УДК 574.64

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МОЛЕКУЛЯРНЫХ, НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ БИООБЪЕКТОВ К КАТИОНАМ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

В.В. Прокопенко, Ю.Н. Набока, Л.А. Метелица, к.б.н., С.Е. Могилевич, к.б.н.,Т.О. Гуща, к.ф.-м.н., А.И. Луйк, д.м.н.

Институт биоорганической химии и нефтехимии
Национальной Академии Наук Украины

При разработке новых методов экологического мониторинга окружающей среды особое внимание уделяется поиску чувствительных биообъектов. Как правило, для этих целей используются различные виды животных и растений [1]. В настоящей работе оценивалась возможность использования белковых молекул и клеток животных и человека, а также модельных надмолекулярных систем для биотестирования факторов, загрязняющих окружающую среду. В частности, исследовалась чувствительность сывороточного альбумина человека (САЧ), лейкоцитов крови животных, а также системы транскрипции in vitro, основанной на применении вирусной ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7, к катионам тяжелых металлов: Сd²⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Cu²⁺ и Pb²⁺.

Наши предыдущие исследования [2;3] показали, что молекула САЧ, структура которой детально изучена [4–6], тонко реагирует конформационными изменениями на присутствие чужеродных соединений в своем микроокружении. Это позволяло предполагать, что САЧ является удобным объектом для биотестирования наличия вредных химических факторов во внешней среде.

В предыдущих работах, которые обобщены в специальной монографии [7], нами также была показана значительная чувствительность к влиянию физических и химических факторов клеток крови, в частности, различных типов лейкоцитов человека и животных. Так, было установлено, что физиологически активные вещества различной природы в концентрациях 10^-4—10^-7моль/л существенно влияют in vitro на такие иммунологические клеточные реакции, как фагоцитоз нейтрофилов и розеткообразование Т-лимфоцитов.

Система транскрипции in vitro в качестве надмолекулярного биообъекта представляет особый интерес, поскольку она моделирует один из ключевых процессов, происходящих на уровне генома, весьма чувствительного к воздействию вредных факторов внешней среды.

Материалы и методы исследования

Лиофилизированный альбумин человеческой сыворотки (Reanal, >95 %), предварительно освобождали от эксимерных фракций гель-хроматографией на сефадексе G-150. Белок растворяли в смеси 0,9 % NaCl с 0,15 М натрий-фосфатного буфера (9:1). Взаимодействие альбумина с катионами тяжелых металлов исследовали в растворе, содержащем 2 % (в/об) САЧ, при физиологическом значении pH 7,4. Молекулярную массу альбумина принимали равной 68 kDa [2].

В экспериментах с помощью 64-канального лазерного спектрометра Malvern Digital Correlator type 7023 измеряли автокорреляционную функцию интенсивности излучения Ar лазера, рассеянного исследуемым образцом под углом a=90° . Температуру образца 298 К выдерживали с точностью до 0,1 К. По экспериментальным данным рассчитывали нормализованную корреляционную функцию первого порядка, которую затем анализировали методом регуляризации по Тихонову с целью получения средней скорости затухания G корреляционной функции поля. Эффективный коэффициент диффузии рассчитывали из соотношения:

D = G / k² ,

где k = 4(пи)n sin(a/2) / l — величина рассеянного вектора, n — показатель преломления растворителя, l = 488 нм — длина волны падающего света. Затем был рассчитан гидродинамический диаметр эквивалентной сферы в предположении о справедливости уравнения Стокса-Эйнштейна:

d = K T / 3(пи) h D,

где K — постоянная Больцмана, T — абсолютная температура, h — вязкость буферного раствора, измерявшаяся капиллярным вискозиметром. Прочие детали данного метода были подробно описаны нами ранее [8].

Реакцию образования Т-розеток проводили на лимфоцитах, выделенных из крови человека путем гемолиза ее эритроцитарной фракции [9–11]. Полученные клетки дважды отмывали средой N 199 и доводили их концентрацию до 4•10⁷ клеток в 1 мл. К 0,05 мл полученной суспензии прибавляли 0,01 мл раствора соли исследуемого катиона. После инкубации клеток с катионами при комнатной температуре в течение 40 мин к полученному объему прибавляли 0,05 мл суспензии трижды отмытых нативних эритроцитов барана в соотношении лимфоцит:эритроцит = 1:30. Пробы оставляли на ночь в холодильнике при температуре (4,0 + 0,1) °С. После этого отбирали надосадочную жидкость и к осадку клеток прибавляли глутаральдегид в объеме 0,025 мл для фиксации образовавшихся «розеток» (10 мин). Затем клетки ресуспендировали в 0,1 см среды N 199, готовили мазки, окрашивали их по Романовскому-Гимзе и микроскопировали при увеличении 900 раз. Долю розеткообразующих клеток определяли при подсчете не менее 100 лимфоцитов. Розеткообразующим считали лимфоцит, к поверхности которого прикреплялось не менее трех эритроцитов.

Фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали в крови крыс известным методом [12]. Для этого смешивали равные объемы гепаринизиованной крови и суточной культуры Staph. aureus (штамм 1474) с концентрацией 1 млрд микробных тел в 1 мл физиологического раствора. Инкубацию клеток с солями исследуемых катионов проводили так же, как и в предыдущем случае. Полученную взвесь инкубировали в термостате в течение 1 часа при 37 °С. Далее приготовляли мазки, фиксировали и окрашивали их по Романовскому-Гимзе. Количество фагоцитов подсчитывали в расчете на 100 нейтрофилов.

Эксперименты по изучению транскрипции in vitro проводили по известным методикам [13, 14] с некоторыми модификациями. В качестве ДНК-матрицы использовали плазмиду pGEM-3Zf (+), содержащую промотор Т7. ДНК плазмиды расщепляли рестрикционной эндонуклеазой Nde I, экстрагировали смесью фенол-хлороформ, осаждали этанолом и ресуспендировали в 10 мМ Трис-HCl (pH 7,8), содержащем 1мМ ЭДТА до конечной концентрации 1мг/мл. Инкубационная смесь для транскрипции (10 мкл) содержала 40 мМ Трис-HCl (pH 7,9), 10 мМ MgCl₂, 50 мкг/мл БСА, по 0,5 мМ аденозинтрифосфата, гуанозинтрифосфата, цитидинтрифосфата и уридинтрифосфата, [U-14 C]GTP (радиоактивность 5•10⁴ имп/мин), 10 мМ дитиотреитола, 0,4 ед/мкл ингибитора РНКаз, 0,2 мг/мл линеаризированной ДНК-матрицы, исследуемую соль тяжелого металла. Реакцию инициировали добавлением Т7 РНК-полимеразы до конечной концентрации 0,4 ед/мкл. Смесь инкубировали 30 минут при 30 °С. После инкубации отбирали 8 мкл, наносили на фильтр Ватман 3ММ, промывали 5 % трихлоруксусной кислотой и сушили на воздухе. Радиоактивность кислотонерастворимого материала определяли в сцинтилляционной жидкости ЖС-1 на сцинтилляционном счетчике «1219 RACKBETA» (LKB, Швеция).

Катионы тяжелых металлов во всех экспериментах исследовали в виде хлоридов. Поскольку концентрация буферного раствора в модельных средах намного превышала концентрацию исследуемых солей, влиянием анионов можно было пренебречь.

Результаты и их обсуждение

Полученные результаты представлены в таблице.

При воздействии исследуемых катионов не было отмечено существенных изменений формы и размеров мономерной молекулы САЧ, как это наблюдалось нами ранее при изучении взаимодействия данного белка с лекарственными веществами [3, 8]. Средний гидродинамический стоксовский диаметр глобулы составлял 59—62 A, что соответствует данным рентгенструктурного анализа [5–6]. Наряду с частицами указанного размера в исследуемых растворах САЧ определяются частицы с диаметром 115—120 A, соответствующие димерной фракции белка [2]. В присутствии исследуемых катионов площадь пика данной фракции существенно снижается, что свидетельствует об уменьшении степени димеризации САЧ. Процесс димеризации, как оказалось, весьма чувствителен к воздействию катионов тяжелых металлов. Его достоверное торможение наблюдается при концентрациях катионов, существенно меньших, чем их ПДК в (питьевой ?) воде: для Сd²⁺ и Co²⁺ на 2 порядка, для Zn²⁺ и Pb²⁺ на 3 порядка, а для Cu²⁺ на 4 порядка ниже предельно допустимой.

Примерно с такой же чувствительностью реагирует на присутствие исследуемых катионов фагоцитарная реакция нейтрофилов. Причем, если САЧ наиболее чувствителен к Cu²⁺, то реакцию фагоцитоза более активно угнетают Co²⁺ (на 3 порядка ниже ПДК) и Pb²⁺ (на 4 порядка ниже ПДК). Вместе с тем Zn²⁺ влияет на нейтрофильный фагоцитоз только в концентрациях, лежащих на уровне предельно допустимых. Аналогичной сравнительно небольшой чувствительностью обладает реакция Т-лимфоцитарного розеткообразования к Сd²⁺ и Co²⁺, в то время как прочие исследуемые катионы тормозят этот процесс в концентрациях на 3 порядка меньших ПДК.

Достаточно высокой чувствительностью к катионам тяжелых металлов характеризуется и процесс транскрипции in vitro, который угнетается катионами Сd²⁺ и Co²⁺ в концентрациях на 1 порядок меньшей ПДК, Pb²⁺ — на 2 порядка меньшей ПДК, а Cu²⁺ и Zn²⁺ — на 3 порядка меньшими ПДК. Интересно, что соотношения чувствительностей к различным катионам транскрипции in vitro и Т-лимфоцитарного розеткообразования близки между собой.

Таким образом, исследованные реакции и соответствующие биообъекты молекулярного, надмолекулярного и клеточного уровня могут использоваться для высокочувствительной неспецифической индикации уровней загрязнения внешней среды катионами тяжелых металлов. При этом важно, что на данных моделях воспроизводятся реальные механизмы отрицательного влияния данных химических факторов на детоксикационные транспортные системы крови, клеточный иммунитет и процессы протекающие в геноме.

Настоящая работа выполнялась в рамках проекта N 486, финансируемого Украинским научно-технологическим центром, а также проекта N 01.03/04646 Программы НТР Миннауки Украины.

ЛИТЕРАТУРА
1. Никаноров А.М., Кулидов А.В. Биомониторинг металлов в пресноводных экосистемах. —Л.: Гидрометеоиздат, 1991. —312 с.
2. Луйк А.И., Лукьянчук В.Д.. Сывороточный альбумин и биотранспорт ядов. —М.: Медицина, 1984. —296 с.
3. Luik A.I., Naboka Yu.N., Mogilevich S.E. e.a. The influence of pH alteration pharmacological modulators of adenylate cyclase system on human serum albumin conformation. - J. Biomolecular Structure and Dynamic. —1998. —v. 16, N 1. —pp.109—114.
4. Hushcha T.O., Luik A.I., Sperkach V.S. Albumin study by acoustic relaxation spectroscopy. - Journal of Molecular Structure. —1995. —v. 348, N 1 —pp. 25—28.
5. 5. He, D.C. Carter. Atomic structure and chemistry of human serum albumin. —Nature. —1992. —v. 358, N 2. —pp. 209—215.
6. Olivieri, A.F. Craievich. The subdomain structure of human serum albumin in solution under different pH conditions studied by small angle X-ray scattering. —Eur. Biophys. J. —1995. —v. 24, N 1. —pp. 77—84.
7. Химия биорегуляторных процессов. / Под ред. В.П. Кухаря и А.И. Луйка —Киев: Наукова думка, 1992. —368 с.
8. Luik A.I., Naboka Yu.N., Mogilevich S.E. e.a. Study of human serum albumin structure by dy-namic light scattering: two types of reactions under different pH and interaction with physiologi-cally active compounds. —Spectrochimica acta. Part A. —1998. —v. 54. —pp. 1503—1507.
9. Лимфоциты. Методы: Пер.с англ./Под.ред.Дж.Клауса. —М.: Мир, 1990. —398 с.
10. Иммунологические методы: Пер. с англ./Под ред.Г.Фримеля. —М.: Мир, 1987. —518 с.
11. Закс А.С., Быкова А.А., Ючинова Т.А. Экспресс-микрометод определения количества Т- и В-лимфоцитов в крови человека . —Лаб. дело. —1986. —N 4. —С. 242—243.
12. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. — М.: Медицина, 1968, с. 79—80.
13. Davanloo P., Rosenberg A.H., Dunn J.J., and Studier F.W. Cloning and expression of the gene for bacteriofage T7 RNA polymerase. —Proc. Natl. Acad. Sci. —1984. — v. 81. —pp. 2035—2043.
15. Krieg P.A., Melton D.A. In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase. — Methods Enzymol. — 1987. — N 155. —pp. 397.