ТОКСИКОЛОГИЯ ПЕСТИЦИДОВ ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ АЦЕТИЛХОЛИН-ЗАВИСИМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ ПРИ РАЗДЕЛЬНОМ И КОМБИНИРОВАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ДЕЦИСА И БЕЛОФОСА НА НЕЙРОНЫ HELIX POMATIA L. С.В. Вековшинина, к.б.н. Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя, Киев Пиретроидные (ПИ) и фосфорорганические пестициды (ФОП) широко используются в быту и сельском хозяйстве в качестве эффективного средства против насекомых-вредителей. В последнее время большое распространение получило комбинированное (комплексное и в смесях) применение ПИ и ФОП. Это объясняется тем, что при совместном использовании указанных пестицидов в значительной степени усиливаются их инсектицидные свойства. Усиление токсического эффекта (синергизм) при комбинированном действии ПИ и ФОП также отмечали в опытах на млекопитающих [1]. ПИ и ФОП относятся к нейротоксикантам. Известно, что главной мишенью действия ПИ являются потенциалзависимые натриевые каналы нейронов [2]. Показано также, что ПИ могут блокировать проводимость хемовозбудимых ионных каналов за счет взаимодействия с ацетилхолиновыми (АХ) рецепторами нейронов Torpedo [3], Helix [4], Xenopus [5] и нейробластомы [6]. Для ФОП блокирование М- и Н-холинорецепторов является одним из механизмов их токсического действия [7]. Ранее нами было обнаружено существенное нарушение нервно-мышечной передачи у крыс при комбинированном действии дециса (ПИ) и белофоса (ФОП) [8]. На основании проведенных исследований был сделан вывод об однонаправленном влиянии указанных ПИ и ФОП на пресинаптическую мембрану, которое выражалось в увеличении ее проницаемости. Целью настоящей работы являлось исследование комбинированного действия дециса и белофоса на постсинаптическую нейрональную мембрану (на модели ацетилхолинзависимых ионных каналов). Методы исследования Результаты исследования и их обсуждение При воздействии дециса в концентрации 1 мкМ на нейрон улитки (в течение 5 минут) наблюдалось значительное снижение (на 30—40 %) амплитуды входящего ионного тока, которая в этом случае не зависила от поддерживаемого напряжения на мембране (рис. 1, А — децис). Исследование различных концентраций дециса подтвердило полученные результаты. ПИ вызывал дозозависимое блокирование АХ-тока при сохранении линейной зависимости I—V в интервале от -60 до -30 мВ (рис. 2). Увеличение концентрации дециса приводило к градуальному снижению АХ-вызванных ответов клетки до 40 % и менее от контрольной величины. В концентрации 1 мМ децис оказывал максимальный блокирующий эффект близкий к 100 %. При этом равновесный потенциал для АХ (Еах) не изменялся и составлял от -30 до -20 мВ. Попытки отмыть нейроны от ПИ контрольным раствором не приводили к улучшению функционального состояния постсинаптической мембраны. На рис. 3 представлены средние данные для 4 концентраций дециса. Величина коэффициента Хилла [10] < 1 свидетельствует об отсутствии кооперативности в связывании дециса с рецептор-канальным комплексом. Константа диссоциации (Кд) =10 мкМ. Таким образом, полученные нами данные подтверждают способность ПИ оказывать не только пре- , но и постсинаптическое действие, которое выражается в снижении проводимости хемовозбудимых каналов нейрональной мембраны Helix pomatia L. Белофос, также как и децис, не влиял на ионную природу входящего тока и линейный характер зависимости I—V (рис.1, Б — белофос). Однако вызывал более резкое снижение амплитуды, и в концентрациях 1мкМ и 10 мкМ действовал в 2—3 раза эффективнее, чем децис, что выражалось в более глубоком блокировании АХ-индуцируемого ионного тока (рис. 4). При этом 90 % снижение амплитуды входящего ионного тока отмечалось при воздействии белофоса уже в концентрации 100 мкМ, что на порядок ниже по сравнению с децисом. Еах для белофоса = -10 мВ. Средние данные для 3 исследуемых концентраций ФОП представлены на рис. 5. Коэффициент Хилла < 1, Кд =0.5 мкМ. После смены водной эмульсии, содержащей белофос, на контрольный раствор по истечении 30—40 мин происходило увеличение амплитуды тока до 60—70 % от контрольной величины. По литературным данным [11], белофос обладает способностью вызывать снижение амплитуды МПКП (миниатюрных потенциалов концевой пластинки), что косвенно свидетельствует о влиянии данного ФОП на функциональное состояние АХ-рецепторов. В нашем эксперименте белофос оказывал более выраженное нейротоксическое действие на нейроны улитки по сравнению с децисом. Так как исследуемый ФОП относится к малотоксичным веществам, то наблюдаемый эффект может быть связан с различной чувствительностью используемых нейронов. Несмотря на кажущееся более высокое сродство белофоса с рецептор-канальным комплексом (гиперболическая кривая "доза-эффект") по сравнению с децисом (линейная зависимость "доза-эффект"), частичная отмывка нейронов улитки от белофоса при помощи контрольного раствора свидетельствовала о нестойкости подобной связи. Исследование комбинированного действия дециса и белофоса проводилось по следующей схеме. В 1-ой серии опытов воздействие пиретроида предшествовало воздействию комбинации с временным интервалом 10 минут. Во 2-ой серии белофос применялся раньше, чем комбинация. Исследования воздействия различных концентраций пиретроида и фосфорорганического пестицида проводили на одной и той же клетке, что, несомненно, затрудняло анализ полученных результатов, так как в каждом конкретном случае Кд каждого из компонентов в смеси была неизвестна. Результаты двух серий оказались достаточно сходными и представлены на рис. 6. Комбинированное воздействие дециса и белофоса на АХ-ток (при сохранении линейной зависимости I—V) характеризовалось усилением нейротоксического эффекта по сравнению с воздействием препаратов в отдельности. Так, амплитуда входящего тока в среднем снижалась до 60—20 % от контроля, что на 10—30 % меньше, чем для дециса или белофоса. Наиболее выраженный синергизм ПИ и ФОП наблюдался при воздействии смеси в концентрации 10 мкМ. Коэффициент Хилла=1, что указывало на отсутствие кооперативности. Кд для смеси находилась между 1 и 10 мкМ. Учитывая немногочисленность данных, полученных при комбинированном воздействии препаратов на нейрон улитки, мы не строили графика зависимости "доза-эффект". Анализ характера комбинированного действия исследуемых соединений по методу Финни [12 ] на основе показателя константы диссоциации свидетельствовал о неполном суммировании или антагонизме. Так как децис и белофос являются липофильными веществами, то можно предположить, что, проникая в липидную фазу постсинаптической мембраны, они таким образом могут конкурировать за места связывания с белками хемовозбудимых каналов. Другим местом конкурентного связывания могут быть аллостерические центры ацетилхолиновых рецепторов. Наряду с этим, усиление эффекта при комбинированном воздействии на каналы АХ-рецепторов предполагает наличие различных точек приложения ПИ и ФОП. Выводы 2. Децис и белофос не влияют на натриево-хлорную природу АХ-вызванного входящего ионного тока. Величина коэффициента Хилла < 1 свидетельствует об отсутствии кооперативности в связывании дециса и белофоса с АХ-рецепторным комплексом. 3. Комбинированное воздействие дециса и белофоса в концентрациях 0,1—1000 мкМ на функциональное состояние АХ-рецепторов постсинаптической мембраны характеризуется усилением нейротоксических эффектов, вызываемых каждым препаратом в отдельности, и выражается в снижении амплитуды вызванных потенциалов действия нейрона. Оценка комбинированного действия ПИ и ФОП по методу Финни на основе Кд свидетельствует о неполном суммировании. ЛИТЕРАТУРА |