той же дозе после отравления ТХМ. Через 7 сут после отравления (то есть через 14 сут с момента начала эксперимента) всех животных декапитировали под легким эфирным наркозом. Печень использовали для патоморфологических исследований, а также для выделения мембран ЭР — микросомальной фракции [9]. В мембранах ЭР клеток печени исследовали показатели, отражающие состояние процессов липопереокисления — скорость накопления МДА в условиях неинициированного и индуцированного перекисного окисления липидов (ПОЛ), уровень конечных флуоресцирующих продуктов — шиффовых оснований, отношение общие липиды/белок [10–12], а также физико-химические параметры [10, 13, 15]. Изучали спектры поглощения суспензий мембран в трис-НСI-буфере, рН 7,35 в области длин волн 210–300 нм, соответствующим энергетическим переходам в молекулах липидов, белков, нуклеиновых кислот (220, 280 и 260 нм). В табл. 1 приведены относительные величины оптической плотности, отражающие изменения в соотношениях липид/белок (d₂₂₀/d₂₈₀) и липид/ДНК (d₂₂₀/d₂₆₀). Изучали также собственную флуоресценцию мембранных белков, в частности, интенсивность флуоресценции триптофанилов при i330 (длина волны возбуждения — 286 нм, флуоресценции — 330 нм) и параметры тушения белковой флуоресценции акриламидом (в табл. 1 приведены константы тушения Штерна-Фольмера — k_sv). Для флуоресцентного зондирования мембран использовали флуорескамин, пирен и АНС. В табл. 2 приведены значения интенсивности флуоресценции флуорескамина при встраивании в мембраны ЭР клеток печени — i₄₇₅, вероятность индуктивно-резонансного переноса энергии — (ИРПЭ) с молекул белков на пирен — w, а также интенсивность флуоресценции АНС при встраивании в мембраны ЭР клеток печени — при длине волны возбуждения 286 нм и длине волны флуоресценции 470 нм (i₄₇₀), для концентрации белка 0,022 мг/мл и температуры 20 °С. Спектрофотометрию осуществляли на спектрофотометре shimadzu mps-5000 (Япония), флуорометрию — на спектрофлуориметре hitachi mpf-4 (Япония).

Наряду с оценкой биохимических и физико-химических параметров мембран ЭР клеток печени в условиях отравления ТХМ и применения таблеток спирулины была исследована также гистоморфологическая структура органа в тех же условиях эксперимента. Объектом исследования являлась печень экспериментальных животных. Кусочки органа фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, проводили через спирты возрастающей концентрации и пропитывали парафином. Изготовляли тонкие срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином. На фиксированных замороженных срезах с помощью Судана III выявляли жировые вещества. Просмотр препаратов и их микрофотографирование осуществляли на микроскопе «Цитопан».

Статистическую обработку результатов исследования проводили на основании критерия Стьюдента [14].

Результаты и их обсуждение

Результаты исследования состояния процессов ПОЛ в мембранах ЭР клеток печени представлены в табл. 1. В группе отравленных животных через 7 сут после введения ТХМ регистрируется достоверное, по сравнению с показателями интактных животных, повышение скорости накопления МДА в условиях неинициированного липопереокисления. Лечебно-профилактическое применение таблеток спирулины приводит к нормализации показателя, характеризующего неинициированное ПОЛ в мембранах ЭР клеток печени. Уровень конечных флуоресцирующих продуктов ПОЛ - шиффовых оснований достоверно ниже, чем у интактных и отравленных животных. Падает также соотношение общие липиды/белок. Полученные данные указывают на наличие у таблеток спирулины выраженных антиоксидантных свойств.

Для оценки мембраностабилизирующего действия препарата сравнивали физико-химические параметры мембран ЭР клеток печени крыс в условиях отравления ТХМ и применения таблеток спирулины (табл. 2). Из приведенных результатов видно, что интоксикация ТХМ приводит к нарушениям в структуре мембран ЭР клеток печени, проявляющимся в изменении спектральных параметров. Наиболее заметные изменения при интоксикации наблюдали для параметров: d₂₂₀/d₂₈₀, характеризующего соотношение общие липиды/белок; интенсивности собственной флуоресценции белков(i₃₃₀); интенсивности флуоресценции зонда АНС при встраивании в мембраны (i₄₇₀), характеризующей структуру их поверхности; вероятности ИРПЭ (w), указывающей на состояние белково-липидного контакта. Применение спирулины приводит к нормализации изученных параметров мембран ЭР клеток печени.

При аутопсии контрольных (отравленных ТХМ) и опытных (ТХМ+спирулина) животных, содержавшихся в однотипных условиях, состояние их характеризуется как удовлетворительное. Животные нормальной упитанности, волосяной покров опрятный, кожа без следов расчесов и изъязвлений. Из естественных отверстий патологического выделяемого не наблюдалось. На вскрытии в брюшной полости постороннего содержимого не обнаружено. У контрольных животных печень несколько увеличена, с закругленными краями, желтоватого цвета. Доли печени между собой как бы спаяны и отделяются друг от друга с трудом. У большинства опытных животных печень обычного цвета, доли подвижные с заостренными краями и только в 33,3 % случаев (у 2 из 6) печень напоминала контрольную.

При микроскопическом исследовании на обзорных препаратах печени отравленных животных архитектоника органа сохранена, некробиотические изменения не обнаружены. Границы между гепатоцитами в большинстве случаев видны отчетливо. Вместе с тем, цитоплазма многих печеночных клеток значительно просветлена, базофильные глыбки обнаруживаются с трудом, ядра в таких клетках расположены на их периферии. По периферии печеночных клеток в цитоплазме гепатоцитов обнаруживается значительное количество вакуолей различной величины. В перипортальных пространствах лимфо-гистоцитарной реакции не наблюдалось. Активность ретикулоэндотелиальной системы органа выражена слабо. Многие центральные вены и прилежащие к ним синусоиды расширены и полнокровны. При окраске суданом III у большинства животных по периферии печеночных долек обнаружено увеличенное количество жировых капель (рис. 1). Причем, преобладали жировые капли средней и малой величины и только в некоторых гепатоцитах они полностью заполняли цитоплазму клеток.

У опытных (леченых) животных морфологическая картина печени заметно улучшалась по сравнению с контролем (не лечеными), не так часто обнаруживались гепатоциты с просветленной цитоплазмой, уменьшалось количество вакуолей в клетках, отсутствовали гемодинамические нарушения, увеличивалось количество базофильных глыбок в гепатоцитах. Реакция на липиды в большинстве случаев была отрицательной. И только у отдельных животных в печени встречались шароподобные гепатоциты с оптически пустой цитоплазмой, а в некоторых клетках выявлялись жировые вакуоли (рис. 2).

Итак, морфологические исследования дают возможность прийти к заключению о том, что использование таблеток спирулины при интоксикации ТХМ оказывает определенное положительное влияние на сохранность гистологической картины печени. В частности, по сравнению с животными не получавшими спирулину, в печени уменьшалось содержание жировых вакуолей, реже обнаруживались гепатоциты с оптически пустой цитоплазмой, чаще определялись базофильные глыбки в печеночных клетках.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что лечебно-профилактическое применение таблеток спирулины производства ЗАО «Веронекс» в дозе 500 мг/кг оказывает выраженное антиоксидантное действие, снижая содержание продуктов ПОЛ в мембранах ЭР клеток печени при отравлении гепатотоксическим ядом — ТХМ, предотвращает изменения физико-химических параметров внутриклеточных мембран гепатоцитов, способствует нормализации гистоморфологической структуры печени. Основываясь на результатах настоящих исследований, данный препарат можно рекомендовать в качестве лечебно-профилактического, а также восстанавливающего средства при повреждении ткани печени гепатотропными ядами.

ЛИТЕРАТУРА
1. Левицкий Е.Л., Губский Ю.И., Марченко А.Н., Примак Р.Г., Горюшко А.Г. Коррекция поражений ядерного генома антиоксидантами в условиях токсического повреждения печени // Совр. пробл. токсикол. –1998. –N 2. –С. 40–46.
2. Левицький Є.Л. Основні напрямки розвитку сучасної фітофармакології // Фармакол. вісник. –1998. –N 5. –С. 43–50.
3. Сиренко Л.А., Кирпенко Н.И., Кирпенко Ю.А. и др. Культивирование спирулины: некоторые итоги, проблемы и перспективы // Матер. Укр. наук.-практ. конфер.: Вінниця, 1997. –С. 5–7.
4. Гурин И.С., Атгихин И.С. Биологически активные вещества гидробионтов –источник новых лекарств и препаратов. –М.: Наука, 1989. –230 с.
5. Ефимов В.С., Усов А.И., Ольская Т.С. и др. Сравнительное исследование антикоагуляционной активности полисахаридов красных морских водорослей // Фармакол. и токсикол. –1983. –Т. 46, N 3. –С. 61–67.
6. Сакевич А.И. Экзометаболиты пресноводных водорослей. –Киев: Наукова думка, 1985. –187 с.
7. Левицкий Е.Л., Губский Ю.И. Свободнорпадикальные повреждения ядерного генетического аппарата клетки // Укр. биохим. журн. –1994. –Т.66, N 4. –С. 18–30.
8. Губский Ю.И. Коррекция химического повреждения печени. –Киев: Здоров’я, 1989. –167 с.
9. Пантелеймонова Т.Н., Шарабура Л.В. Гепатопротекторное действие спирулины при химической интоксикации у крыс // Матер. Укр. наук.–практ. конфер.: Вінниця, 1997. –С. 33–34.
10. Карузина М.И., Арчаков А.И. Выделение микросомальной фракции печени и характеристика ее окислительных систем // В кн.: Современные методы биохимии. –М: Наука, 1977. –С. 49–62.
11. Fletcher B.L., Dillard C.S., Tappel A.L. Measurement of fluorescence lipid peroxidation products in biological systems and tissues // Anal. Biochem. –1973. –V. 52, N 1. –P. 1–9.
12. Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г. и др. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови // Вопр. мед. химии. –1989. –N 1. –С. 127–131.
13. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. –М.: Наука, 1989. –277 с.
14. Урбах В.Ю. Биометрические методы. –М.: Наука, 1964. –416 с.
15. Bode J. On the reaction of fluorescamine with chromosomal protein // Anal. Biochem. –1979. –V. 99, N 2. –P. 274–280.