МЕХАНИЗМЫ ИНТОКСИКАЦИЙ

УДК 576. 314: 615.9

ВЛИЯНИЕ ДИХЛОРДИВИНИЛФОСФАТА НА СТРУКТУРУ ПЛАЗМАЛЕММЫ ГЕПАТОЦИТОВ

О.И. Лебедь, канд. биол. наук

Киевский институт фармакологии и токсикологии АМН Украины

Согласно существующим представлениям [1, 2], в основе токсического действия фосфорорганических соединений (ФОС) лежит ингибирорваие ими ацетилхолинэстераз и, как результат, активация избытком ацетилхолина холиноэргических рецепторов. Вместе с тем целый ряд клинических проявлений и патофизиологических звеньев процесса интоксикации ФОС не укладываются полностью в классическую антихолинэстеразную концепцию.

В этой связи привлекают внимание плазматические мембраны клеток, поскольку в настоящее время не вызывает сомнений, что эти структуры играют исключительную роль в реализации воздействия внешних факторов в физиологический ответ клетки. Более того, показано [3], что активаторы и ингибиторы мембранозависимых трансдуцирующих регуляторных систем клетки, в часности полифосфоинозитидной, по разному влияющие на состояние клеточных систем, имеют существенные отличия в направленности нарушения свойств плазматической мембраны. Исходя из этого, очевидна актуальность детального исследования характера изменений в структуре внешней мембраны клетки, возникающих под влиянием физиологически активных веществ.

Учитывая гепатотоксические свойства ФОС [4, 5], представляло интерес изучить молекулярные механизмы и направленность структурных перестроек плазмалеммы гепатоцитов, обусловленных действием дихлордивенилфосфата, в чем и заключалась цель настоящей работы.

Материалы и методы

Плазмалемму гепатоцитов выделяли из печени белых крыс [6] и суспендпровали в буфере Трис HCl (pH=7,5 М=7 мМ). Концентрация мембран в экспериментах составляла 0, 1 мг/мл по белку, который определяли по Лоури [7].

Флуоресцентные исследования влияния дихлордивинилфосфата (ДДВФ) на структуру плазмалеммы гепатоцитов (ПГ) и обработку спектральных данных осуществляли в соответствии с описанными методиками [3, 8]. Для флуоресцентного зондирования мембран использовали 1-анилино-8-нафталинсульфоната магниевую соль (АНС) и пирен (фирма "СЕРВА", Германия) в концентрациях 5 мкМ. Концентрацией ДДВФ варьировали в диапозоне от 0,05 до 1,0 мМ

Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре "Hitachi" — MF-4 (Япония). Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре "Shimadzu" — MPS-5000 (Япония).

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Согласно данным, приведенным в таблице, ДДВФ индуцирует уменьшение интенсивности белковой флуоресценции ПГ и увеличение полуширины спектра без изменения положения максимума и асимметрии спектральной линии. Исходя из положений флуоресцентно-спектральной модели состояния люминофоров в белках [9], увеличение полуширины спектра должно свидетельствовать о повышении гетерогенности белковых люминофорных групп, что косвенно указывает на разрыхление макромолекул. В то же время снижение интенсивности флуоресценции может быть обусловлено различными причинами, которые будут рассмотрены при обсуждении результатов, полученных другими флуоресцентными методами.

ДДВФ не влияет на параметры флуоресценции анионного зонда АНС, однако вызывает уменьшение эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии (ИРПЭ) между донорно-акцепторной парой (ДАП): белковые люминофоры — флуоресцентные зонды (АНС), что свидетельствует о возрастании расстояния между люминофорными группами и АНС. Максимум флуоресценции белков ПГ находится при 327—328 нм, что позволяет говорить [9] о преимущественной локализации триптофановых остатков, дающих основной вклад в суммарный спектр белковой флуоресценции, в глубине макромолекул, тогда как АНС располагается у поверхности последних. Таким образом, понижение эффективности ИРПЭ с люминофоров белков на АНС, по всей вероятности, является результатом уже упоминавшегося разрыхления белковых макромолекул под действием ксенобиотиков, вследствие чего и увеличивается расстояние между белковыми триптофанилами и зондом. Следует полагать, что гидрофобное ядро макромолекул остается компактным, поскольку в противном случае наблюдался бы длинноволновый сдвиг полосы флуоресценции белков. Напомним, что максимум флуоресценции поверхностных триптофанилов расположен при 338–340 нм, а внутренних — при 330—332 нм, и квантовый выход свечения последних ниже, чем первых [9].

Обработка плазмалеммы гепатоцитов ДДВФ приводит к уменьшению полярности зон локализации пирена и к увеличению соотношения интенсивностей флуоресценции эксимерной и мономерной (степени эксимеризации) форм зонда в мембранах. Нами установлена нелинейность зависимости соотношения интенсивностей флуоресценции эксимерной и мономерной фракций пирена в ПГ от концентрации зонда, что означает его способность встраиваться в липиды и белки мембран, поэтому однозначно интерпретировать повышение степени эксимеризации как результат снижения микровязкости гидрофобных участков липидного матрикса. Этот эффект может быть обусловлен перераспределением пирена в сторону повышения его концентрации в липидах, так как в белках зонд не эксимеризуется. Однако для реализации предполагаемого перераспределения необходимо, по меньшей мере, чтобы гидрофобность мест локализации пирена в белках понизилась, а в липидном матриксе повысилась. Анализ данных измерения белковой флуоресценции свидетельствует об отсутствии нарушения гидрофобности ядра белковых макромолекул, что делает такой процесс маловероятным. Следовательно, не исключая до конца возможности вклада такого фактора в результаты флуоресцентных измерений, есть основания полагать, что увеличение соотношения интенсивностей флуоресценции эксимерной и мономерной форм зонда в ПГ при действии на нее ДДВФ определяется главным образом повышением степени эксимеризации пирена, т. е. уменьшением микровязкости глубинных областей липидного матрикса. Поэтому понижение значения индекса полярности отражает в первую очередь изменение полярности в соответствующих участках мембранных липидов, так как нарушение этого показателя в гидрофобных зонах белковых макромолекул неизбежно повлекло бы за собой сдвиг полосы флуоресценции белков, что не подтверждается экспериментальными данными. Это, в свою очередь, свидетельствует о маловероятности перераспределения гидрофобных молекул пирена в липидную компоненту мембран.

При действии ДДВФ на ПГ фиксируется уменьшение эффективности ИРПЭ с люминофоров белков на пирен. Этот эффект может быть вызван двумя причинами: увеличением расстояния между белковыми люминофорами и пиреном, встроенным в макромолекулы, а также пиреном, локализованным в липидах. Выше было сказано, что основной вклад во флуоресценцию белков дают внутринние макромолекулярные триптофанилы. Отсюда понятно, что удаление поверхностных участков белковых полимеров с расположенными там триптофанилами, флуоресцирующими тирозилами и АНС от ядра макромолекул, где встроен пирен, должно в меньшей мере влиять на изменение вероятности ИРПЭ с белковых люминофоров на пирен, чем на АНС. Между тем экспериментальные результаты противоречат этому. Следовательно, правомочно считать, что наблюдаемое изменение эффективности ИРПЭ на пирен обусловлено как разрыхлением мембранных белков, так и удалением их люминофорных групп от связанного с липидами зонда. Последнее может происходить лишь за счет уменьшения уровня погружения ("всплывания") белков в липидный матрикс. Безусловно, такого рода эффект должен привести к возрастанию ИРПЭ с люминофоров белков на АНС, локализованный у поверхности мембран, что, очевидно, и имеет место. Однако этот процесс нивелируется более выраженным вкладом нарушения конформации мембранных белков в изменение ИРПЭ между белковыми люминофорными группами и зондом. "Всплывание" белков из липидного матрикса определяет в то же время увеличение контакта их поверхностных люминофоров с молекулами воды, что может быть одной из причин наблюдаемого тушения белковой флюоресценции.

Таким образом, при действии ДДВФ на ПГ наблюдается разрыхление мембранных белков, не затрагивающее гидрофобного ядра макромолекул, и снижение уровня их погружения в липидный матрикс, а также уменьшение полярности и микровязкости глубинных участков липидного бислоя.

Столь значительные нарушения конформации и физико-химических характеристик плазматической мембраны неизбежно должны сказаться на ее функциях, во многом определяющих жизнедеятельность клетки, как то: структурно-функциональном состоянии мембраносвязанных элементов регуляторных сигнальных систем, функционировании ионных каналов, активном и пассивном транспорте через мембрану различных веществ, активности мембранных ферментов и др. Интересно отметить, что изменения в структуре внешней мембраны клетки генерализуются через цитоскелет на мембраны других клеточных органел (при этом, естественно, нарушая их функции), в том числе и на ядерную [10]. Такого рода процесс, по всей видимости, может опосредованно обусловить нарушения жизнедеятельности клетки, связанной с состоянием генетического аппарата.

ЛИТЕРАТУРА
1. Голиков С. Н. , Розенгарт В. И. Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений. —Л. : Медгиз, 1960. —112 с.
2. Каган Ю. С. Токсикология фосфорорганических пестицидов. —М. : Медицина, 1997. —288 с.
3. Структурные эффекты в сарколемме кардиомиоцитов при действии модуляторв полифосфоинозитидной системы /О. И. Лебедь, В. В. Жирнов, Н. А. Зуева и др.// Физиол. журн. СССР. —1990. —Т. 76, N 10. —С. 1290—1295.
4.Федоров С. М., Федорова Т. Н., Перекисное окисление липидов при кожно—резорбтивном действии некоторых фосфорорганических пестицидов. // Вести дерматол. и венерол., 1988. —N 7. —С. 14—17.
5. Watanabe, Hirohi K. , Hoskins B. , Ho I. K. Selective inhibitory effect of organophosphates on UDP —glucuronyl transferase activities in rat liver microsomes // Biochem. pharmacol.—1986. —Vol. 35, N 3. —P. 455—460.
6. Медди Э. Биохимическое исследование мембран. —М.: Мир, 1979. —350 с.
7. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. H. Lowry, G. C. Resebroundt, A. L. Farr, R. J. Randall // J.Biol. Chem. —Vol. 193, N 1.—P. 263—275.
8. Лебедь О. И., Примак Р. Г., Тищенко В. И. Комплексообразование бычьего сывороточного альбумина с фосфатидилхолиновыми липосомами // Укр. биохим. журн. —1989. —T. 61, N 3 —С. 101—106.
9. Бурштейн Э. А. Собственная люминесценция белка / Итоги науки и техники. Сер. биофизика // ВИНИТИ. —М., 1977. —T. 7. —190 с.
10. Конев С. В. Структурная лабильность мембран и регуляторные процессы. М.: Наука и техника, —1987. —240 с.


| Содержание |