ЛЕЧЕНИЕ ИНТОКСИКАЦИЙ

УДК 576.312.31:615.372

ВПЛИВ НІФЕДИПІНУ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ФРАКЦІЙ ЯДЕРНОГО ХРОМАТИНУ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ ЗА УМОВ ІНТОКСИКАЦІЇ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ

Є.Л. Левицький, докт. біол. наук, Р.Г. Примак, Г.Г. Горюшко, канд. хім. наук, Ю.І. Губський, чл.-кор. АМН України, О.М. Марченко, канд. біол. наук

Інститут фармакології та токсикології АМН України, м. Київ

За умов хімічного та радіаційного забруднення довкілля проблема пошуку речовин антиоксидантної природи, здатних коригувати порушену в результаті вільнорадикальних ушкоджень структурно-функціональну організацію ядерного хроматину, тобто таких, яким притаманна генопротекторна активність, є дуже актуальною. Існування тісного зв’язку між геномозахисними властивостями фармакологічних препаратів та наявністтю у них антиоксидантного ефекту щодо процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) у хроматині відображене у низці наукових повідомлень останніх років [1—4].

З метою глибшого вивчення механізмів геномозахисної дії фармпрепаратів з антиоксидантними властивостями нами започатковано серію експериментів з препаратами різного ступеня антиоксидантної активності [5—8].

Нашу увагу привернув препарат з групи блокаторів кальцієвих каналів — ніфедипін. За даними літератури [9], препаратам цієї групи притаманна певна антиоксидантна активність щодо процесів ПОЛ у біомембранах. Раніше [1] нами було досліджено вплив іншого представника зазначеної групи ліків — верапамілу за умов ушкодження хроматину хлорофосом, й встановлено, що цей препарат не виявляв геномозахисної дії, а навіть посилював дію отрут. З метою отримання більш повної картини впливу блокаторів кальцієвих каналів на порушену в результаті інтоксикації структурну організацію ядерного генома клітин печінки, у даній роботі досліджували структурно-функціональний стан фракцій ядерного хроматину печінки щурів за умов отруєння тетрахлорметаном (ТХМ) та введення ніфедипіну.

Матеріали та методи

Дослідження проводили на щурах-самцях лінії Вістар 3 міс віку масою 150—200 г. ТХМ вводили внутрішньоочеревинно в дозі 1 ЛД50 (1,75 мг/кг маси тіла), ніфедипін — двічі, через 0,5 та 3 год після введення отрути також внутрішньоочеревинно у дозі 0,2 мг/кг. Тварин декапітували під легким ефірним наркозом через 24 год від початку експерименту. Фракції репресованого (РХ) та транскрипційно активного хроматину (ТАХ) з печінки виділяли за методикою [10]. Для характеристики вільнорадикальних процесів ліпопереокислення у хроматині визначали вміст дієнових кон’югатів (ДК) при спонтанному ПОЛ, а також інтенсивність НАДФН-залежного (НЗП) та аскорбат-залежного ПОЛ (АЗП) при індукованому ПОЛ за методами, описаними в [7, 11].

Для вивчення змін структурних параметрів у фракціях хроматину під впливом отруєння та введення ніфедипіну використовували показники гасіння власної флуоресценції білків у РХ та ТАХ (так звані константи гасіння Штерна-Фольмера [12]), флуоресцентного зондування етидій бромідом [13], флуорескаміном [14], піреном, співвідношення між мономерними та ексимерними його формами (Iм/Іе) [14], а також явище індуктивно-резонансного переносу енергії (ІРПЕ) з білкових флуорофорів фракцій хроматину на пірен [13]. Виміри проводили на спектрофотометрі "Hitachi MPF-4" (Японія).

За змінами у ліпід-білкових та ДНК-білкових співвідношеннях, які відбувалися в процесі експерименту, спостерігали за УФ-спектрами поглинання розчинів фракцій хроматину. Спектральні дослідження проводили на спектрофлуорометрі "Shimadzu MPS-5000" (Японія).

Комплексоутворення ніфедипіну з фракціями хроматину спостерігали за кінетикою термовиділення при змішуванні їх розчинів, яку реєстрували на мікрокалориметрі "LKB-2107" (Швеція) при 26 °C. Статистичну обробку даних проводили за методами непараметричної статистики [15].

Результати та їх обговорення

У табл. 1 наведені результати дослідів вивчення впливу ніфедипіну на процеси індукованого НАДФН та аскорбатом ПОЛ у фракціях РХ та ТАХ печінки за умов отруєння щурів ТХМ та введення ніфедипіну. Видно, що за умов ураження хроматину ТХМ відбувається підвищення значень показників індукованного як НАДФН, так і аскорбатом ПОЛ у репресованій фракції хроматину. На відміну від аспірину [16], введення ніфедипіну отруєним тваринам ще більше підвищує значення ПОЛ, індукованого НАДФН у цій фракції хроматину. В активній фракції хроматину достовірних змін показників ПОЛ, індукованого НАДФН та аскорбатом не спостерігалося.

У табл. 2 наведені результати вивчення концентрації ДК — проміжних продуктів ПОЛ — у фракціях хроматину в усіх трьох групах досліджуваних тварин. Достовірне підвищення цього показника за умов отруєння ТХМ спостерігалося у фракції ТАХ. Введення тваринам ніфедипіну після отруєння (на відміну від аспірину [16]), призводило до незначного зниження концентрації ДК в ізопропанольному екстракті порівняно з інтактними тваринами.

Такі дані не дозволяють твердити про наявність антиоксидантної активності у ніфедипіну щодо процесів ПОЛ у хроматині за умов інтоксикації тварин ТХМ. Це стосується як процесів спонтанного (у ТАХ), так і індукованого НАДФН та аскорбатом ПОЛ (у РХ). Раніше [1] подібна закономірність була встановлена нами для іншого представника блокаторів кальцієвих каналів — верапамілу — за умов ураження хроматину печінки хлорофосом. Введення цього препарату експериментальним тваринам ще більше підвищувало рівень інтенсивності процесів ПОЛ у хроматині, тобто спричиняло прооксидантний ефект.

Відсутність захисної дії ніфедипіну за умов ураження хроматину ТХМ (див. нижче) ймовірно пов’язана з нездатністю цього препарату інгібувати процеси ПОЛ у хроматині in vivo.

У табл. 3 наведені результати визначення відносної кількості фракцій та співвідношення білок/ДНК, тобто показників, які характеризують структуру фракцій РХ та ТАХ клітин печінки інтактних, отруєних ТХМ щурів, і таких, яким після інтоксикації вводили ніфедипін.

Підвищення відносної кількості активної фракції у отруєних тварин (приблизно у 2,6 раза) не нормалізується введенням ніфедипіну. Подібні зміни спостерігалися й у фракції РХ. Введення ніфедипіну (на відміну від аспірину [16]) призводить до ще більшого підвищення показника білок/ДНК в РХ, але достовірно знижує його в ТАХ. Це може свідчити про посилення генотоксичної дії ТХМ під впливом препарату. Таке припущення підтверджується результатами вивчення співвідношення між ДНК та білками за спектрами їх поглинання (відповідно Д216240 та Д260240) за умов отруєння ТХМ та введення ніфедипіну (табл. 4).

Отже, за умов отруєння жоден з цих показників в обох фракціях хроматину достовірно не змінюється, але після введення тваринам ніфедипіну співвідношення між ДНК та білками в РХ (які поглинають при 240 нм) зменшується. Тобто ДНК стає більш доступною для отрути у вже релаксованій під впливом ТХМ структурі ДНК [17, 18].

Результати вивчення фізико-хімічних показників фракцій хроматину клітин печінки щурів усіх досліджуваних груп наведені у табл. 5.

Можна бачити, що введення ніфедипіну отруєним тваринам не приводить до нормалізації структурної організації білків і ліпідів у хроматині та взаємодії між ними, які були порушені внаслідок дії ТХМ. Крім того, в РХ під впливом ніфедипіну зростає співвідношення інтенсивності флуоресценції мономерної та ексимерної форм флуоресцентного зонда пірена, яке є пропорційним мікров’язкості ліпідної складової фракцій хроматину. При цьому у ТАХ достовірно підвищується (порівняно з контролем) значення констант Штерна-Фольмера, які не зазнали суттєвих змін при отруєнні тварин ТХМ. Тобто, за деякими показниками, як у випадку ПОЛ, спостерігається посилення під впливом препарату генотоксичної дії ТХМ.

Результати вивчення інтенсивностей флуоресценції флуорескаміну та власної флуоресценції білків у фракціях хроматину клітин печінки щурів усіх трьох груп наведені у табл. 6.

Інтенсивність власної флуоресценції фракцій хроматину, яка характеризує структуру негістонових білків, дещо підвищується за умов отруєння експериментальних тварин ТХМ. Введення таким тваринам ніфедипіну (на відміну від аспірину [16]) не призводить до нормалізації цього показника, а у фракції ТАХ він навіть збільшується.

Зовсім інша картина спостерігається у гістонових білках, про стан яких можно судити за зв’язування з флуорескаміном. У цьому випадку має місце нормалізуючий вплив ніфедипіну на порушену в результаті хімічного ураження клітин печінки структуру гістонових білків (в обох фракціях хроматину), тобто, у цьому випадку препарат проявляє геномозахисну активність.

Що стосується ДНК, то наведені на рис. 1 результати вивчення зв’язування етидій броміду, свідчать про те, що за умов отруєння тварин ТХМ ускладнюється вбудовування цього зонда у подвійний ланцюг ДНК. Введення таким тваринам ніфедипіну не релаксує достатньою мірою ДНК у фракціях хроматину, компактизовану внаслідок отруєння.

Певне уявлення про процеси, які відбуваються у хроматині клітин печінки за умов отруєння тварин ТХМ та введення ніфедипіну, дають результати мікрокалориметричного дослідження взаємодії ніфедипіну з фракціями хроматину усіх трьох груп експериментальних тварин (рис. 2). У фракції РХ отруєння призводить до зміни процесу цієї взаємодії: він розвивається повільніше (рис. 2а, крива 2). Взаємодія in vitro ніфедипіну з РХ тварин, яким після отруєння ТХМ був введений ніфедипін (рис. 2а, крива 3), більш подібна до тієї, яка спостерігалася при взаємодії з РХ клітин печінки інтактних тварин (рис. 2а, крива 1). Це може свідчити, як і в експериментах з аспірином [16], про те, що деяка частка сайтів зв’язування ніфедипіну на РХ була вже зайнятою введеним щурам препаратом (ніфедипін, на відміну від аспірину, не утворював метаболітів [19]), тобто порушення структури цієї фракції, які проявляються в результаті взаємодії РХ з ніфедипіном, є маскованими.

Взаємодія ніфедипіну з фракціями ТАХ in vitro також супроводжувалася інтенсивним тепловиділенням (рис. 2б). Найбільшим цей ефект був для ТАХ інтактних тварин (рис. 2б, крива 1). Отруєння тварин ТХМ призводило до зниження тепловиділення (рис. 2б, крива 2). Введення таким тваринам ніфедипіну майже не впливало на процес, що розглядається (рис. 2б, крива 3).

Ці дані свідчать про те, що, незважаючи на наявність інтенсивної прямої взаємодії ніфедипіну з хроматином, суттєвого відновлення структури РХ та ТАХ клітин печінки, порушеної внаслідок отруєння тварин ТХМ, не відбувається. Такі результати можно пояснити (якщо порівняти їх з аналогічними даними для аспірину [16]) лише одним — відсутністю у ніфедипіну антиоксидантних властивостей щодо стимульованих за умов отруєння ТХМ вільнорадикальних реакцій ПОЛ у хроматині. Це, і свою чергу, є подальшим доказом тісного взаємозв’язку між геномозахисними властивостями фармакологічних препаратів та наявністю у них антиоксидантного ефекту щодо процесів ПОЛ у хроматині.

Підтвердженням участі геному у токсичному процесі, викликаному ТХМ, є дані, що стосуються відносної кількості тварин, які вижили за умов введення ТХМ, та ТХМ на тлі ніфедипіну. В обох випадках показник дорівнює 66 %. Якщо порівняти ці результати з аналогічними даними для аспірину, який проявляв антиоксидантні ефекти, то видно, що у випадку ураження клітин печінки ТХМ, захист геному за допомогою фармакологічних препаратів корелює із зменшенням смертності експериментальних тварин від отрути за наявності у даного препарату антиоксидантних властивостей щодо процесів переокислення хроматин-зв’язаних ліпідів та його здатності відновлювати структуру хроматину, порушену внаслідок інтоксикації.

Таким чином, незважаючи на здатність нормалізувати внутрішньоклітиний метаболізм кальцію за умов вільнорадикального хімічного ураження субклітинних структур печінки, блокатори току іонів кальцію не володіють здатністю відновлювати структурно-функціональний стан ядерного геному, порушений внаслідок отруєння тварин тетрахлорметаном [1]. На наш погляд, це значною мірою пов’язано з відсутністю у них антиоксидантного впливу на процеси переокислення хроматин-зв’язаних ліпідів.

Література
1. Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., Примак Р.Г. и др. Молекулярніе механизмі повреждения хроматина печени хлорофосом в условиях введения верапамила и атропина // Биополимері и клетка. —1993. —Т. 9, N 4. —С. 32—39.
2. Губський Ю.І., Левицький Є.Л., Примак Р.Г. Принципи фармакологічного захисту ядерного генома // Ліки. —1994. —N 4. —С. 90—94.
3. Левицький Є.Л., Примак Р.Г., Горюшко Г.Г. та ін. Вивчення антиоксидантних та генопротекторних властивостей фізіологічно активних речовин, виділених з парилу звичайного // Ліки. —1996. —N 3. —С. 90—94.
4. Левицкий Е.Л., Губский Ю.И., Примак Р.Г. и др. Антиоксидантно-генопротекторный механизм действия препарата "Мумие-Витас" // Биополимеры и клетка. —1997. —Т. 13, N 1. —С. 63—69.
5. Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., Кулик И.А. и др. Изучение генопротекторных свойств препарата "Флараксин" в условиях повреждающего действия тетрахлорметана // Биополимеры и клетка. —1995. —Т. 11, N 1. —С. 70—80.
6. Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., Холодова Ю.Д. и др. Механизмы генопротекторного действия препарата на основе фитоэкдистероидов (БТК-8Л) в условиях повреждения хроматина тетрахлорметаном // Укр. Биохим. Журн. —1993. —Т. 65, N 6. —С. 75—83.
7. Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., Примак Р.Г. и др. Влияние витамина Е на структурно-функциональную организацию хроматина печени в условиях повреждения тетрахлорметаном // Биополимеры и клетка. —1993. —Т. 9, N 3. —C. 27—34.
8. Губська О.Ю., Левицький Є.Л., Примак Р.Г. та ін. Характер взаємодії препарату "Normase" з компонентами ядерного генома за умов хімічного ураження печінки // Ліки. —1997. —N 3. —С. 61—64.
9. Лукьянчук В.Д. Савченкова Л.В. Новое в механизме действия блокаторов кальциевых каналов // Фармакол. Вісник. —1996. —N 2. —С. 30.
10. Чихиржина Г.И., Домкина Л.К., Чигарева Н.Г., Ашмарин И.П. Солюбилизация хроматина эндогенным Ca2+, Mg2+-зависимым фактором. Активность труднорастворимого хроматина // Мол. биол. —1976. —Т. 10, N 6. —С. 1303—1310.
11. Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., Гольштейн Н.В. и др. Перекисное окисление липидов и полимеразные активности фракций хроматина печени крыс при старении // Бюл. эксперим. биологии и медицины. —1989. —Т. 57, N 6. —С. 693—695.
12. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. —М.: Мир. 1986. —496 с.
13. Примак Р.Г., Горюшко А.Г., Левицкий Е.Л. и др. Изучение конформационных характеристик траскрипционно активного и репрессированного хроматина с помощью флуоресцентных зондов // Биополимеры и клетка. —1994. —Т. 10, N 1. —С. 41—46.
14. Губский Ю.И., Примак Р.Г., Горюшко А.Г. и др. Изучение компонентов фракций хроматина печени крыс методами флуоресцентного зондирования // Биополимеры и клетка. —1994. —Т. 10, N 6. —С. 92—97.
15. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и плапирование экспериментов. —Л.: Изд-во ЛГУ, 1975. —78 с.
16. Левицький Є.Л., Горюшко Г.Г., Примак Р.Г. та ін. Механізм генозахистної дії аспірину за умов отруєння щурів тетрахлорметаном // Ліки. —1998. —N 3. —С. 53—57.
17. Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., Жила В.А. и др. Молекулярные повреждения фракционированного хроматина печени тетрахлорметаном // Вопр. Мед. химии. —1992. —Т. 38, N 3. —C. 54—58.
18. Чабанный В.Н., Левицкий Е.Л., Губский Ю.И. и др. Генопротекторный эффект препаратов на основе экдистероидов при отравлении крыс тетрахлорметаном и хлорофосом // Укр. биохим. журн. —19??. —Т. 66, N 5. —C. 67—77.
19. Drug Evaluations annual 1994. —USA: Division of Drugs and Toxicology. 1994. —2364 p.


| Содержание |