УДК 615.275.4.015.4

ВЛИЯНИЕ ЭНОМЕЛАНИНА НА ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ДИОКСИДА АЗОТА

Н.Я.Головенко, акад. АМН Украины, Б.Н.Галкин, д.б.н., Н.Д.Хаустова, к.б.н., В.Н.Тоцкий, проф., В.Е.Осетров, к.б.н., Т.О.Филиппова, д.б.н., В.М.Сава, к.х.н., А.В.Тихонов

Одесский государственный университет им. И.И. Мечникова, Проблемная научно-исследовательская лаборатория N 5, г. Одесса, Украина

В современных условиях загрязнение окружающей среды мутагенами химической и физической природы создает угрозу увеличения уровня мутаций, в том числе и у человека. Поэтому все большую актуальность приобретает изучение последствий воздействия мутагенных факторов на популяции и изыскание лекарственных средств для защиты генома от их повреждающего действия. Одним из основных загрязнителей воздуха является диоксид азота. Генотоксическое и канцерогенное действие этого газа может реализовываться по двум механизмам. С одной cтороны, — за счет образования свободнорадикальных форм, повреждающих ДНК, а с другой, — за счет образования в организме нитрозосоединений. Удобным модельным объектом для изучения генетических эффектов мутагенов на эукариотические организмы является дрозофила. Среди показателей, определяющих жизнеспособность дрозофилы в условиях действия мутагенов, наибольший интерес представляет продолжительность жизни. Известно, что NO₂ способен вызывать сцепленные с полом летальные мутации у D.melanogaster и по своей мутагенной активности соответствует стандартному мутагену этилмочевине [1]. Комплексное воздействие природными геропротекторами, антимутагенами, антиоксидантами эффективно замедляет скорость старения дрозофилы, индуцированного различными мутагенами. Поэтому, целью нашей работы было исследование влияния природного антиоксиданта эномеланина на свободнорадикальные повреждения ДНК и на продолжительность жизни D.melanogaster в норме и при воздействии NO₂.

В эксперименте использовали эномеланин — полифенольный пигмент, выделенный из винограда в Физико-химическом институте им. А.В.Богатского АН Украины. Исследования антимутагенного действия эномеланина проведены по методу [2], концентрацию диоксида азота измеряли спектрофотометрически [3], процесс образования перекрестных сшивок ДНК—ДНК оценивали с помощью электрофоретического теста [4]. Повреждение ДНК вызывали продуктами пероксидазного окисления стандартного мутагена бензидина. Инкубационная среда объемом 30 мкл состояла из 1,838x10^-9М пероксидазы хрена, 3x10^-4М бензидина, 10^-3М перекиси водорода, 0,8 мг ДНК фага l, эномеланина (конечные концентрации: 5–0,00005 %). Время инкубации 5 мин, температура — комнатная. Электрофорез проводили в 0,9 % агарозе. Гели окрашивали бромистым этидием в проходящем УФ-свете. Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием коэффициента Стьюдента [5].

В опытах in vitro установлено, что обработка ДНК продуктами пероксидазного окисления бензидина приводит к 100 % повреждению этих биомакромолекул. При этом ДНК теряет электрофоретическую подвижность и остается на старте. Внесение эномеланина в инкубационную среду в конечной концентрации 5x10^-5% оказывает защитный эффект (54 % ДНК сдвигается с линии старта). Повышение концентрации эномеланина в инкубационной среде увеличивает долю электрофоретически подвижной ДНК, максимум наблюдается при концентрациях 5x10^-2 и 5x10^-3 % (достигает 98 % от ДНК, нанесенной на линию старта). По-видимому, при указанных концентрациях эномеланина достигается полная защита ДНК от действия свободнорадикальных продуктов, образующихся при пероксидазном окислении бензидина, и межмолекулярные сшивки в ней не образуются. Результаты этих исследований (см. рисунок) свидетельствуют о способности эномеланина оказывать защитное действие при свободнорадикальном повреждении ДНК, что позволяет прогнозировать наличие антимутагенных свойств у этого вещества.

Изучение антимутагенных свойств эномеланина было проведено в опытах с D.melanogaster по критерию продолжительности жизни. В литературе имеются сведения о генетической детерминированности этого показателя, хотя данный вопрос нельзя считать окончательно решенным. Установлено, что продолжительность жизни взрослых особей зависит от ряда факторов и является строго полигенным признаком с невысоким коэффициентом вариации [6].

Генотоксический эффект вызывался при воздействии диоксида азота, который в испытанных концентрациях приводил к сокращению продолжительности жизни, особенно выраженному у самцов. Добавление в корм эномеланина (0,16 мкг/мл среды) приводило к увеличению продолжительности жизни самцов при действии диоксида азота на 30 % по сравнению с контролем. В опытах на самках данный препарат практически полностью снимал токсический эффект диоксида азота (см. таблицу). Различная продолжительность жизни дрозофил, по-видимому, обусловлена действием двух главных генов [7]. Гибридологический анализ показал, что один из локусов (с аллелями А₁ и А₂ ) является аутосомным, второй локус (аллели Х₁ и Х₂ ) сцеплен с полом. Гомозиготные самки по аллелю Х₁ живут дольше, чем гемизиготные самцы. Тем не менее, показано, что сцепленные с полом аллели Х₁ и Х₂ играют второстепенную роль в определении продолжительности жизни дрозофил [8]. Есть основания полагать, что за этот показатель жизнеспособности ответственна хромосома 3, с генетической информацией которой связано 66—72 % изменчивости у самок [9]. Эпистатические эффекты выражены сильнее у самцов, что может быть одной из причин укорочения сроков их жизни по сравнению с самками. В опытах, проведенных in vitro, установлено, что защитный эффект эномеланина может реализовываться за счет улавливания свободных радикалов. Установлено [10], что эномеланин может легко адсорбироваться на поверхности макромолекул ДНК, белка и внутриклеточных мембран. Причем, сорбирующий белок нередко переводит пигмент в состояние семихинонного радикала. В таком состоянии эномеланин легко взаимодействует со свободными радикалами с образованием стабильного продукта. Это, в свою очередь ведет к обрыву цепей свободнорадикальных реакций. Поэтому улавливание эномеланином свободных радикалов приводит к защите как всего генома, так и, в частности, хромосомы 3, которая ответственна за продолжительность жизни d.melanogaster. При концентрациях эномеланина превышающих 5*10^-2 % наблюдается увеличение образования межмолекулярных сшивок ДНК—ДНК (рисунок). Это объясняется тем, что увеличение концентрации эномеланина приводит к накоплению семихинонных радикалов, которые при большой концентрации могут сами вызывать образование межмолекулярных сшивок. Таким образом, эномеланин является перспективным соединением для создания фармакологического препарата с антигенотоксическими свойствами.

ЛИТЕРАТУРА
1. Guidotti T.L. The higher oxides of nitrogen: inhalation toxicology.//"Environ. Res." —1978. —vol. 15. —N 3. —P. 443—472.
2. Challis B.C., Shuker D.E.G. et al. Amine nitration and nitrozation by gaseous nitrogen dioxide.//IARC Sei. Publ. —1982. —N 41. —P.11—20.
3. Shiomi T., Hisamo K. Mutagenicity of nitrogen dioxide and its combined effect with ethylurea in Drozophila melanogasters.//"3rd Int. Conf. Environ. Mutagens. Tokyo, Mishima, Kyoto, Sept. 21—27,1981, Abstr. "S. 1, 1981, P. 127.
4. Бердышев Г.Д., Дьячковская Т.Б. Использование дрозофилы в изучении ускоренного старения //Ускоренное старение, связь с возрастной патологией. Тез. докл. научн. конф. 13—15 октября 1992 г., Киев. —К., 1992. —С. 22.3
5. A. c. СССР N 1732671, МКИ С 07 G 17/00, С 25 В 3/00. Способ выделения меланина из водных растворов / Сава В.М., Макан С.Ю., Куев В.Л. Заяв. 24.08.89. Опубл. 24.01.92.
6. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Акиньшина Л.П. Исследование генетических эффектов лекарственных веществ и других биологически активных соединений в тестах на мутагенез и ДНК-повреждающее действие//Хим-фарм.ж. —1982. —N 10. —C. 1163—1167.
7. Унифицированные методы определения атмосферных загрязнений М: СЭВ, 1973, —250 с.
8. Maru G.B., Bhide S.V. DNA damagge as a marker of exposure to carcinogens.//J.Toxicol.Toxin Rev. —1989. —8, N 1—2. —P. 177—193.
9. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика М.: Высшая школа, 1975. —320 с.
10. Durbin E.J., Yoon J.S. Zongevity in the Drosophila virilis Species Group./:The D.virilis Phylad.//Ohio J.Sci. —1986. —v. 86. —N 1. —P. 14—17.
11. Luckinbill L.S., Clare M.J. A density threshold for the expression of longevity in Drosophila melanogaster //Hevedity. —1986. —v. 56. —N 3. —P. 329—335.
12. Лях И.П., Моссэ И.Б., Сальникова Л.Н., Кострова Л.Н. Структура мутационного груза в популяциях дрозофилы после 100 поколений облучения и воздействия антимутагеном //VI Всесоюзное совещание по проблемам биологии и генетики дрозофилы /г. Одесса, 7—12 сентября 1989 г./ Одесса, 1989. —C. 61—62.
13. Yonemura I., Abe M., Ishidate R., Ishiyama T., Motoyama T.,Hasekura H., Boettcher B. Influence of temperature on the inheritance of adult life span in Drosophila melanogaster //Hereditas. —1990. —v. 112. —N 2 . —P. 117—127.
14. Luckinbill L.S., Graves J.L., Reed A.H., Koetsawang S. Localizing genes that defer senescence in Drosophila melanogaster // Heredity. —1988. —v. 60. —N 3. —P. 367—374.
15. Жеребин Ю.Л., Сава В.М., Богатский А.В. Исследование природы пара-магнетизма эномеланинов. I. Индуцированный анион-радикал семихинона //Ж. общ. химии. —1983. т. 53. Вып. I. —C. 164—172.