НОРМИРОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ РЕПЕЛЛЕНТОВ
НА КОЖНЫХ ПОКРОВАХ — ОСНОВА УСКОРЕННОЙ ОЦЕНКИ
ИХ ПРЕПАРАТИВНЫХ ФОРМ

Л.А. Тимофиевская, д. м. н., проф., Г.Н. Заева, д. м. н., проф.

ОАО "НИЦБЫТХИМ", НИИ Дезинфектологии Минздрава России,
Москва, Россия

Проблема защиты населения от кровососущих насекомых весьма актуальна как с медицинских, так и социальных позиций. Создание современных репеллентных средств значительно расширило возможности профилактики ряда трансмиссивных и инфекционных заболеваний. Однако, внедрение в практику новых фармакологических средств, к числу которых относятся и репелленты, может привести к росту числа побочных явлений и, соответственно, к повышению требований оценки их эффективности и безопасности.

К числу основных и модельных репеллентов, используемых с начала 40-х годов и по сей день, относятся диэтилтолуамид (ДЭТА) и диметилфталат (ДМФ). Так, например, все исследования, касающиеся энтомологического скрининга репеллентных веществ, до сих пор осуществляются в сравнении с эталонным репеллентом — ДЭТА, а наибольшее количество репеллентных препаратов создано на основе ДЭТА, ДМФ или их смесей.

Современные репеллентные препараты представляют собой достаточно сложные композиции, токсичность которых определяется, в основном, действующим веществом (ДВ).

Поскольку подходы к оценке репеллентов и препаратов на их основе не были окончательно разработаны, в задачу данного исследования входила детальная оценка степени токсичности и опасности ДЭТА, ДМФ и их препаративных форм с целью разработки методических подходов по изучению репеллентов с учетом их профилактической направленности и использования широкими слоями населения. К этому следует добавить, что количественное ограничение действующего вещества в составах рецептур репеллентных средств до настоящего времени также не имело под собой достаточно надежного гигиенического обоснования, а его разработка могла бы послужить цели ограничения объема испытаний по безопасности таких препаратов.

В связи с указанным были проведены детальные исследования степени токсичности и опасности ДЭТА и ДМФ с их нормированием в воздухе рабочей зоны и на кожных покровах, а также — ряда различных форм препаратов на основе этих репеллентов. Исследования были проведены в соответствии с ныне действующими методическими подходами по установлению гигиенических нормативов [1, 2], а при разработке ПДУ на кожных покровах мы придерживались также рекомендаций Ю.И. Кундиева и его сотрудников [3, 4]. Опыт работы в этом направлении позволил предложить методическую схему исследований новых репеллентов и препаратов на их основе.

Методические подходы были составлены группой специалистов ОАО "НИЦБЫТХИМ" и НИИ Дезинфектологии Минздрава России [5, 6] с учетом основных требований к лекарственным средствам Фармкомитета МЗ РФ и дезинфекционным средствам Федеральной Комиссии по медицинским иммунобиологическим препаратам, дезинфекционным и парфюмерно-косметическим средствам.

Методическая схема исследований в качестве 1-го этапа включает детальную оценку нового репеллента с позиций его эффективности, степени токсичности и научного обоснования пределов содержания ДВ в препаративной форме с учетом способа и сферы ее применения. Только положительный первичный скрининг эффективности является основанием для первичной токсикологической оценки репеллента, равно как и препаративной формы на его основе.

Исследования репеллентных средств рекомендуется проводить в два этапа: 1) этап первичной оценки, позволяющий отобрать репеллент по основным параметрам острой токсичности, 2) этап углубленной оценки — с учетом лимитирующих критериев при потенциально опасных путях поступления в организм.

Этап первичной оценки включает: определение DL₅₀ при введении в желудок и нанесении на кожу, при этом величины указанных параметров должны быть более 151 и 501 мг/кг соответственно; ингаляцию в насыщающих концентрациях, которая может быть менее или равной Lim_ас; видовую чувствительность, значение которой должно быть менее 3; величину ТL₅₀ при аппликации на кожу (в отдельных случаях), которая должна быть > 300 мин.; местное раздражающее действие (обязательно на кроликах) при однократном (не более 6 баллов) и при повторном (2 недели) нанесениях (< Lim_ir^cut).

В общем величины этих параметров должны соответствовать III–IV классам опасности по ГОСТ 12.1.007-76. В случае, если репеллент не соответствует этим классам опасности, дальнейшее его исследование не проводят.

Углубленное изучение токсичности репеллента включает определение кумулятивной активности при введении в желудок или нанесении на кожу, при этом I_cum должен быть > 3; сенсибилизирующей активности, которая не может превышать 30 % в опытах на морских свинках; общего токсического эффекта в хроническом (до 4 мес) опыте с определением Lim_ch и отдаленных видов воздействия (гонадо-, эмбриотропный и мутагенный), которые не должны проявляться на уровне > Lim_ch . Подробно критерии отбора репеллентов на этих этапах исследования показаны на табл. 1.

Следует отметить, что для вновь внедряемых в производство репеллентных веществ необходимо установление гигиенического норматива в воздухе рабочей зоны, а также их регистрация в Российском регистре потенциально опасных химических и биологических веществ.

Следующий этап — изучение вновь разработанной рецептуры препарата, имеющее целью оценить безопасность его при рекомендуемых режимах применения.

В соответствии с требованиями Минздрава РФ к апробации репеллентных препаратов предъявляются требования, аналогичные таковым для лекарственных средств. К их числу относятся: высокая эффективность, безвредность при рекомендуемых режимах применения и преимущества перед известными и близкими по действию средствами.

Оценку токсичности новых репеллентных средств рекомендуется осуществлять также в два этапа:
— изучение нового средства в эксперименте на лабораторных животных (доклинические исследования);
— клинические испытания, проведение которых осуществляется только после исчерпывающих данных эксперимента, подтверждающих специфическую активность и безопасность при применении в рекомендуемых режимах.

При исследовании нового репеллентного средства исходят из назначения, вида препаративной формы, обрабатываемых объектов, норм расхода и длительности применения, т.е. моделируются условия его использования на практике.

Доклинические испытания нового репеллентного средства включают оценку токсичности в условиях острого, подострого и хронического опытов с выбором потенциально опасного пути поступления его в организм. Например, при использовании электрофумигаторов, аэрозольных средств или при обработке защитных сеток обязательно изучение ингаляционной опасности.

При нанесении на кожу оценивается преимущественно кожно-резорбтивное и местно-раздражающее действие. Основные показатели и критерии отбора репеллентных средств при доклинической его оценке показаны на табл. 2.

Наиболее трудоемким по объему и времени является хронический эксперимент, длительность которого при изучении токсичности определяется сроком его применения. В случае, если эти сроки превышают 15 дней — длительность опыта составляет 4 и более месяцев. Причем, испытания проводят при воздействии дозы в 10 и более раз превышающей норму расхода, что является достаточной гарантией для выявления нeжелательных побочных эффектов.

Необходимым этапом при изучении репеллентных средств является исключение возможных отдаленных проявлений действия, к числу которых следует отнести гонадо- и эмбриотропный эффекты, мутагенное и канцерогенное действие и сенсибилизирующие свойства. Причем, если при выборе лекарственного средства, обладающего каким-либо из отдаленных эффектов, исходят из разумной оценки возможного вредного эффекта и терапевтической ценности препарата, то в случае с репеллентными препаратами любые виды специфического и отдаленного эффекта являются безусловным ограничением для их использования населением.

Новая форма препарата, прошедшая все этапы испытаний и не выявившая местного раздражающего и общего токсического действия в хронике с 10-ти кратным превышением нормы расхода, а также сенсибилизирующего эффекта, рекомендуется на этап клинических испытаний на людях-добровольцах, которые проводятся только после утверждения программы исследований. Испытания проводят на рандомизированных (по полу, возрасту, образу жизни и физической нагрузке) группах практически здоровых лиц с формированием опытной и контрольной групп, численностью не менее 30 человек. Испытания проводят строго в соответствии в патогенезом ДВ, способом, режимами и нормой расхода при продолжительности использования 1 месяц. У испытуемых оцениваются субъективные и объективные реакции с помощью врачей основных профессий.

Критериями промышленного производства и широкого применения нового препарата населением являются эффективность на уровне эталонного репеллента, безопасность при доклиническом исследовании и отсутствие побочных эффектов при испытаниях на людях-добровольцах.

Таким образом, изучение степени опасности новых репеллентных средств весьма длительно и трудоемко. В тоже время возможна и ускоренная их оценка. Поскольку основное количество репеллентных препаратов наносится на кожу, нами были предприняты работы по обоснованию ПДУ 2-х модельных репеллентов (ДЭТА и ДМФ) на кожных покровах с целью регламентации их содержания в составах препаративных форм, а также гигиенического нормирования в воздухе рабочей зоны.

Детальные исследования токсичности и безопасности ДЭТА и ДМФ согласно перечисленным требованиям показали, что по величинам DL₅₀ при ингаляции и нанесении на кожу эти репелленты относятся к IV классу мало опасных веществ, а по величине DL₅₀ при введении в желудок — ДМФ к IV, а ДЭТА к III классам опасности.

Клинические признаки отравления, отражая основную направленность биологического действия ДЭТА и ДМФ, свидетельствуют о преимущественном повреждении нервной системы, печени и почек, т.е. в силу ряда физико-химических свойств проявляется их тропность к тканям, богатым липидами.

Основные параметры токсичности ДЭТА и ДМФ показаны в табл. 3.

Исходя из параметров острой и хронической токсичности, степени кумуляции и некоторых особенностей их действия в качестве ПДК этих веществ в воздухе рабочей зоны были утверждены величины, равные 5 мг/м³ для ДЭТА и 0,3 мг/м³ для ДМФ.

В основу исследований по обоснованию ПДУ было положено изучение соотношения токсикодинамики и токсикокинетики этих веществ в организме, для чего использовали газохроматографический метод анализа ДЭТА и ДМФ в биосредах при воздействии на разных уровнях с учетом характера их действия.

Так, например, при определении Lim_ac^cut ДЭТА были использованы дозы, равные 3,0; 2,5; 2,0 и 1,0 г/кг с оценкой наиболее чувствительных функциональных показателей состояния нервной системы через 4 и 24 ч от начала аппликаций. Минимальные пороговые изменения изучаемых показателей имели место при дозе 2,5 г/кг через 4 ч от начала опыта с полным восстановлением через 24 ч. Содержание ДЭТА у этих животных определяли через 0,5; 1; 3; 6; 24 и 72 часа. Установлено значительное повышение содержания ДЭТА в период от 3 до 6 ч (до 57,5±5,45 мкг/мл) с постепенным снижением к 24 ч до уровня 4,4±1,4 мкг/мл, т.е. была отмечена четкая корреляция количества измененных показателей во времени с повышением содержания ДЭТА в крови.

В условиях хронического опыта ( 4 месяца + восстановительный период) в дозах 1500; 1000 и 500 мг/кг также проводили ежемесячную оценку состояния организма в сочетании с определением ДЭТА в биосубстратах. В качестве Lim_ch по изменению функции ряда органов и систем была принята величина, равная 1000 мг/кг. Установлено значимое (по отношению к 1-му месяцу воздействия) увеличение содержания ДЭТА в печени на 2-ом месяце опыта, которое отмечено во всех группах животных, но только на действующем уровне (1500 мг/кг) оно сочеталось с функциональными нарушениями печени, что позволило нам считать несущественным содержание ДЭТА в печени на уровне 30 мкг/г печени. Следует отметить, что максимальное содержание ДЭТА в крови на уровне Lim_ch по функциональным изменениям (1000 мг/кг) к 4-му месяцу составило 6,08±1,4 мкг/мл.

Исследования ДМФ проводили по аналогии с ДЭТА с целью сравнительного их анализа.

В качестве Lim_ac^cut ДМФ была принята величина 3000 мг/кг, наибольшее содержание ДМФ в крови при этом имело место через 6 ч (35,53±8,30 мкг/мл), а к концу 1-х суток оно составляло ~ 1/10 от количества, определяемого через 30 мин от начала воздействия. В условиях хронического опыта Lim_ch по изменению ряда функциональных показателей принята величина, равная 1000 мг/кг.

Необходимо отметить, что при оценке состояния кожных покровов с помощью комплексной дерматологической установки не было выявлено патологических изменений кожи в обоих экспериментах на протяжении всего хронического опыта.

При оценке отдаленных проявлений действия этих репеллентных веществ (гонадотропный эффект на крысах-самцах, эмбриотропное и мутагенное действие) специфические изменений ни по одному из указанных эффектов не были выявлены.

В результате проведенных исследований были разработаны и утверждены величины ПДУ, которые составили для ДЭТА — 200 мг/кг, а для ДМФ — 250 мг/кг.

С учетом имеющихся методических указаний была проведена также и оценка токсичности репеллентных препаратов. Так, при оценке более 65 различных препаративных форм на основе ДЭТА и ДМФ и их смесей была показана безопасность их применения, причем часть этих средств прошла не только доклинические исследования, но и детальные клинические испытания. В части случаев оценка препаратов проводилась с учетом содержания ДВ в крови и моче.

При этом содержание репеллента в крови животных при аггравации режима применения до 15 раз было ниже такового для воздействия репеллента, в частности ДЭТА на уровне Lim_ch .

Так, например, при изучении аэрозольного средства "Рефтамид", содержащего 16 % ДЭТА и 13 % ДМФ, в условиях длительного нанесения на кожу и при ингаляции было показано, что в дозах и концентрациях, превышающих норму расхода в 10—15 раз при отсутствии значимых изменений наиболее чувствительных показателей содержание ДЭТА в крови составляло 1,54±0,03 мкг/мл, а в моче — 18,72±3,4 мкг/мл , что в 5—11 раз ниже его количества в тех же биосубстратах на уровне Limch для чистого ДЭТА.

Таким образом, обосновав величины ПДУ у двух модельных репеллентов на кожных покровах и проведя исследование с достаточно большим количеством препаратов по полной программе с положительным результатом относительно их безопасности, были проведены расчеты коэффициента безопасности для целей применения репеллентных средств.

Расчет был проведен исходя из нормы расхода средства и количества ДВ в составе средства, которые устанавливались по энтомологическим показаниям. Максимальные и минимальные количества ДЭТА и ДМФ с учетом их эффективности в составе рецептур составляют соответственно от 7 до 30 % и от 10 до 40 %. Полученные коэффициенты находились в диапазоне величин от 40 до 9,3 для ДЭТА и от 35 до 8,8 для ДМФ, т.е. проведенные расчеты свидетельствуют о безопасности использования препаративных форм на основе этих репеллентов с позиций их общего токсического эффекта (табл. 4).

Таким образом, разработка гигиенического норматива содержания двух модельных репеллентов на кожных покровах в виде ПДУ позволяет в значительной степени ограничить объем исследований по оценке безопасности препаративных форм на их основе, исключив при этом наиболее трудоемкий хронический эксперимент, и открывает возможности ускоренного прогноза безопасного применения репеллентных средств широкими слоями населения.

ЛИТЕРАТУРА
1. Методические указания по установлению ориентировочных безопасных уровней воздействия вредных веществ в воздухе рабочей зоны", М., 1985.
2. Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны", М., 1980.
3. Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнений кожи (методические указания). М., 1980
4. Кундиев Ю.И., Диденко М.Н. "Современное состояние и развитие исследований по оценке дермальной токсичности пестицидов". // Tag. -Ber. Akad. Landwirtsch-Wiss. DDR, 1990, 285, 43–48.
5. Методические рекомендации по отбору и изучению биологической активности и токсичности репеллентов. М., 1987.
6. Заева Г.Н., Мальцева М.М., Рысина Т.З., Юрченко В.В., Березовский О.И. Тимофиевская Л.А. "Совершенствование методических подходов к изучению токсичности и опасности репеллентов и препаратов на их основе"// В ж. "РЭТ-инфо" N 1(17), март, 1996, С. 12–15.