УДК 615.9:615.281+620.197

РАЗВИТИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО НЕЙРОТОКСИКОЛОГИИ (обзор)

Н.В. Кокшарева, д. б. н.

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, г. Киев

Одной из основных задач, стоящих перед токсикологами с момента основания института являлось еще на стадии экспериментального изучения оценить реальную и потенциальную опасность пестицидов для здоровья людей, в той или иной степени находящихся с ними в контакте. В этой связи на первом этапе исследования было необходимо изучить особенности механизма токсического дейстивия пестицидов различных групп, изыскать новые методы диагностики интоксикаций с целью разработки научно-обоснованных подходов к профилактике и лечению острых отравлений указанными препаратами.

В период становления ВНИИГИНТОКСА (1964 г.) в лаборатории общей токсикологии, возглавляемой проф. Ю.С. Каганом, была создана группа "физиологических исследований", в состав которой входили видные физиологи — проф. С.И. Фудель-Осипова, к.б.н.С.Д. Ковтун, к.м.н. В.П. Дорощук — ученики и последователи одного из основоположников отечественной электрофизиологии — академика Д.С. Воронцова.

Главным направлением исследований указанной группы являлось изучение влияния различных химических веществ (пестициды, репелленты, пластификаторы, лекарственные препараты) на функциональное состояние различных отделов нервной системы (ЦНС, нервно-мышечное проведение, периферические аксоны), а также функцию дыхания и сердечно-сосудистой системы.

Любимым детищем Ю.С. Кагана были антихолинэстеразные препараты, в частности фосфорорганические соединения (ФОС), которым посвящен ряд его монографий. Вместе с тем, наряду с ФОС и карбаматами исследовались и другие нейротоксиканты — хлорорганические пестициды, синтетические пиретроиды, а также пластификаторы. Наряду с изучением механизмов токсического действия пестицидов уделялось большое внимане разработке средств антидотной терапии при отравлении антихолинэстеразными пестицидами.

В области исследования физиологии нервной и мышечной системы наиболее информативными и адекватными являются электрофизиологические методы исследования, которые позволяют количественно оценить патологический процесс, выявить ранние доклинические нарушения, дифференцировать демиелинизирующие расстройства от аксональной дегенерации.

Понимание нарушений физиологических процессов в организме является весьма важным как для оценки степени токсичности пестицидов, так и при гигиеническом нормировании химических веществ в объектах окружающей среды, т.к. изменения со стороны нервной системы часто являются наиболее ранними и по ним устанавливаются пороги острого и хронического действия.

Функциональные исследования являются основой клинической диагностики, а также методом оценки эффективности лечения и прогноза заболевания.

В этой связи перед группой физиологических исследований была поставлена задача наладить ряд современных методик. Так, впервые в практике токсикологических исследований к.б.н С.Д. Ковтуном была апробирована микроэлектродная техника, позволяющая изучать физиологические процессы на клеточном уровне. Им была смонтирована экранированная камера с комплектом электрофизиологической аппаратуры, позволяющая регистрировать потенциалы действия от периферических нервов и скелетных мышщ в опытах на животных (крысы, морские свинки и куры) как в условиях острого эксперимента, так и при длительном поступлении веществ в организм без оперативного вмешательства [1].

Для понимания тонких механизмов действия химических веществ на организм теплокровных животных исследования проводились на различных уровнях организации: клеточном, органно-тканевом и целостном организме.

Разработанная и внедренная методика отведения электрических реакций (ПД) от отдельных клеток (при помощи микроэлектродов) позволила перейти от гипотиз к прямому и точному анализу клеточных механизмов, раскрывающих какие именно структурные единицы мионеврального синапса поражаются преимущественно.

Обобщая результаты исследования в этом направлении, можно констатировать, что использование электрофизиологических методов при воздействии пестицидов различных групп позволило определить локализацию поражения в различных отделах центральной и периферической нервной системы.

Впервые было установлено, что в нарушении нервно-мышечной передачи возбуждения при воздействии ФОС и карбаматов в токсических дозах, наряду с угнетением активности синаптической АХЭ, определенная роль принадлежит неантихолинэстеразным механизмам — их влиянию на функцию холинорецептора постсинаптической мембраны, а также пресинаптические образования мионеврального синапса [2–6].

Как видно из рис. 1-А, при введении крысам ФОС (хостаквик, ДДВФ, метафос) в токсических дозах (ЛД₅₀) уже в первые 10–15 мин развивается полный блок проведения нервных импулсов. Блокада высокочастотных импульсов 50–100 Гц обусловлена угнетением синаптической ацетилхолинэстеразы (АХЭ); исчезновение ответов мышцы даже на одиночное раздражение электрическим током, а также изменение амплитуды и длительности потенциалов концевой пластинки (ПКП), возникновение ряда спонтанных разрядов свидетельствуют о прямом действии яда на ХР постсинаптической мембраны (ее деполяризации) (рис. 1-Б).

С помощью микроэлектрода, помещенного в область концевой пластинки латеральной мышцы хвоста крысы, было установлено (рис. 2), что ФОС, карбаматы (пиримор, фурадан, диоксикарб), а также некоторые ХОП (ПХП) оказывают влияние на выброс медиатора АХ нервным окончанием — увеличение частоты МПКП (на 150–400 % по отношению к контролю).

Впервые установлено [2, 3, 6], что ряд ФОС, а также пестициды группы синтетических пиретроидов (суми-альфа, цимбуш) нарушают функциональное состояние периферических аксонов уже в начальный период острой интоксикации, что связано с изменением ионных трансмембранных процессов и сопровождается замедлением СРВ по двигательным аксонам, изменением абсолютной и относительной рефрактерности нерва, а также появлением множественных спонтанных разрядов в ответ на одиночное раздражение.

При изучении механизмов токсического действия пестицидов на ЦНС было доказано, что ФОС (ДДВФ), карбаматы (диоксикарб) и ХОП (полихлорпинен) при введении в токсических дозах наряду с влиянием на биоэлектрическую активность головного мозга, повышают возбудимость мотонейронов спинного мозга и вызывают необратимые нарушения ультраструктуры нервных волокон (деструкция, гомогенизация миелиновых мембран). Как видно из рис. 3-1, при введении кошкам диоксикарба происходит резкое (на 100 %) увеличение амплитуды и уменьшение (на 30 %) латентного периода моносинаптического потенциала (МСП). Отмеченные изменения свидетельствуют, что под влиянием данного карбамата происходит повышение возбудимости мотонейронов поясничного отдела спинного мозга, т. е. количество мотонейронов, вовлекаемых в распространяющийся процесс возбуждения возрастает.

Это положение подтверждается и при исследовании характера течения распространяющегося моносинаптического возбуждения в мотонейронах путем применения двух раздражений, посылаемых с различными интервалами времени между ними, для стимуляции дорсального корешка. Как видно из рис. 3 -2 (график и осциллограммы 1–7), после введения крысам ДДВФ (ЛД₅₀) не только возрастает амплитуда МСП, но и существенно увеличивается величина облегчения — 450 % (контроль 300 %) и длительность этой фазы до 15–17 мс [7, 8].

Большая работа была проведена по изучению эффективности и механизмов действия новых антидотных средств при воздействии ФОС и карбаматов. Так, исследование физиологических механизмов действия нового реактиватора холинэстеразы (РХ) — диэтиксима, синтезированного в нашем институте д.х.н. В.Е. Кривенчуком, позволило выявить его преимущества перед применяющимся до этого времени антидотом дипироксимом и дрцгими четвертичными оксимами (2 ПАМ, ТМБ-4).

Было доказано [8], что диэтиксим, в отличие от указанных других препаратов способен проникать через ГЭБ и устранять токсическое действие ФОС и карбаматов на головной и спинной мозг. Механизм его лечебного действия обусловлен не только восстановлением активности АХЭ в различных отделах головного мозга, нормализацией ЭЭГ и функционального состояния мотонейронов спинного мозга (рис. 3-2, график и осциллограммы 1-11), но и выброса квантов медиатора ацетилхолина нервным окончанием [2, 5, 10].

Существенным преимуществом диэтиксима перед четвертичными оксимами является также наличие у него холинолитического эффекта [11].

В комплексной терапии ФОС обоснована целесообразность использования специфических лечебных средств (холинолитики, реактиваторы ХЭ) совместно с индукторами МОГС (фенобарбитал, бензонал) [12–14].

На основании всестороннего изучения эффективности и токсических свойств диэтиксима, а также другого РХ -диалкоба (синтезированного в нашем тнституте д.х.н. В.Н. Евреевым), эти антидоты были внедрены в медицинскую практику.

Начиная с 1985 г. под руководством Ю.С. Кагана были начаты исследования по изучению механизмов отдаленного нейротоксического действия (ОНД) ФОС и прогнозированию этого эффекта в эксперименте на самом чувствительном виде животных курах. На Украине и в странах СНГ данное направление исследований осуществляется только в институте Екогигиены и токсикологии.

ОНД ФОС привлекло внимание мировой общественности еще в 30 годы нашего столетия, когда в США были описаны десятки тысяч случаев параличей у людей, имевших контакт с ТОКФ. Более 30 тысяч случаев явились следствием употребления ямайского джина и оливкового масла, в которых присутствовал ТОКФ. Известны массовые случаи развития у людей параличей в результате ношения обуви с пластмассовыми стельками, содержащими ТОКФ. Число ФОС, для которых установлена отдаленная нейротоксичность, возрастает. Этим свойством обладают лептофос, мипафокс, ДФФ, трихлоронат и др. Зарегестрировано много случаев полиневритов после отравления людей хлорофосом. Отдаленные нейропатии проявляются постепенно, после определенного латентного периода (обычно через 14–21 день), а иногда через 1–5 лет после перенесенного острого отравления. Клинически они характеризуются возникновением атаксии, мышечной слабости, парезов и параличей конечностей; морфологически — развитием процесса демиелинизации проводящих путей спинного мозга и периферических нервов.

Механизм ОНД ФОС окончательно не выяснен. В эксперименте, а также на клиническом материале не установлена прямая зависимость между их антихолинэстеразным и нейропаралитическим действием. Показано, что мощные ингибиторы АХЭ не вызывают демиелинизацию. Попытки объяснить последнюю действием нейропаралитических препаратов на ложную ХЭ также не привели к успеху, т. к. оказалось, что другие избирательные ингибиторы ложной ХЭ (например, октаметил) к демиелинизации не приводят.

В соответствии с наиболее признанной в настоящее время теорией (высказана Джонсоном и Олдриджем), ОНД не связано с токсическим эффектом этих соединений, а обусловлено фосфорилированием активного центра специфического для нервной ткани белка — "нейротоксической" (нейропатической, НТЭ) эстеразы. Было доказано, что развитие нейропатий требует не только угнетения НТЭ, но и последующего ее старения, т. е. ингибирования фермента не менее чем на 70–80 % [15].

Важно, что старение НТЭ происходит чрезвычайно быстро — уже в первые часы после однократного воздействия ФОС, тогда как клинические симптомы интоксикации развиваются только через 2–3 недели. Однотипное влияние ФОС на НТЭ людей и кур позволяет использовать птиц для экспериментального моделирования нейропатий. Нейропатии воспроизводятся также на некоторых видах обезьян, кошках, собаках и морских свинках. Установлено, что препараты, обладающие нейропаралитическим действием, медленно метаболизируются и выводятся из организма этих животных, что может объяснить их видовую чувствительность.

Нами в эксперименте исследовано более 30 ФОС различной химической структуры на способность оказывать отдаленные нейропатии. Из них только один препарат — афос (0,0-дифенил-ацетоокси-2,2,2-трихлорэтилфосфонат) оказывал более избирательное действие, чем классический нейропаралитический агент ТОКФ [16]. Его воздействие в широком диапазоне доз (3000-25 мг/кг) сопровождается развитием параличей у кур и морских свинок после однократного воздействия. Морфологические исследования подтвердили развитие процесса демиелинизации в ЦНС и периферических аксонах. При этом афос даже в дозах 1/60 ЛД₅₀ , в отличие от ТОКФ, не вызывает видимых признаков интоксикации [17, 18].

Учитывая роль НТЭ в развитии отдаленных эффектов ФОС, при скрининге исследуемых препаратов нами была модифицирована и апробирована методика по определению активности этого фермента в опытах in vitro и in vivo в головном мозге кур, морских свинок, крыс, а также человека (секционный материал).

Установлено, что резкое (на 80–90 % по отношению к контролю) угнетение НТЭ при действии нейропаралитических ФОС (ТОКФ, афос, оксифосфонат) происходит чрезвычайно быстро — уже в первые 30–60 мин, достигая максимума к 3 дню после их введения, а затем, наблюдается тенденция к восстановлению ее активности [19].

Впервые было установлено, что ФОС, оказывающие избирательное нейротоксическое действие, практически полностью ингибируют НТЭ в головном и спинном мозге не только при введении их самому чувствительному виду животных — курам, но и морским свинкам и даже крысам. В то время как ФОС не оказывающие такого эффекта (ДДВФ, этафос, хостаквик и др.), слабо угнетают активность данного фермента у этих животных. При этом нет существенных различий в чувствительности НТЭ различных видов животных (табл. 1), что позоляет использовать крыс и морских свинок для скрининга новых ФОС на отдаленную нейротоксичность [20, 26].

Доказано, что угнетение активности НТЭ в головном мозге экспериментальных животных и человека (опыты in vitro) носит однонаправленный характер, что важно для переноса данных с животных на человека.

На модели отравления кур афосом впервые было установлено однотипное влияние яда на активность НТЭ в головном мозге, селезенке и лимфоцитах периферической крови, что может быть использовано для мониторинга воздействия нейропаралитических ФОС в натурных условиях [21].

Исследованиями итальянских ученых [22] показано, что чувствительность экспериментальной модели при изучении отдаленных нейропатий может быть существенно повышена путем использования промоторов ОНД (фенилметилсульфонилфторид — ФМСФ). Это положение было подтверждено также в наших исследованиях при выявлении нейротоксического действия у афоса, карбофоса и сумитиона [23, 24].

Так, введение ФМСФ на фоне афоса в дозе 50 мг/кг, вызывающей ингибирование НТЭ головного мозга кур на 60 % и не оказывающей ОНД, приводит к почти полному (на 90%) ингибированию НТЭ (табл. 2) и возникновению параличей.

Введение ФМСФ до афоса, наоборот, предупреждает развитие ОНД. В то же время, ФМСФ не оказывает промоторного действия по отношению к сумитиону и малатиону, что подтверждает отсутствие у этих пестицидов свойства оказывать ОНД, связанное с ингибированием НТЭ. Промоторный эффект ФМСФ в отношении афоса связан с тем, что его введение на фоне афоса увеличивает степень ингибирования НТЭ до уровня, обеспечивающего проявление ОНД. Поскольку чувствительность кур к агентам, вызывающим ОНД, ниже чем у человека, применение промотора ФМСФ может быть использовано для повышения чувствительности этой экспериментальной модели.

Впервые установлено, что наряду с угнетением активности НТЭ ранним (доклиническим) проявлением ОНД ФОС является существенное (на 30 %) замедление скорости распространения возбуждения (СРВ) по двигательным аксонам кур, а также уменьшение амплитуды потенциалов действия нервов и скелетных мышц, что регистрируется уже на 7 день эксперимента. На фоне развития параличей (21 день опыта) СРВ уменьшается на 60% по сравнению с контролем, что свидетельствует о потери возбудимости толстыми быстропроводящими нервными волокнами. При этом процесс демиелинизации в двигательных нервах был подтвержден нами морфологическими исследованиями [16–18]. В то же время угнетение активности холинэстеразы и карбоксилэстеразы не являются характерными для ФОС, обладающих нейропаралитическим действием.

По требованиям ВОЗ препараты, оказывающие ОНД, не допускаются к внедрению в практику. В связи с выявлением нами еще на стадии экспериментального изучения избирательного нейропаралитического действия у фунгицида афоса, этот препарат был запрещен для применения в сельском хозяйстве.

В настоящее время отсутствуют эффективные средства предупреждения и лечения отдаленных нейропатий, вызванных ФОС. Использование в этом плане специфических лечебных средств (холинолитики, четвертичные реактиваторы холинэстеразы) предотвращает лишь холинергические симптомы острой интоксикации. В этой связи перед нами была поставлена задача испытать ряд лечебных препаратов в качестве средств коррекции данной патологии.

Было показано, что использование в комплексной терапии центральных реактиваторов холинэстеразы (диэтиксим) с индукторами МОГС (фенобарбитал, бензонал) отдаляет и ослабляет развитие параличей у кур и морских свинок при воздействии ТОКФ и лептофоса. Этот эффект обусловлен способностью диэтиксима проникать в ЦНС и реактивировать НТЭ. Индукторы МОГС способствуют более быстрой детоксикации ФОС и их выведению из организма [14, 25]. Вместе с тем, поиск эффективных средств профилактики и лечения отдаленных нейропатий нуждается в дальнейшей разработке.

По результатам исследования механизмов нейротоксического действия пестицидов и изучению эффективности лечебных спедств при остром отравлении антихолинэстеразными пестицидами защищены 4 кандидатские и 3 докторские диссертации. Опубликовано около 200 научных работ в отечественной и зарубежной печати, получено 4 авторских свидетельства на изобретения. Результаты экспериментальных исследований неоднократно докладывались на международных конгрессах и съездах ( Россия, Венгрия, Болгария, Чешская республика, Финляндия, Испания, Франция).

Ряд исследований проведено в содружестве с институтом Физиологии им. А. Богомольца АН Украины, Военно-медицинской академией им.С.М. Кирова (г. С-Петербург), Институтом скорой помощи им. Н.В. Склифосовского (г. Москва), фирмой Хехст (Германия).

Исследования по изучению механизмов отдаленного нейротоксического действия ФОС в 1995 г. финансировались по гранту Сороса.

ЛИТЕРАТУРА
1. Ковтун С.Д., Кокшарева Н.В. Исследование функционального состояния периферического нерва и мионеврального соединения как критеоий при гигиеническом нормировании химических веществ // Гигиена и санитария. –1980. –N 6. –С. 51–53.
2. Кокшарева Н.В. Электрофизиологический анализ действия реактиваторов холинэстеразы на функцию периферического нерва и мионевральное соединение при интоксикации диметилдихлорвинилфосфатом // Фармакология и токсикология.–Киев.: Здоровье, 1978. –Вып. 13. –С. 86–91.
3. Ковтун С.Д., Кокшарева Н.В. Электрофизиологический анализ действия ряда антихолинэстеразных веществ на функцию периферического нерва и нервно-мышечную передачу теплокровных животных // Физиологический журнал. –1980. –Т. ХХVI. –N 4. –С. 541–545.
4. Кокшарева Н.В., Ковтун С.Д. Влияние фенобарбитала на функциональное состояние нервно-мышечного соединения и периферического нерва белых крыс при действии ДДВФ и афугана //Доклады Академии наук Украинской ССР.–1981.–N 2.–С. 78–81.
5. Кокшарева Н.В. Терапевтическая эффективность диэтиксима при отравлении карбаминовыми пестицидами антихолинэстеразного типа действия // Фармакология и токсикология. –1982. –N 4. –С. 81–85.
6. Кокшарева Н.В. Терапевтическая эффективность аллоксима при экспериментальной интоксикации карбаминовыми пестицидами // Экспер. и клинич. фармакология. –1992. –N 6. –С. 51–53.
7. Вековшинина С.В. Синтетические пиретроиды: основные подходы к оценке нейротоксического действия. // Актуальні проблеми екогігієни і токсикології. Матеріали науково-практичної конференції. –Київ, 1998. –С. 73–77.
8. Кокшарева Н.В., Ковтун С.Д., Каган Ю.С. Действие нового реактиватора холинєстеразы диєэтиксима на центральную нервную систему // Бюлл. экспер. биол. и медицины. –1977. –Т. LXXXIII. –N 1. –С. 29–32.
9. Кокшарева Н.В., Бадаева Л.Н. Структурно-функциональные изменения в центральной нервной системе при действии диоксикарба // Физиологический журнал. –1988. –Т. 34. –N 3. –С. 27–32.
10. Каган Ю.С., Кокшарева Н.В., Сасинович Л.М., Кривенчук В.Е. Экспериментальные данные о новом реактиваторе холинэстеразы из группы тиогидроксимовых эфиров. // Фармакология и токсикология. –1975. N 1. –С. 294–297.
11. Кокшарева Н.В., Кривенчук В.Е. Холинолитическая активность нового реактиватора холинэстеразы диэтиксима // Физиологически активные вещества.–1978. –N 10. –С. 67–70.
12. Каган Ю.С., Кокшарева Н.В., Овсянникова Л.М. Использование индукции цитохрома Р-450 как один из новых принципов терапии отравлений фосфорорганическими инсектицидами // Вестник АМН СССР. –1980. –N 8. –С. 55–58.
13. Каган Ю.С., Кокшарева Н.В., Саватеев Н.В., Линючев В.В. Влияние бензонала на устойчивость животных к действию фосфорорганических и карбаминовых соединений // Фармакология и токсикология. –1983. –N 5 –С. 100–103.
14. Кокшарева Н.В. Механизм нейротоксического действия фосфорорганических и карбаматных пестицидов, обоснование основных принципов комплексной терапии отравлений // Автореф. Дис. ... докт. биол. наук, Киев. –1985. –24 с.
15. Johnson M.K. The delayed neuropathy caused by some organophosphorus esters. Mechanism and Challenge // Crit. Rev. Toxic. –1975. –N 3. –P. 289–295.
16. Ткаченко И.И., Каган Ю.С., Кокшарева Н.В., Бадаева Л.Н. Замедленное нейротоксическое действие нового фунгицида афоса //Фармакология и токсикология.–1985.–N 6.–С. 80–83.
17. Tkachenko I.I., Kokshareva N.V., Kagan Yu.S. et al. A study of the delayed neurotoxic effect of a new organophosphorous fungicide 0,0-diphenyl-1-acetoxy-2,2,2-trichlorethylphosphonate (aphos). Communication 1. Clinical manifestations and neurotoxic esterase inhibition // Fresenius Env. Bul. –1992. –N 1. –P. 571–576.
18. Tkachenko I.I., Kokshareva N.V., Kagan Yu.S. et al. A study of the delayed neurotoxic effect of a new organophosphorous fungicide 0,0-diphenyl-1-acetoxy-2,2,2-trichlorethylphosphonate (aphos). Communication 2. Electrophysiological and morpholodical investigations // Fresenius Env. Bul. –1993. –N 2. –P. 131–136.
19. Кокшарева Н.В., Ткаченко И.И., Каган Ю.С., Зиновьева М.Л. Воздействие фосфорорганических соединений, обладающих отдаленной нейротоксичностью //Гигиена и санитария. –1988. –N 10. –С. 83–84.
20. Кокшарева Н.В., Каган Ю.С., Ткаченко И.И. Проблема отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических пестицидов (обзор) // Гигиена и санитария. –1990. –N 2. –С. 62–67.
21. Ткаченко И.И., Кокшарева Н.В., Зинченко Д.В., Каган Ю.С. Определение активности нейротоксической эстеразы в лимфоцитах периферической крови для оценки действия фосфорорганических соединений // Врачебное дело. –1989. –N 9. –С. 107–109.
22. Lotti M., Becker C.E., Aminoff M.Y. Organophosphate polyneuropaty: pathogenesis and prevention // Neurology. –1984. –34. –P. 658.
23. Каган Ю.С., Кокшарева Н.В., Ткаченко И.И. Прогнозирование отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических соединений // Токсикологический вестник. –1995. –N 2. –С. 21–24.
24. Кокшарева Н.В., Ткаченко И.И., Грабовой А.Н., Вековшинина С.В., Каган Ю.С. Исследование отдаленного нейротоксического действия карбофоса // Журнал АМН України. –1995. –Т. 1. –N 1. –С. 172–177.
25. Kokshareva N.V., Tkachenko I.I., Vekovshinina S.V., KaganY.S. Exherimental correction of the delayed neuropathy induced by organophosphates // Toxicology Letters. –Abstracts of the 35 th European Congress of Toxicology –EUROTOX-96, Alicante, Spain, 22–25 September. –1996. –P. 22.
26. Кокшарева Н.В. Проблема нейротоксического действия фосфорорганических соединений замедленного типа // Актуальні проблеми екогігієни і токсикології. Матеріали науково-практичної конференції. –Київ, 1998. –С. 130–136.