|
МЕХАНИЗМЫ ИНТОКСИКАЦИЙ УДК 612.398.13:577.1:517.322 СВЯЗЫВАНИЕ ЭПИХЛОРГИДРИНА СЫВОРОТКОЙ КРОВИ И ЕЕ БЕЛКОВЫМИ ФРАКЦИЯМИ И.Ю. Высоцкий, к.м.н., доцент Сумский государственный университет В.Д. Лукьянчук, д.м.н., профессор, Г.К. Грызунова, к.б.н. Луганский медицинский университет Известно, что важным фактором в распределении ксенобиотиков в организме является их связывание белками сыворотки крови. Изучение этого процесса на молекулярном уровне открывает широкие возможности для более глубокого понимания токсикокинетики и токсикодинамики исследуемых веществ. В литературе имеются подробные сведения о взаимодействии с сывороточным альбумином (СА) целого ряда лекарственных веществ, естественных метаболитов, ионов металлов, витаминов, гормонов [1—4], альдегидов, хинонов [5], некоторых низкомолекулярных токсических веществ из группы динитрофенольных, фосфорорганических и хлорорганических соединений [6—8]. Представлены данные о значении препаратов СА в практике интенсивной терапии и экстракорпоральной гемокоррекции. Рассмотрены функциональные особенности этого белка в регуляции гомеостаза, его транспортные функции [9]. В то же время сведения о взаимодействии с сыворо-точными белками высокотоксичных эпоксидных соединений (ЭС) отсутствуют, хотя известно, что они широко применяются в промышленности при синтезе эпоксидных смол, поли-мерных материалов, образуются в организме в процессе метаболизма многих чужеродных веществ, лекарств, а также эндогенных соединений [10—13]. В связи со сказанным представляло интерес изучить на молекулярном уровне процессы связывания сыворотки крови и ее белковых фракций с одним из наиболее токсичных и опасных представителей ЭС — эпихлоргидрином (ЭХГ), который способен вызывать острые и хронические интоксикации как при ингаляционном, так и при пероральном и накожном путях поступления в организм [14]. Материалы и методы. Исследование процессов связывания ЭХГ цельной сывороткой крови, а также отдельными белковыми фракциями сыворотки, такими как альбумин (производства фирмы «Reanal») и гамма-глобулин (производства INCSTAR Corporation), проводили методом равновесного диализа в модифицированном А.И. Луйком и В.Д. Лукьянчуком [15] аппарате Чегера [16]. Диализные камеры аппарата, состоящие из 2 ячеек емкостью 5 и 10 мл, разделены полупроницаемой целлофановой мембраной. В малые ячейки каждой из пяти опытных камер вносили 0,5 мл цельной сыворотки крови, либо такое же количество белковых фракций (4 % раствор СА, 1,2 % раствор гамма-глобулина) и от 0,1 до 0,5 мл 4 % раствора ЭХГ в 0,15 М фосфатном буфере (рН 7,4) и 0,15 М NaCl (1:10). ЭХГ предварительно растворяли в 96 % этаноле, после чего переводили в водную среду. Конечная концентрация этанола в диализной ячейке не превышала 0,5 % и не влияла на связывающую активность исследуемых биополимеров. В большие ячейки вносили 10 мл фосфатного буфера. Таким же образом заполняли контрольную пару ячеек, внося в малую ячейку 0,5 мл буфера вместо сыворотки или одной из ее фракций. После установления диализного равновесия (через 18—26 ч при 20—25 °С) определяли концентрацию ЭХГ в больших ячейках (не содержащих белка) спектрофотометрическим методом (СФ-46 при l-580 нм) [17, 18]. Концентрация ЭХГ в большой ячейке контрольной камеры соответствовала общему содержанию вещества, а в большой ячейке опытной камеры — свободно диффундирующей фракции, т.е. не вступившей во взаимодействие с белком или его фракциями. Вводили по-правку на абсорбцию вещества на полупроницаемой мембране и на стенках камеры (~ 0,06 %). Для расчета количественных параметров комплексообразования ЭХГ с изучаемыми биосубстратами — константы ассоциации (Ка) и числа мест связывания (N) использовали графический метод Скэтчарда [6, 15] с применением метода наименьших квадратов при помощи ЭВМ «Электроника МК-52». Метод основан на линейном выражении закона действующих масс: Сb/Сf = KаN - KаCb, где Cb — молярная концентрация связанного с белком лиганда; Сf — молярная концентрация свободного лиганда. Подставляя в данное уравнение значения переменных Cb и Сb/Сf, полученных экспериментально, можно определить Kа и N графически. С целью доказательства, что применяемая мембрана не пропускает молекулы белка, проводился выборочный контроль отсутствия его в большой ячейке опытной камеры при помощи качественной пробы с сульфосалициловой кислотой. Результаты и их обсуждение. Методом равновесного диализа показано, что ЭХГ взаимодействует как с цельной сывороткой крови, так и с такими важными ее компонентами, как альбумин и гамма-глобулин. На основании полученных результатов построены изотермы связывания изучаемого галоидуглеводорода в цельной сыворотке крови, 4 % растворе СА и 1,2 % растворе гамма-глобулина (рис. 1). Они свидетельствуют о том, что взаимодействие ЭХГ с белками сыворотки крови почти полностью обусловлено связыванием его СА. При этом следует подчеркнуть, что при раздельном взаимодействии ЭХГ как с цельной сывороткой, так и раствором СА получены весьма близкие результаты. Лишь небольшая доля изучаемого соединения способна образовывать комплексы с гамма-глобулином. На первый взгляд факт взаимодействия ЭХГ с гамма-глобулином выглядит малозначительным. Вместе с тем, как показывают многочисленные результаты клинических наблюдений, способность изучаемого галоидуглеводорода связываться с данным протеином играет важную роль в реализации аллергических реакций в процессе контакта работающих с ЭС. Изучению иммунологического статуса при токсикоаллергических поражениях гепатобилиарной системы и его фармакологической коррекции у рабочих, кон-тактирующих с ЭС, посвящены исследования, составляющие отдельную научную проблему [19, 20]. Следует обратить внимание на то, что при концентрации ЭХГ в диализном аппарате в диапазоне от 5,4x10-5 до 6,6x10-5 М происходит насыщение связывающих центров исследуемых транспортных белков. В то же время кривая насыщения ЭХГ сыворотки крови (рис. 1) свидетельствует о том, что емкость последней по отношению к яду не исчерпана. По-видимому, при заполнении ЭХГ всех аллостерических центров альбумина и глобулина в процесс могут вовлекаться бета-липопротеиды, кислые альфа-гликопротеиды и другие белковые молекулы [6]. Для доказательства обратимого, нековалентного характера связывания альбумином ЭХГ, проводили в динамике периодическую смену диализата в большой опытной ячейке с последующим количественным определением ЭХГ. Показано, что замена диализата в указанной ячейке на новый приводит к проникновению в него изучаемого галоидуглеводорода посредством вновь созданного градиента концентрации. Таким образом, установлено, что ЭХГ взаимодействует с сывороточными белками с образованием обратимых комплексов. Основным компонентом сыворотки крови, обусловливающим такой тип комплексообразования с ЭХГ, является альбумин. Обратимое взаимодействие низкомолекулярных соединений с белками характеризуют следующие основные показатели: Kа — показывающая степень сродства (аффинитет) лиганда к связывающим центрам протеина, и N — число молекул лиганда, фиксирующихся в каждом из связывающих центров, отражающее их емкость. В соответствии с существующим определением, под связывающим центром в данном случае понимается совокупность участков белковой молекулы, фиксирующих молекулы лиганда с одинаковой степенью сродства, то есть обладающих общей Kа [6]. Для определения численных величин Kа и N нами получен целый ряд экспериментальных значений Сb и Сf (рис. 1). Этим и была обусловлена необходимость постановки опытов с различными молярными соотношениями белка и исследуемого лиганда. Полученные данные равновесного диализа, обработанные по методу Скэтчарда, свидетельствуют о том, что ЭХГ имеет один тип связывающих центров на молекулах исследуемых биополимеров (рис. 2). Установленная при этом достаточно высокая степень со-ответствия полученных экспериментальных данных закону действующих масс подтверждает обратимую природу взаимодействия исследуемого соединения с белками. Kа комплекса изучаемого галоидуглеводорода с цельной сывороткой крови и 4 % раствором СА практически одинакова и равна 3,76x104 М-1 и 3,1x104 М-1 соответственно. Такие величины Kа следует расценивать как среднюю степень аффинитета. Величина аффинитета комплекса ЭХГ с гамма-глобулином составляет только 1,26x104М-1, что примерно в 2,5 раза ниже таковой при оценке комплексообразования с СА крови (табл.). Определение другого количественного параметра комплексообразования (N) показало, что концентрация мест связывания ЭХГ одной молекулой СА составляет 16,8, а гамма-глобулина — 6,2х10-5 М, что в 2,7 раза ниже. При этом необходимо подчеркнуть, что величина показателя N при образовании комплексов ЭХГ с СА и белками цельной сыворотки крови мало отличаются друг от друга и составляют соответственно 16,8 и 17,8х10-5 М (рис. 2). Эти данные, как и приведенные выше результаты определения константы ассоциации, являются еще одним доказательством того, что комплексообразование ЭХГ с белками цельной сыворотки крови обусловлено обратимым взаимодействием яда преимущественно с СА. Анализируя результаты исследований определения показателя, характеризующего количество молекул яда, фиксируемых одной молекулой белка, видно (табл.), что емкость гамма-глобулина (8,27) почти в 3 раза выше, чем емкость альбумина (2,86). Такие свойства гамма-глобулина могут приводить в результате растяжения цепи, ее дезорганизации к частично необратимой или полностью необратимой конформационной перестройке белковой молекулы и приобретению ею новых свойств. Весьма важным с точки зрения хемобиокинетики, представляется произведение параметров комплексообразования (Kа•N), определенных методом равновесного диализа. Установлено, что данный параметр для альбумина и цельной сыворотки достаточно близок и равен, соответственно, 5,2 и 6,7. В то же время величина Kа•N для гамма-глобулина составляет не более единицы, а точнее 0,78 (табл.). На основании этих данных можно сделать предположение, что у альбумина, в отличие от гамма-глобулина имеются дополнительные высокоаффинные участки молекулы, специфически связывающие ЭХГ. Однако, различия в степени связывания различных белков, по-видимому, не следует относить только за счет специфических причин. Следует также учитывать, что альбумины имеют молекулярную массу 67000—69000, тогда как молекулярная масса глобулинов значительно выше. В результате этого общая поверхность частичек в растворе альбумина значительно больше, чем поверхность частичек в одинаковом по массе и концентрации растворе глобулина. Кроме того, молекулы альбумина значительно более гибкие, ввиду чего они могут лучше и прочнее связываться с взаимодействующими с ними чужеродными соединениями [3]. Таким образом, результаты проведенных экспериментальных исследований позволяют сделать вывод о том, что ЭХГ способен вступать в процессы обратимого взаимодействия с белками сыворотки крови, среди которых как по степени аффинитета, так и по величине концентраций мест связывания основная роль принадлежит СА. С точки зрения проявления токсических свойств ЭХГ, связывание с альбумином, может способствовать обезвреживанию и выведению яда, что создает определенные перспективы для разработки антидотно-лечебных средств, влияющих на процессы обратимого комплексообразования ЭХГ с СА. Полученные в работе сведения расширяют имеющиеся представления о молекулярных механизмах взаимодействия ксенобиотиков с белками плазмы крови, что имеет существенное теоретическое и практическое значение. ЛИТЕРАТУРА |