ТОКСИКОЛОГИЯ ПЕСТИЦИДОВ

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ АЦЕТИЛХОЛИН-ЗАВИСИМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ ПРИ РАЗДЕЛЬНОМ И КОМБИНИРОВАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ДЕЦИСА И БЕЛОФОСА НА НЕЙРОНЫ HELIX POMATIA L.

С.В. Вековшинина, к.б.н.

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя, Киев

Пиретроидные (ПИ) и фосфорорганические пестициды (ФОП) широко используются в быту и сельском хозяйстве в качестве эффективного средства против насекомых-вредителей. В последнее время большое распространение получило комбинированное (комплексное и в смесях) применение ПИ и ФОП. Это объясняется тем, что при совместном использовании указанных пестицидов в значительной степени усиливаются их инсектицидные свойства. Усиление токсического эффекта (синергизм) при комбинированном действии ПИ и ФОП также отмечали в опытах на млекопитающих [1].

ПИ и ФОП относятся к нейротоксикантам. Известно, что главной мишенью действия ПИ являются потенциалзависимые натриевые каналы нейронов [2]. Показано также, что ПИ могут блокировать проводимость хемовозбудимых ионных каналов за счет взаимодействия с ацетилхолиновыми (АХ) рецепторами нейронов Torpedo [3], Helix [4], Xenopus [5] и нейробластомы [6]. Для ФОП блокирование М- и Н-холинорецепторов является одним из механизмов их токсического действия [7].

Ранее нами было обнаружено существенное нарушение нервно-мышечной передачи у крыс при комбинированном действии дециса (ПИ) и белофоса (ФОП) [8]. На основании проведенных исследований был сделан вывод об однонаправленном влиянии указанных ПИ и ФОП на пресинаптическую мембрану, которое выражалось в увеличении ее проницаемости.

Целью настоящей работы являлось исследование комбинированного действия дециса и белофоса на постсинаптическую нейрональную мембрану (на модели ацетилхолинзависимых ионных каналов).

Методы исследования
Исследовали нейротоксическое действие дециса (2,5 % концентрат эмульсии, Roussel Uclaf, Франция), белофоса (50 % концентрат эмульсии, НИИХСЗР, Россия) и их смеси. Оба препарата разводили в ДМСО (SERVA) до получения концентрации 20 мМ, а затем разведением в дистиллированной воде получали водные эмульсии необходимой концентрации. Концентрация растворителя составляла менее 0,1 %. При комбинированном действии за молярную концентрацию смеси (1:1) принималась концентрация отдельного препарата. В качестве исследуемого объекта служили нейроны В6 центральной нервной системы виноградной улитки (Helix pomatia L.) [9]. В нейрон вводили двухствольный стеклянный микроэлектрод. Один ствол служил для измерения мембранного потенциала, а второй — для его фиксации на заданном уровне. Оба ствола заполняли 2,5 М раствором КCl. АХ апплицировали из микроэлектрода ионофоретически. Длительность аппликации в этом случае определяла концентрацию апплицированного медиатора. Для заполнения апплицирующего микроэлектрода использовали 1 мМ раствор АХ. Схема регистрации сигнала и аппликации в деталях приведена ранее [4]. Внеклеточный раствор (контроль) имел следующий состав (в мМ/л): NaCl — 100, KCl — 5, Hepes NaOH (рН 7,4) — 10, MgCl2 — 5, CaCl2 — 70. Используемая концентрация ионов Са (в 7 раз выше по сравнению со стандартным раствором Рингера) исключала непрямое влияние исследуемых веществ на клетку (исследование проведено на базе Института физиологии им. Богомольца).

Результаты исследования и их обсуждение
В условиях фиксации напряжения на мембране ионофоретическая аппликация АХ на идентифицированные нейроны Helix вызывала входящий ионный ток (АХ-ток) натриево-хлорной природы, амплитуда которого зависила от поддерживаемого мембранного потенциала и концентрации АХ (рис. 1, А и Б — контроль).

При воздействии дециса в концентрации 1 мкМ на нейрон улитки (в течение 5 минут) наблюдалось значительное снижение (на 30—40 %) амплитуды входящего ионного тока, которая в этом случае не зависила от поддерживаемого напряжения на мембране (рис. 1, А — децис).

Исследование различных концентраций дециса подтвердило полученные результаты. ПИ вызывал дозозависимое блокирование АХ-тока при сохранении линейной зависимости I—V в интервале от -60 до -30 мВ (рис. 2). Увеличение концентрации дециса приводило к градуальному снижению АХ-вызванных ответов клетки до 40 % и менее от контрольной величины. В концентрации 1 мМ децис оказывал максимальный блокирующий эффект близкий к 100 %. При этом равновесный потенциал для АХ (Еах) не изменялся и составлял от -30 до -20 мВ. Попытки отмыть нейроны от ПИ контрольным раствором не приводили к улучшению функционального состояния постсинаптической мембраны.

На рис. 3 представлены средние данные для 4 концентраций дециса. Величина коэффициента Хилла [10] < 1 свидетельствует об отсутствии кооперативности в связывании дециса с рецептор-канальным комплексом. Константа диссоциации (Кд) =10 мкМ.

Таким образом, полученные нами данные подтверждают способность ПИ оказывать не только пре- , но и постсинаптическое действие, которое выражается в снижении проводимости хемовозбудимых каналов нейрональной мембраны Helix pomatia L.

Белофос, также как и децис, не влиял на ионную природу входящего тока и линейный характер зависимости I—V (рис.1, Б — белофос). Однако вызывал более резкое снижение амплитуды, и в концентрациях 1мкМ и 10 мкМ действовал в 2—3 раза эффективнее, чем децис, что выражалось в более глубоком блокировании АХ-индуцируемого ионного тока (рис. 4). При этом 90 % снижение амплитуды входящего ионного тока отмечалось при воздействии белофоса уже в концентрации 100 мкМ, что на порядок ниже по сравнению с децисом. Еах для белофоса = -10 мВ.

Средние данные для 3 исследуемых концентраций ФОП представлены на рис. 5. Коэффициент Хилла < 1, Кд =0.5 мкМ. После смены водной эмульсии, содержащей белофос, на контрольный раствор по истечении 30—40 мин происходило увеличение амплитуды тока до 60—70 % от контрольной величины.

По литературным данным [11], белофос обладает способностью вызывать снижение амплитуды МПКП (миниатюрных потенциалов концевой пластинки), что косвенно свидетельствует о влиянии данного ФОП на функциональное состояние АХ-рецепторов. В нашем эксперименте белофос оказывал более выраженное нейротоксическое действие на нейроны улитки по сравнению с децисом. Так как исследуемый ФОП относится к малотоксичным веществам, то наблюдаемый эффект может быть связан с различной чувствительностью используемых нейронов. Несмотря на кажущееся более высокое сродство белофоса с рецептор-канальным комплексом (гиперболическая кривая "доза-эффект") по сравнению с децисом (линейная зависимость "доза-эффект"), частичная отмывка нейронов улитки от белофоса при помощи контрольного раствора свидетельствовала о нестойкости подобной связи.

Исследование комбинированного действия дециса и белофоса проводилось по следующей схеме. В 1-ой серии опытов воздействие пиретроида предшествовало воздействию комбинации с временным интервалом 10 минут. Во 2-ой серии белофос применялся раньше, чем комбинация. Исследования воздействия различных концентраций пиретроида и фосфорорганического пестицида проводили на одной и той же клетке, что, несомненно, затрудняло анализ полученных результатов, так как в каждом конкретном случае Кд каждого из компонентов в смеси была неизвестна. Результаты двух серий оказались достаточно сходными и представлены на рис. 6.

Комбинированное воздействие дециса и белофоса на АХ-ток (при сохранении линейной зависимости I—V) характеризовалось усилением нейротоксического эффекта по сравнению с воздействием препаратов в отдельности. Так, амплитуда входящего тока в среднем снижалась до 60—20 % от контроля, что на 10—30 % меньше, чем для дециса или белофоса.

Наиболее выраженный синергизм ПИ и ФОП наблюдался при воздействии смеси в концентрации 10 мкМ. Коэффициент Хилла=1, что указывало на отсутствие кооперативности. Кд для смеси находилась между 1 и 10 мкМ. Учитывая немногочисленность данных, полученных при комбинированном воздействии препаратов на нейрон улитки, мы не строили графика зависимости "доза-эффект". Анализ характера комбинированного действия исследуемых соединений по методу Финни [12 ] на основе показателя константы диссоциации свидетельствовал о неполном суммировании или антагонизме.

Так как децис и белофос являются липофильными веществами, то можно предположить, что, проникая в липидную фазу постсинаптической мембраны, они таким образом могут конкурировать за места связывания с белками хемовозбудимых каналов. Другим местом конкурентного связывания могут быть аллостерические центры ацетилхолиновых рецепторов. Наряду с этим, усиление эффекта при комбинированном воздействии на каналы АХ-рецепторов предполагает наличие различных точек приложения ПИ и ФОП.

Выводы
1. Децис и белофос в концентрациях от 1 мкМ до 1мМ оказывают однонаправленное воздействие на нейрон В6 улитки Helix pomatia L., которое выражается в дозозависимом блокировании АХ-зависимых ионных каналов.

2. Децис и белофос не влияют на натриево-хлорную природу АХ-вызванного входящего ионного тока. Величина коэффициента Хилла < 1 свидетельствует об отсутствии кооперативности в связывании дециса и белофоса с АХ-рецепторным комплексом.

3. Комбинированное воздействие дециса и белофоса в концентрациях 0,1—1000 мкМ на функциональное состояние АХ-рецепторов постсинаптической мембраны характеризуется усилением нейротоксических эффектов, вызываемых каждым препаратом в отдельности, и выражается в снижении амплитуды вызванных потенциалов действия нейрона. Оценка комбинированного действия ПИ и ФОП по методу Финни на основе Кд свидетельствует о неполном суммировании.

ЛИТЕРАТУРА
1. Gray A. J., Soderlund D.M. Mammalian toxicology of pyrethroids//Insecticides; ed. by D.H. Hutson and T.R. Robert. — Chichester: John Wiley and Sons, 1985. —V 5. —P. 207.
2. Narahashi T. Nerve membrane ionic channels as the primary target of pyrethroids//Neurotoxicology. —1985. —V 2, N 6. —P. 3—22.
3. Eldefrawi M.E., Abbassy M.A., Eldefrawi A.T. Effects of enviromental toxicans on nicotinic acethylcholine receptors: action of pyrethroids//Cellular and molecular neurotoxicology; ed. by T. Narahashi. —New York: Raven press, 1984. —P. 177—189.
4. Kiss T., Osipenko O.N. Effect of deltamethrin on acetylcholine-operated ionic channels in identified Helix pomatia L. neurons//Pestic. Physiol. —N 39. —1991. —P. 196—204.
5. Ruigt G.S.F., Van den Bercken J. Action of pyrethroids on a nerve-muscle preparation on the dawed frog, Xenopus laevis//Pestic. Biochem. Physiol. —1986. —N 25. —P. 176.
6. Oortgiesen O.M., Van Cleef R.G.M., Vijverberg H.P.M. Effects of pyrethroids on neurotransmitter-operated ion channels in cultured mouse neuroblastoma cells//Pestic. Biochem. Physiol. —1989. —N 34. —P. 164.
7. Davis C.S., Richardson R.J. Organophosphorous compounds//Experimental and clinical neurotoxicology.-Baltimore: Williams and Wilking, 1980. —127 p.
8. Вековшиніна С.В. Комбінована дія фосфорорганічних пестицидів та синтетичних піретроїдів на функціональний стан периферичної нервової системи//Журн. АМН України. —1995. —т. 1, N 2. —С. 373—378.
9. Sakharov D.A., Salanki J. Physiological and pharmacological identification of neurons in the central nervous system of Helix pomatia L.//Acta Physiol. Acad. Sci. Hung. —1969. —N 35. —P. 19.
10. Hill B. Ionic channels of exitable membrane. —Soderland Mass: Sinauer Assoc, 1984. —426 p.
11. Фудель-Осипова С.И., Каган Ю.С., Ковтун С.Д. и соавт. Физиолого-биохимические механизмы действия пестицидов. —Киев: Наукова думка, 1981. —С. 73.
12. Каган Ю.С. Общая токсикология пестицидов. —Киев: Здоров"я, 1981. —С. 119—124.


| Содержание |