УДК 614.76:615.099

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СПЕРМАТОГЕНЕЗА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ СВИНЦА И КАДМИЯ НА САМЦОВ БЕЛЫХ КРЫС

И.Н. Андрусишина

Институт медицины труда, г. Киев

Среди глобальных загрязнителей окружающей среды свинец и кадмий занимают одно из ведущих мест. Известно, что эти элементы, длительно воздействуя на организм человека, могут вызывать нарушения репродуктивной функции. При этом большинство данных, в том числе и экспериментальных, относится к воздействию тяжелых металлов на женщин [1, 2] и детей [3, 4]. В то же время влияние их на мужчин изучено в значительно меньшей степени. В литературе имеются лишь отдельные указания на морфофункциональные изменения сперматогенеза экспериментальных животных. При этом отмечается, что ингаляционное воздействие свинцовой пыли в концентрации 1, 0,5 и 0,1 мг/м³ на протяжении 22 нед нарушает функциональное состояние сперматозоидов и сперматогенез [5]. У морских свинок, получавших ацетат свинца с пищей в хроническом опыте в дозе 0,01 мг/кг, имело место увеличение количества патологических форм сперматозоидов и уменьшение времени их подвижности. Однако, доза 0,001 мг/кг оказалась не действующей [6]. Свинец-содержащая пыль вводилась белым крысам-самцам в дозах 1,0 и 0,1 мг по Pb в 1 м³ воздуха в течение 4 мес. При этом наблюдали "остановку" сперматогенеза при дозе 1,0 мг/м³ [7]. У крыс, получавших ацетат свинца с питьевой водой в концентрациях 0,5 и 1,0 г/л в течении 90 дней, не выявлено гистологических изменений семенников и эпидидимиса. Однако, в начале эксперимента отмечено увеличение числа сперматозоидов [8]. Автором [9] исследовано влияние ацетата свинца в дозе 90 мг/кг (поступление с пищей) в течение 3,5 мес на крыс Wistar. Отмечено, что затравка самцов более неблагоприятна для развивающегося потомства, чем самок. Ингаляционное воздействие сернокислого кадмия в концентрации 3 мг/м³ ежедневно в течении 4-х мес оказывало влияние на структуру сперматогенного эпителия с нарушением выработки сперматозоидов, уменьшением времени их подвижности, вследствие чего страдала функция оплодотворения [10]. Внутрижелудочное введение хлорида кадмия крысам-самцам в дозе 17 мг/кг 6 раз в течение 1 мес приводило к снижению массы семенников и функциональной активности сперматозоидов [11]. Однако, интоксикация хлоридом кадмия в течение 20 дней в дозе 0,11 мг/100 г массы тела приводила к уменьшению массы семенников подопытных животных и не зависела от стадии половой зрелости животных [12].

Целью настоящих исследований явилось выявление характера и степени морфофункциональных изменений сперматогенеза у белых крыс самцов при воздействии малых доз свинца и кадмия.

Материалы и методы

В опытах моделировали реальные нагрузки свинцом и кадмием в окружающей среде, действию которых подвергаются люди в загрязненных районах. Экспериментальные исследования проводили на 150 нелинейных половозрелых крысах-самцах массой тела 150—220 г. Животным внутрибрюшинно вводили 1/200 и 1/100 ЛД₅₀ Pb и Cd раздельно, контрольным животным внутрибрюшинно вводили 0,9 % раствор NaCl. Водные растворы ацетата свинца и хлорида кадмия готовили из расчета ЛД₅₀ Pb 250 мг/кг массы тела, ЛД₅₀ Cd — 3 мг/кг. Хронический эксперимент на протяжении 46 дней выбран из расчета длительности сперматогенеза у крыс (46—48 дней) и времени, необходимого для прохождения сперматозоидов через придаток семенника. Указанный срок позволял оценить функциональное состояние сперматозоидов, которые на протяжении своего развития подвергались воздействию малых доз свинца и кадмия.

Содержание свинца и кадмия в крови, семенниках и сперме определяли методом ААС в пламени на приборе Северодонецкого ОКБА "Сатурн-3" и электротермически на приборе фирмы Perkin-Elmer 5100 Z PC (производство USA). Свинец и кадмий крови пробоподготавливали методом мокрой минерализации [13], семенников и спермы — по методу [14].

Сперматозоиды выделяли из эпидидимальных придатков измельчением ткани и промыванием 2 мл физиологического раствора через стальную сеточку. Общее число сперматозоидов и их подвижность подсчитывали в камере Горяева под окуляром светового микроскопа при увеличении х600. Число спермиев подсчитывали в 5 больших квадратах камеры Горяева по диагонали. Полученное число умножали на коэффициент разведения (по Молнару) [15]. Действие свинца и кадмия на сперматогенез оценивали по функциональному состоянию сперматозоидов — их количеству, подвижности, патологическим формам и длине клетки.

Патологические формы клеток и их размеры определяли методом растровой электронной микроскопии. Для этого первоначальные пробы суспензии сперматозоидов фиксировали в 2,5 % растворе глютаральдегида на фосфатном буфере рН 7,4 (с разведением в 100 раз). Сперматозоиды отмывали в фосфатном буфере и обезвоживали в восходящей концентрации батареи спиртов (от 50 до 96°). Затем пробы наносили на стеклоуглеродные столики и покрывали слоем золота толщиной в 100 А в вакуумной камере методом холодного пара в течении 5 минут. Указанный метод делает возможным непрерывное покрытие электропроводящим слоем объектов с любой по сложности топографией поверхности. Анализировали образцы на РЭМ "Comskan" (Англия) с глубиной просмотра 0,5 мкн, током зонда 100 мА и ускоряющим напряжением 20 кВ, увеличение х2000-20000. Фотографирование сперматозоидов осуществляли с помощью фотоаппарата "Mamiya" (Япония) на пленке Ф-65, ширина 70 мм. Условия съемки и просмотра были общепринятыми. Подсчитывали число патологических форм в капле, длину клеток определяли по фотографиям.

Результаты анализов обработаны с использованием непараметрических методов математической статистики.

Результаты исследований и их обсуждение

Проведенные токсикологические исследования позволили выявить, что исследуемые дозы Pb оказывают выраженное воздействие на кровь и семенники. Так при дозах 1/200 и 1/100 ЛД₅₀ Pb выявлено достоверное увеличение содержания Pb в крови уже на 5 и 7 нед наблюдения (табл. 1). При хроническом введении cd в дозе 1/200 ЛД₅₀ наблюдается достоверный рост содержания cd через 2 нед, при 1/100 ЛД₅₀ достоверное увеличение его уровня в крови отмечается с 1 по 7 неделю.

В семенниках наблюдалась несколько иная картина распределения Pb и Cd (табл.2). Так при хроническом введении pb (не зависимо от дозы) его содержание росло от 1 к 7 нед (p < 0,05). Достоверное увеличение кадмия при дозе 1/200 ЛД₅₀ регистрировалось с 1 по 7 нед, а при дозе 1/100 ЛД₅₀ — с 5 по 7 неделю.

Содержание Pb и Cd в суспензии сперматозоидов представлено в табл. 3. Достоверный рост содержания pb в сперме отмечался со 2 до 7 нед (вне зависимости от введенной дозы). Уровень cd увеличивался со 2 по 7 нед при дозе 1/100 ЛД₅₀, а при дозе 1/200 ЛД₅₀ повышение отмечалось к концу эксперимента.

Из рисунка видно, что при воздействии pb в дозе 1/100 ЛД₅₀ на 2, 5 и 7 нед снижается масса тела животных, а при воздействии cd наблюдается увеличение этого показателя при дозе 1/100 ЛД₅₀ (на 7 нед). Более ярко выраженными были сдвиги массы семенников. Интоксикация pb приводила к достоверному снижению их массы со 2 до 7 нед исследований. В то же время при хроническом введении cd только при введении 1/100 ЛД₅₀ вес семенников достоверно увеличивался со 2 нед до окончания опыта.

Морфофункциональные исследования суспензии сперматозоидов представлены в табл. 4. Общее число сперматозоидов во всех случаях хронического эксперимента достоверно уменьшалось с 1 до 5 нед. Аналогично уменьшалось число подвижных форм клеток, а число неподвижных увеличивалось к концу эксперимента. Длина клеток сперматозоидов при pb- и cd-интоксикациях изменялась разнонаправленно. При pb-интоксикации длина клеток была достоверно больше 1,3 раза (5 нед наблюдения 1/200 ЛД₅₀ pb и 5—7-недели 1/100 ЛД₅₀ pb), а Сd-интоксикация приводила к уменьшению длины клеток по сравнению с контролем при дозе 1/200 ЛД₅₀ с 1 до 5 нед наблюдения, а при дозе 1/100 ЛД₅₀ с 5 до 7 недели. При этом на фотографиях, полученных методом растровой электронной микроскопии, видны вспучивания и стекания мембран хвостовой части, обрывы хвостов, аглютинация клеток. Эти проявления патологии были особенно явными при воздействии кадмия.

Результаты атомно-абсорбционного исследования уровней содержания Pb и Cd в крови, семенниках и суспензии сперматозоидов в динамике хронического эксперимента подтверждают факт о различном характере элиминации этих металлов в организме. Известно [18], что Pb в крови имеет более длительный период удержания (исчисляется временем большим, чем время жизни эритроцитов), а Cd более короткий (1 сут) при хронической экспозиции. Уровни содержания Pb и Cd в семенниках и сперматозоидах различны вследствие того, что происходит накопление тяжелых металлов в семенниках (где формируются эти клетки) с проникновением их через гематотестикулярный барьер семенных придатков (где накапливаются сперматозоиды).

Результаты морфологических иследований свидетельствуют об угнетающем воздействии свинца и кадмия на сперматогенез. Характер изменений имеет некоторые отличия при Pb и Cd-интоксикациях. Так при Pb-интоксикации масса семенников уменьшается, а при Cd-интоксикации — увеличивается. Такие морфологические характеристики, как общее число подвижных и неподвижных форм клеток, изменялись при обоих видах воздействия. При Pb-интоксикации появляется большое число атипичных форм клеток с большим хвостовым отделом, а при Cd-интоксикации регистрируются клетки малых размеров, что обусловлено, по-видимому, выходом незрелых сперматозоидов и появлением патологических форм. Такой полиморфизм наблюдается в сперме многих млекопитающих в естественных условиях [16, 17]. Однако, больший процент случаев выявления патологических форм клеток в суспензии сперматозоидов в эксперименте может быть следствием воздействия тяжелых металлов на сперматогенез. Анализ результатов проведенных исследований свидетельствует о наличии негативного влияния Pb и Cd даже в относительно небольших дозах на морфофункциональное состояние мужских гамет, что может неблагоприятно отразиться на функции воспроизведения. Сам факт возможности такого воздействия должен быть принят во внимание при разработке гигиенических и лечебно-профилактических мероприятий, направленных на предотвращение воздействия свинца и кадмия при контакте с ними мужчин, занятых в соответствующих отраслях промышленного производства.

ЛИТЕРАТУРА
1. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. 3. Свинец. Программа ООН по окружающей среде. Женева: ВОЗ. —1980. —193 с.
2. Recommended Health —Based Limits in Occupational Exposure to Heavy Metal Report et a WHO Study Group World Health Organization, Geneva ,1980. —N 647. —116 p.
3. Божанова Т.П. Влияние свинца и других тяжелых металлов на здоровье детей //Токсикол. вест. М. —1995. —N 5 —С. 36—38.
4. Landrigan P.J. Toxicity of lead at low dose,//Brit .J. Ind. Med. —1989. —46, N 9. —Р. 593—596.
5. Золотов П.А., Хван П.А. Экспериментальные данные к гигиеническому нормированию в рабочей зоне свинцово —силикатных изделий // Свинец в окружающей среде (Гигиенические аспекты) М. —1978. —С. 56—57.
6. Зарубинская Л.Г. Экспериментальные данные к обоснованию ПДД свинца при его пероральном поступлении в организм // Там же. —С. 50—52.
7. Хван П.А. Структурно-функциональное состояние гонад крыс при воздействии свинецсодержащей пыли // 2 Всес. конф. «Эндокринные системы и органы и вредные факторы внешней среды». Тез. докл. —Л. —1983 —С. 163.
8. Kempinas W.G. ,Lamano —Carvalho T.L., Petenusci S.O. et. al. Morfometric and stereological analisis of rat testis and epididimis in an early phose of saturnism // Exp. biol. —1988. —118, N 1 —Р. 51—56.
9. Харченко Т.И. Развитие белых крыс в условиях хронической свинцовой интоксикации // Докл. АН УССР. —1988. —N 2 —С. 85—88.
10. Цветкова Р. П. Вопросы токсикологии и гигиены труда при работе с сернистым кадмием // Автореф.дис. ... канд. мед. наук, М. —1968. —26 с.
11. Кобелева Н.А. Оценка реакции гонад и щитовидной железы на действие хлорида кадмия по микроморфометрическим показателям // «Эндокринная система организма и токсические факторы внешней среды». Тез. докл. 2 Всес. конф. Л. —1980. —С. 151—156.
12. Демченко В. Н. Андрогенная активность семенников препубертатных самцов крыс в условиях применения хлорида кадмия // Там же. —1983. —С. 45.
13. Dobrovolsky L., Vitte P., Belashova I. et. al. Blood lead monitoring studies in Chernobyl region in 1992 // Trase Element in Man and Animals. Tema 8. May 16th —21st .1993, Dresden. —1993. —Р. 140.
14. Harker M.M., Humdler T.L., Mahler D.J. Determination of Cupper and Zinc in biological Materials // Clin .Chem. —1967. —13, N 40 —Р. 40—45.
15. Молнар Е. Общая сперматология. Из-ние АН Венгрии, Будапешт, 1969. —294 с.
16. Рузен-Ранге Э. Сперматогенез у животных: Мир.:М, —1980. —259 с.
17. Коган С.А. Тонкая структура сперматозоидов в норме и патологии // Материалы Всес. конф. «Эл. микроскопия клеток и тканей»: Л., —1968. —С.16—17.
18. Авцин А.Т., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С. Микроэлементозы человека. —М.; Медицина, 1991. —497 р.