УДК 615.9:616.36-099:576.2.24:577.161.3

ВЛИЯНИЕ АЛЬФА-ТОКОФЕРОЛАЦЕТАТА И ЕГО ПРОИЗВОДНОГО НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И СОДЕРЖАНИЕ НЕКОТОРЫХ КОМПОНЕНТОВ МЕМБРАН ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ

Е.С. Волошина, канд. биол. наук; Л.Б. Бондаренко, доктор биол.наук; В.Н. Коваленко, доктор биол. наук; А.М. Шаяхметова

Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины

И.В. Кузьменко, канд. биол. наук

Институт биохимии НАН Украины им. О.В. Палладина

В механизмах формирования токсического гепатита значительное место занимает активация перекисного окисления липидов (ПОЛ), что подробно исследовано на примере классического гепатотоксина — тетрахлорметана (ТХМ). Показано, что электрофильные производные ТХМ и свободные радикалы, образующиеся в результате биоактивации в цитохром-Р450-зависимых реакциях, инициируют процессы аутокаталитического переокисления, атакуя боковые цепочки ненасыщенных жирных кислот липидов мембран эндоплазматического ретикулума [1—3].

Помимо липидов, реактивные промежуточные вещества способны ковалентно связываться и с другими макромолекулами: нуклеиновыми кислотами, белками, включая белки самого Р450, что может обусловливать повышение токсичности соединений [4].

Такие нарушения способны оказать существенное влияние на содержание и функционирование цитохрома Р450, поскольку в экспериментах на различных видах млекопитающихся показано, что белковые кластеры Р450 локализованы глубоко в мембране эндоплазматического ретикулума [5].

Ферменты Р450 участвуют в метаболизме как ксенобиотиков, так и ряда эндогенных соединений, в частности, в биосинтезе и деградации стероидов, в том числе холестерина, и катаболизме жирних кислот [5]. Поэтому эффект ингибирования Р450, очевидно, является весьма существенным фактом с точки зрения структурной интеграции мембран.

Показано, что введение пиразола и ацетона крысам приводит к потенцированию токсической биотрансформации ТХМ и увеличению его гепатотоксичности в 15—30 раз [6] .

Исходя из вышеизложенного, представлялось целесообразным изучить возможность коррекции нарушений процесов ПОЛ, содержания цитохромов Р450 и b₅, а также холестерина в мембранах эндоплазматического ретикулума, при хронических токсических поражениях печени комбинацией ТХМ и этанола в условиях использования альфа-токоферолацетата и его производного с модифицированной боковой цепочкой.

Материалы и методы. Эксперименты проводили на белых крысах-самцах массой 180—250 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария. Поражение печени вызывали введением в желудок 1 %-го раствора этанола из расчета 35 мг/кг и через 20 мин — 20 %-го масляного раствора ТХМ из расчета 2 мл/ кг массы тела трижды в неделю на протяжении 45 суток [7]. Альфа-токоферолацетат (опыт 1) и его производное (опыт 2) вводили внутрижелудочно в эквимолярных дозах — 15 мг/кг и 10 мг/кг соответственно, ежедневно в течение последних 10 дней введения гепатотоксинов. На 46-й день эксперимента животных забивали цервикальной дислокацией.

Печень гомогенизировали в 0,05 М Tris-HCl (pH 7,5). Микросомальную фракцию получали методом дифференциального центрифугирования [8]. Интенсивность индуцированного накопления малонового диальдегида определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой [9]. Содержание цитохромов b₅ и P450 определяли согласно [10]. Белок измеряли по методу Лоури [11]. Содержание различных фракций холестерина исследовали по методу [12]. Статистическую обработку данных проводили согласно [13].

Результаты и их обсуждение. Результаты изучения скорости накопления малонового диальдегида во фракции микросом клеток печени представлены на табл. 1. Полученные данные свидетельствуют о том, что интенсивность спонтанного и индуцированного НАДФН и аскорбиновой кислотой накопления продуктов взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой при данной модели токсического гепатита возрастает, соответственно в 2,3, 1,5 и 1,9 раза. Введение как альфа-токоферолацетата, так и его производного оказывает положительное влияние на скорость спонтанного и неферментативного ПОЛ, практически нормализуя эти процессы до уровня интактных животных. При этом антиоксидантная активность исследуемого аналога альфа-токоферолацетата превосходит действие фармакопейного препарата.

Активация ПОЛ приводит к глубокой деструкции мембран эндоплазматического ретикулума [14], характеризующейся обнажением гидрофобных компонентов, окислением сульфгидрильных групп ферментов, модификацией гемовой группировки в составе активного центра цитохрома Р450 и превращением гемопротеина в неактивную форму (цитохром Р420) [1]. Данные табл. 2 свидетельствуют об уменьшении содержания цитохрома Р450 на 30 % и отсутствии достоверных изменений в содержании цитохрома b₅. Это вполне согласуется с данными литературы [15] о том, что цитохром Р450, расположенный в гидрофобной зоне микросомальных мембран, в большей степени подвергается ингибированию по сравнению с цитохромом b₅, локализованном во внешней гидрофильной зоне мембран. Очевидно, истощение адаптивных возможностей организма в результате цитотоксического действия этанола и ТХМ приводит к угнетению микросомальных оксигеназ и снижению скорости биотрансформации как ксенобиотиков, так и эндогенных субстратов. Введение производных витамина Е препятствует снижению содержания цитохрома Р450 в печени.

В табл. 3 приведены результаты изучения влияния токсического гепатита и введения альфа-токоферолацетата и его аналога на содержание свободного, общего и этерифицированного холестерина во фракции микросом клеток печени крыс. Наблюдается снижение содержания общего холестерина в мембранах микросомальной фракции гепатоцитов, отравленых сочетанным действием этанола и ТХМ. Оно может рассматриваться как результат взаимодействия холестерина со свободными радикалами — продуктами биотрансформации этанола и ТХМ с образованием дегидро-, хлор- и кетопроизводных холестерина [12, 16], а также как следствие снижения содержания цитохрома Р450 и ингибирования цитохром Р450-зависимых ферментов, осуществляющих превращение ланостерина в холестерин [17]. Введение альфа-токоферолацетата и его аналога частично нормализует содержание общего холестерина в мембранах эндоплазматического ретикулума клеток печени.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов показана способность аналога альфа-токоферолацетата оказывать корригирующее влияние на структурно-функциональные свойства мембран эндоплазматического ретикулума в условиях хронического поражения печени ТХМ и этанолом, а именно: снижать процессы липопереокисления, нормализовать содержание цитохрома Р450 и холестерина. Установлено также, что модификация боковой части токоферолацетата не влияет на его Е-витаминную активность.

Литература
1. Губский Ю.И. Коррекция химического поражения печени. —Киев: Наукова думка,1989. —157 с.
2. Cheeseman K.H., Almano E.F., Tomasi A., Slater T.F. —Environ. Health. Perspect. —1985. —Vol. 64. —P. 85–101.
3. Sony M.G., Mehendale H.M. —Fundam. Appl. Toxicol. —1993. —N 22. —P. 442–450.
4. Benet L.Z., Sheiner L.B. —In: The Pharmacological Basis of Therapeutics (A.G.Gilman, L.S.Goodman, T.W.Rall, F.Murad, Eds.). 1985. —Mac Millan, New York. —P. 3–34.
5. DeMatteis F. —In: Heme and Hemoproteins (F.DeMatteis, W.N.Aldridge, Eds.). 1978. —Springer-Verlag, New York. —P. 95–128.
6. Raucy J.L. —Toxicology, 1995. —Vol. 105. —P. 217–223.
7. Методические рекомендации по экспериментальному изучению желчегонной, xолеоспазматической, холелитиазной и гепатопротекторной активности новых лекарственных средств.—Под ред. С.М. Дроговоз, С.И. Сальникова, Н.П. Скакун, В.В. Слышков. —К.: ФК МЗ Украины, —1994. —46 с.
8. Guenderich F.P. Analysis and Characterisation of Enzymes// Principles and Methods of Тoxicology, Ed. by A.W.Hayes, Raven Press, Ltd., New York, 1989.—P. 777–814
9. Современные методы в биохимии/ ред. В.Н.Орехович, М: Медицина, 1977. —391с.
10. Оmura T., Sato R. The Carbon Monoxide-binding Pigment of Liver Microsomes. // J. Biol. Chem. —1964. —Vol. 239, N 7. —P. 2379–2385.
11. Lowry O.H., Rosenbrough H.J., Parr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. —1951. —Vol. 193. —P. 265–275.
12. Колб В.Г., Камышников В.С. Клиническая биохимия. —Минск: Беларусь, 1976.—312 с.
13. Ойвин И.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований // Патология, физиология и экспериментальная терапия. —1960. —N 4. —С. 76–81.
14. Зверинский И.В., Бушма М.И., Легонькова Л.Ф., Лукиенко П.И., Эйсмонт К.А. Коррекция альфа-токоферолом в сочетании с никотинамидом и метионином нарушений процессов биотрансформации ксенобиотиков при ультразвуковом повреждении печени // Бюл. эксперим. биологии и медицины. —1997. —Т. 123, N 4. —С. 420–423.
15. Арчаков А.И. Микросомальное окисление.—Москва, 1975. —375 с.
16. Fanelli S.L., Castro G.D., Castro J.A. Cholesterol interaction with free radicals produced from carbon tetrachloride or bromtrichloromethane by either catalytic decomposition or via liver microsomal activation// Chem.Biol.Interact. —1995. —Vol. 98, N 3. —P. 223–236.
17. Rodrigues R.J., Acosta D.Jr. Comparison of Ketoconazole and Fluconazole —induced hepatotoxicity in primary culture system of rat hepatocytes // Toxicology, —19951995. —Vol. 96, N 2. —P. 83–89.