|
УДК 615.9 + 612.017 + 616.008 РОЛЬ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ ОТДАЛЕННОЙ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ НЕКОТОРЫХ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ П.Г. Жминько, к.б.н. Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, Киев, Украина Известно, что некоторые фосфорорганические соединения (ФОС) способны вызывать отдаленное нейротоксическое действие (ОНД). В настоящее время исследованы биохимические, физиологические и ультраструктурные изменения при действии ряда фосфорорганических соединений, оказывающих нейротоксическое действие [10, 13, 17]. Показано, что возникновение ОНД обусловлено значительным ингибированием фермента нейротоксической эстеразы, демиелинизацией в волокнах проводящих путей спинного мозга и периферических нервах. Механизм нейротоксического действия ФОС окончательно не выяснен. Для ряда заболеваний (рассеянный склероз, экспериментальный аллергический энцефаломиелит и др.), сопровождающихся демиелинизацией нервной ткани, характерно изменение реактивности иммунной системы и нарушение аутоиммунных процессов [6]. Не исключено, что при ОНД ФОС иммунная система также может играть определенную роль в патогенезе данной патологии. Целью настоящего исследования явилось изучение состояния иммунобиологической реактивности организма при действии некоторых ФОС, оказывающих отдаленную нейротоксичность и выяснение роли иммунной системы в патогенезе ОНД. Материалы и методы исследований Исследования проведены на курах породы Леггорн, массой тела 1,5–1,7 кг, как наиболее чувствительном виде животных к воздействию нейропара-литических ФОС. Для воспроизведения ОНД использованы триортокрезилфосфат в дозе 500 мг/кг и О.О-дифенил-1-ацетокси-2,2,2-трихлорэтилфосфонат (афос) в дозе 200 мг/кг. В качестве негативного контроля был взят О,S-диметил-О-циклогексилтиофосфат (циклофос) в дозе 10 мг/кг. Указанные дозы препаратов являются изотоксическими по действию на активность ацетилхолинэстеразы эритроцитов кур. Вещества вводили однократно в зоб кур в виде равномерной эмульсии при помощи зонда. Контрольным курам вводили воду. Проведено 2 серии экспериментов. В первом опыте в динамике (на 7, 14 и 21 сутки) изучены показатели неспецифической резистентности и гуморального звена иммунной системы животных при воздействии указанных ФОС. Во втором — исследовано состояние иммунной реактивности организма кур в допаралитический (7 сутки) и паралитический периоды (21 сутки). Морфологический состав периферической крови (количество лейкоцитов и гемограмму крови) изучали по общепринятым методам в гематологии [7]. Функциональную активность нейтрофилов исследовали при помощи теста с нитросиним тетразолием (NBT-тест) [2], уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови — методом Гриневич Ю.А. и Алферова А.И. [5]. Дифференциацию ЦИК по дисперсности проводили согласно метода Стручкова П.В. и соавторов [12]. Количество Т-, 0- и В-лимфоцитов определяли по активности кислой фосфатазы методом азосочетания [9], Т-хелперов (Тх) и Т-супрессоров (Тс) — по активности кислой неспецифической эстеразы методом Mueller J. et.al. [3], NК-клеток — по ультраструктуре лимфоцитов [8]. О функциональной активности В-лимфоцитов судили по титру гетерофильных гемагглютининов (ГГА) в реакции Пауля-Бунеля [15], Т-лимфоцитов — по реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) на воздействие митогена фитогемагглютинина (ФГА) [4]. Титры аутоантител (АА) к тканевым антигенам из головного и спинного мозга кур определяли при помощи реакции пассивной гемагглютинации по Бойдену [11]. Антигены из тканей головного и спинного мозга интактных кур и с клиникой ОНД готовили в соответствии с рекомендациями [15]. Полученные результаты подвергали статистической обработке на микро-ЭВМ [16]. Результаты и их обсуждение. Как видно из табл. 1, при действии афоса в дозе 200 мг/кг на 7 сутки исследований наблюдалось достоверное снижение базофилов и незначительный моноцитоз, 14 сутки — абсолютный нейтрофилез, 21 сутки — моноцито- и лимфоцитопения. Кроме того, на 14 и 21 сутки исследований отмечались морфоструктурные изменения в цитоплазме лимфоцитов (вакуолизация), у некоторых кур в крови появлялись плазмоциты. При действии ТОКФ в дозе 500 мг/кг на 7 сутки исследований выявлено значительное увеличение количества эозинофилов, уменьшение количества базофилов, что может свидетельствовать о сенсибилизирующем действии вещества. На 14 сутки, у части животных, в крови появлялись единичные макрофаги, плазмоциты и дегранулированные базофилы. В конце опыта установлено достоверное снижение общего числа лейкоцитов, лимфоцитов, увеличение числа плазмоцитов и дегранулированных базофилов. В отличие от афоса и ТОКФ, циклофос (10 мг/кг) не вызывал достоверных изменений морфологического состава периферической крови кур, за исключением снижения числа базофильных гранулоцитов на 7 сутки исследований. Как видно из табл. 2, афос на протяжении всего периода исследований снижал общее количество диформазан-позитивных нейтрофилов (ДПН) и их метаболическую активность, о чем свидетельствует снижение числа ДПН 1-й степени и отсутствие ДПН 2-ой степени. На 14 и 21 сутки исследований отмечалось достоверное снижение количества nk-клеток, ответственных за иммунологический надзор в организме. При действии ТОКФ во все сроки исследований общее количество ДПН не изменялось. Однако, снижалась метаболическая активность нейтрофилов, о чем свидетельствует отсутствие ДПН 2-ой степени. На 14 и 21 сутки исследований количество NK-клеток снижалось по отношению к контролю в 1,1 и 3,5 раза, соответственно. Циклофос на 7 сутки исследований снижал количество ДПН и их метаболическую активность, на 14 сутки — отмечалось только снижение метаболической активности нейтрофилов, 21 сутки — количество ДПН увеличивалось, метаболическая активность нейтрофилов была выше, чем у контрольных животных. Количество NK-клеток не изменялось. Выявленное прогрессирующее снижение функциональной активности нейтрофилов и количества NK-клеток указывает на то, что при действии афоса и ТОКФ значительно снижается неспецифическая резистентность организма. Изменения исследуемых показателей при воздействии циклофоса, вероятней всего, имеют адаптивный характер. Как видно из табл. 3, афос снижает уровень ЦИК в сыворотке крови. Коэффициент соотношения мелкодисперсных к крупнодисперсным иммунным комплексам (Км/к) в паралитический период составлял 1,6, что свидетельствует о превалировании в сыворотке крови патогенных форм ЦИК. В этот период иссдедований достоверно повышается титр ГГА в сыворотке крови. Начиная с 7 суток исследований обнаружены аутоантитела к тканевым антигенам из головного мозга интактных кур и с клиникой ОНД. Наибольшие титры АА выявлены к антигену из головного мозга кур с клиникой ОНД. У большинства животных титр АА к антигену из головного мозга кур с клиникой ОНД достигал 1:64 – 1:512. Достоверных изменений титра АА к антигену из спинного мозга не выявлено. Однако у отдельных животных наблюдалось повышение такового до 1:64. Следует отметить, что у кур с высоким титром АА и уровнем мелкодисперсных ЦИК клиника ОНД была более выраженной, чем у подопытных животных с нормальным соотношением Км/к и низким уровнем АА. Поскольку при действии афоса характерна повышенная проницаемость стенок сосудов [1], то, вероятно, снижение общего уровня ЦИК можно объяснить тем, что они проникают через тканевые баръеры и оседают в различных тканях, в том числе и нервной. Неисключено, что повреждающее действие на нервную систему может быть связано с патогенными ЦИК и АА к нервной ткани. При действии ТОКФ, как и афоса, общий уровень ЦИК постепенно снижался, но уровень мелкодисперсных ЦИК не отличался от контроля. Км/к для подопытных животных составлял 1,03–1,18 против контроля 1,06. У кур с клиникой ОНД наблюдалось увеличение Км/к (1,35–1,4), что указывает на превалирование в сыворотке крови этих животных среднедисперсных ЦИК. Титры ГГА в сыворотке крови достоверно повышались только в допаралитический период. Достоверных изменений титров АА к антигенам из головного и спинного мозга не выявлено. Однако, у некоторых кур с выраженной клиникой ОНД отмечалось незначительное увеличение титров АА (1:4 – 1:32) к тканевому антигену из головного мозга. В отличие от афоса и ТОКФ, при действии циклофоса выявлено накопление ЦИК в сыворотке крови. Наибольший уровень ЦИК отмечался на 14 сутки исследований. Накопление ЦИК отмечалось преимущественно за счет крупнодисперсных иммунных комплексов. Уровень ГГА был достоверно повышен во все сроки исследований и наростал во времени, что свидетельствует о повышенной функциональной активности В-лимфоцитов. АА к тканевым антигенам из нервной ткани не выявлено. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при действии афоса и ТОКФ отмечаются однотипные изменения морфологического состава периферической крови кур (лимфоцитопения, нейтрофилез), снижение количества NK-клеток и метаболической активности нейтрофилов, уровня ЦИК. У животных с выраженным нейропаралитическим действием наблюдается накопление средне- и/или мелкодисперсных иммунных комплексов, которые могут вызывать поражение различных клеток и тканей организма. Дегрануляция базофильных и увеличение числа эозинофильных гранулоцитов при действии ТОКФ свидетельствует о его аллергенном действии. Оба вещества повышают функциональную активность В-лимфоцитов. Образование АА к тканевым антигенам из нервной ткани больше характерно для афоса, чем ТОКФ. Прослеживается взаимосвязь между выраженностью проявлений ОНД, уровнем АА и мелкодисперсных ЦИК в сывортке крови. Это свидетельствует о том, что иммунная система может играть определенную роль в патогенезе ОНД фосфорорганических соединений. Характерным при действии циклофоса является незначительное снижение метаболической активности нейтрофилов с последующей активацией их функции, повышение функциональной активности В-лимфоцитов и накопление иммунных комплексов в сыворотке крови, преимущественно за счет крупнодисперсных ЦИК, которые легко солюбилизируются и выводятся из организма посредством фагоцитоза. Можно полагать, что выявленные изменения иммунной реактивности, прежде всего, направлены на детоксикацию циклофоса. Во втором опыте, при однократном пероральном воздействии афоса и ТОКФ в дозах 200 и 500 мг/кг, соответственно, по сравнению с предыдущим опытом, в допаралитический и паралитический период (7 и 21 сутки исследований), наблюдались однотипные изменения морфологического состава периферической крови кур — незначительная лейкопения, нейтрофилез, моноцитоз, лимфоцитопения. Отмечалось значительное снижение количества NK-клеток в паралитический период: при действии афоса — на 72 %, ТОКФ — на 68,2 %. Циклофос в дозе 10 мг/кг только на 7 сутки исследований вызывал абсолютный нейтрофилез и относительную лимфоцитопения. Изменений количества NK-клеток не выявлено. Как видно из рис.1, при действии афоса только в паралитический период наблюдалось снижение абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов, Тс. Коэффициент Тх/Тс на 7 сутки составлял 3,03; на 21 сутки — 3,44. Изменения количества иммунокомпетентных клеток при влиянии ТОКФ были выражены в большей степени, чем афоса. Достоверное снижение абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов, Тх и Тс выявлено как в допаралитический, так и паралитический период. Коэффициент Тх/Тс на 7 сутки составлял 2,39; на 21 сутки — 4,42. При воздействии циклофоса на 7 сутки наблюдалось снижение (на 38 %) абсолютного количества В-лимфоцитов, на 21 сутки — повышение абсолютного количества Тс (на 52 %). Изменения соотношения субпопуляций Т-лимфоцитов наблюдалось только в конце эксперимента (Тх/Тс — 1,43). Как видно из представленных данных, при действии нейро-паралитических ФОС отмечается снижение количества иммунокомпетентных клеток и соотношение субпопуляций Т-лимфоцитов. Снижение Тс, которые отвечают за толерантность к антигенам своего организма, может свидетельствовать о развитии аутоиммунного процесса при действии нейропаралитических ФОС [14]. Как видно из рис. 2, значимых различий во влиянии исследуемых соединений на функциональную активность Т- и В-лимфоцитов не выявлено. При действии афоса, ТОКФ и циклофоса в допаралитический и паралитический период отмечалось повышение титра ГГА в сыворотке крови, что свидетельствует о повышенной функциональной активности В-лимфоцитов. По степени выраженности эффекта исследуемые вещества располагаются в такой последовательности: циклофос, ТОКФ, афос. Афос и циклофос на 7 сутки исследований снижали бласттрансформацию лимфоцитов на воздействие ФГА, при чем афос в большей степени, чем циклофос. В этот период исследований ТОКФ не изменял РБТЛ. В паралитический период (21 сутки) функциональная активность Т-лимфоцитов при действии афоса достигала контрольных значений, при влиянии ТОКФ и циклофоса — повышалась. Повышение функциональной активности Т-лимфоцитов в этот период времени было более выражено у ТОКФ, чем у циклофоса. Таким образом, при действии изученных ФОС в изотоксических дозах наблюдаются изменения количества иммунокомпетентных клеток и их функциональной активности. Характерным для нейропаралитических веществ — афоса и ТОКФ, в отличие от циклофоса является то, что в паралитический период снижается количество Т-, В-лимфоцитов и Тс, повышается коэффициент Тх/Тс, функциональная активность Т- и В-лимфоцитов, что свидетельствует об аутоимунных нарушениях организма. Циклофос вызывает незначительное снижение количества В-лимфоцитов и повышает количество Тс, активирует функцию В- и Т-лимфоцитов, не вызывает изменений аутоиммунных процессов в организме кур. На основании результатов исследований можно сделать вывод, что при действии афоса и ТОКФ на организм кур в допаралитический период формируются средне- и мелкодисперсные ЦИК, уровень которых значительно возрастает в паралитический период, снижается функциональная активность нейтрофилов. С развитием патологического процесса усугубляются изменения иммунной системы — снижается общее количество лимфоцитов, Т- и В-лимфоцитов, Тс, NК-клеток, и увеличивается уровень аутоантител к антигену из нервной ткани, что свидетельствует о развитии аутоиммунных поражений. Виявленная взаимосвязь между выраженностью проявлений ОНД и аутоиммунными нарушениями в организме кур, свидетельствует о важной роли иммунной системы в патогенезе данной патологии. ЛИТЕРАТУРА |