УДК 615.9:632.95.025:577.15

ПРОЦЕСИ ВІЛЬНОРАДИКАЛЬНОГО ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ В МЕХАНІЗМІ ДІЇ СИНТЕТИЧНИХ ПІРЕТРОЇДІВ

В.Г.Бардов, д.м.н., проф., О.Б.Леоненко, д.б.н., С.Т.Омельчук, к.м.н., Л.М.Сасінович, д.м.н.

Національний медичний університет імені О.О.Богомольця, м. Київ

Вступ
Актуальною проблемою токсикології, пов'язаною з безпечним використанням пестицидів, є удосконалення підходів до оцінки їх пошкоджуючої дії. В залежності від кількісної та якісної характеристики дії ксенобіотиків в організмі можуть переважати патологічні зміни, які на певній стадії приводять до його загибелі або розвиваються процеси компенсації, адаптації, пристосування до змінених умов існування без виражених порушень гомеостазу [1]. Перевага однієї із двох вказаних тенденцій визначає наявність або відсутність інтоксикації, а також ступінь її вираження. Ці стани можна розмежувати, досліджуючи чутливі до дії ксенобіотиків системи. Однією з них може бути система вільнорадикального перекисного окислення ліпідів, інтенсифікація якої є універсальним механізмом пошкодження клітин і спостерігається при різних патологічних станах організму, зокрема викликаних дією хімічних факторів [2—6]. З вільнорадикальними механізмами пов'язують розвиток таких віддалених ефектів дії хімічних речовин, як мутагенність та канцерогенність [7, 8].

Вільнорадикальне перекисне окислення ліпідів (ПОЛ) є процесом окисної деструкції ліпідів з ненасиченими подвійними зв'язками. В нормі рівень ПОЛ відносно низький, стаціонарний, пов'язаний з обміном ліпідів, синтезом простогландинів, лейкотриєнів і інших сполук. За участю ПОЛ відбувається трансмембранна передача хімічних сигналів [9—11]. Збільшення інтенсивності ПОЛ призводить до дезорганізації структури біологічних мембран, пригнічення активності життєвоважливих ферментів, пошкодження ДНК, РНК, хроматину ядра [2, 7, 12—14]. Гальмування ж активності ПОЛ може бути причиною порушення синтезу деяких біологічно активних речовин в організмі та свідченням зниження фагоцитозу, як важливої ланки імунної системи [15].

Інтенсивність перекисного окислення ліпідів зумовлюється вільними радикалами хімічних речовин, що з'являються при їх метаболічній активації, і активними формами кисню, які утворюються в ланцюгах мітохондріального та мікросомального окислення [1, 3, 16, 17]. Інтенсифікації ПОЛ сприяють зниження внутрішньоклітинного вмісту антиоксидантів (a-токоферолу, аскорбінової кислоти, селену) і активності ферментів антиоксидантних систем (супероксиддисмутази, глютатіонпе-роксидази, каталази) [18].

За структурою і механізмом дії пестициди можуть впливати на ПОЛ. Це індукція монооксигеназної системи, вплив на антиоксидантну активність, стан мембран, ендокринну систему [2, 13].

Серед пестицидів інтенсифікація вільнорадикального ПОЛ виявлена при дії похідного гідразину [19], діпіріділієвої сполуки параквату [20], фосфорорганічного препарату хлорофосу [18], хлорорганічних сполук ліндану і ДДТ [21], синтетичного піретроіду децису [22]. Переважна більшість цих даних стосується дії високих токсичних рівнів пестицидів. В реальних же умовах має місце вплив хімічних факторів малої інтенсивності, що підлягає вивченню. Не з'ясована також роль вільнорадикального ПОЛ в механізмі дії пестицидів в залежності від їх будови, рівнів і тривалості дії, а також значимість змін активності ПОЛ у виявленні їх пошкоджуючої дії.

Мета роботи.
В зв'язку з викладеним метою роботи було вивчення особливостей змін інтенсивності процесів вільнорадикального перекисного окислення ліпідів в організмі теплокровних тварин при дії пестицидів групи синтетичних піретроїдів в залежності від рівнів доз і тривалості дії та обгрунтування доцільності дослідження цієї системи при оцінці негативного впливу сполук даної групи.

Матеріали та методи.
Вибір сполук. Для дослідження були відібрані 5 сполук із класу синтетичних піретроїдів, в молекулу кожного з яких входить ціаногрупа. Як було встановлено раніше [23], наявність в молекулі ціаногрупи зумовила підвищення токсичності. Відбір для дослідження синтетичних піретроїдів грунтується на припущенні, що здатність їх проявляти мембранотоксичну дію [22, 24] є результатом активації вільнорадикальних процесів.

Сполуки, що досліджувались:
- данітол (фенпропатрин)-a-ціано- 3- феноксібензил -2,2,3,3 - тетраметил-циклопропанкарбоксилат;
- децис (дельтаметрин)-a-ціано -3-феноксібензил-цис-3 -(2,2-дібромвініл)-2,2-діметил-циклопропанкарбоксилат;
- маврик (флувалінат)-a-ціано-3 -феноксіфеніл-метил-N -(2-хлоро-4-трифторметил) -D-валінат;
- фастак (-a-циперметрин)-a-ціано-3-феноксібензил-3 -(2,2-діхлорвініл)-2-2-діметил-циклопропанкарбоксилат;
- циболт (флуцитринат)-a-ціано-3-феноксібензил(S) -2- (R-діфторметоксіфенил) -3-метилбутірат.

Дози, тривалість дії, тварини. Препарати досліджували в дозах на рівні ефективних і порогових по загальнотоксичних показниках. Тривалість дії: одноразова, протягом 2 і 6 місяців. Піддослідні тварини: нелінійні дорослі щури обох статей. Маса тіла тварин в гострих і субхронічних експериментах становила 180-220 г, вихідна маса тіла в хронічних дослідах — 100-120 г. Препарати вводили в шлунок з допомогою зонда. При одноразовій дії досліджували децис в дозах, що становили 0,1 ЛД₅₀ (6 мг/кг) і 0,02 ЛД₅₀ (1,2 мг/кг); в субхронічному експерименті протягом 2 місяців щурам вводили піретроїди в дозі на рівні 0,1 ЛД₅₀, що становило для: децису - 6 мг/кг; данітолу - 10 мг/кг; фастаку - 5 мг/кг; маврику - 26 мг/кг; циболту - 7 мг/кг.

В хронічному (6 міс) досліді вивчали вплив децису в дозах 0,01 ЛД₅₀ (0,6 мг/кг) і 0,001 ЛД₅₀ (0,06 мг/кг).

Досліджувані показники. Стан ПОЛ оцінювали за інтенсивністю хемілюмінесценціі, що є інтегральним показником прооксидантної рівноваги в організмі. Після додавання іонів заліза до системи, що вміщує ліпіди, виникає випромінювання, яке розділяється на декілька стадій: швидкий спалах, амплітуда якого (h) залежить від кількості гідроперекисів в системі; латентний період (t), тривалість якого обумовлюється антиоксидантною активністю; повільний спалах, амплітуда якого (Н) відображає здатність ліпідів до переокислення, а тангенс кута нахилу його (tg a) -швидкість окислення [25].

Як показники ПОЛ використовували також інтенсивність спонтанного і аскорбатзалежного накопичення ТБК-активних продуктів, вміст дієнових кон'югатів [26] і Шиффових основ [27], що традиційно використовуються для оцінки стану реакцій цієї системи. Кількість ТБК-активних продуктів, які є кінцевими в ланцюгу ПОЛ, визначали по реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) [26].

Антирадикальну активність (АРА) в сироватці крові та цитозолі гепатоцитів визначали за пригніченням хемілюмінесценції люмінолу [28].

Активність монооксигеназної гідроксилюючої системи (МОГС) печінки, що відіграє значну роль в детоксикації, визначали по інтенсивності деметилювання амінопірину [29].

Паралельно досліджували показники, які були лімітуючими при токсиколого-гігієнічному регламентуванні досліджуваних синтетичних піретроїдів. В плазмі крові та печінці визначали активність ферментів: аланінамінотрансферази — АЛТ (К.Ф.2.6.1.2.), аспартатамінотрансферази — АСТ (К.Ф.2.6.1.1.) [30], холінестерази — ХЕ (К.Ф. 3.1.1.8.) [31]; в мозку — активність Na⁺, K⁺ — АТФ-ази (К.Ф.3.6.1.3.) [32] та активність АХЕ (К.Ф. 3.1.1.7) [31].

Одержані результати піддавали статистичній обробці за методом варіаційної статистики з розрахунком середніх арифметичних вибірки, середніх квадратичних відхилень і ступеню вірогідності результатів при рівні вірогідності Р <= 0,05. Математичну обробку даних здійснювали на ЕОМ 386 з використанням пакету програм "Statgraph".

Результати.
Після одноразової дії децису в ефективній по загальнотоксичних показниках дозі — 0,1 ЛД₅₀ спостерігалась інтенсифікація процесів ПОЛ (табл. 1), що проявлялось збільшенням амплітуди швидкого спалаху (h). На користь цього свідчило також збільшення інтенсивності спонтанного і аскорбат-залежного накопичення ТБК-активних продуктів в печінці (рис. 1, А, Б). Антирадикальна активність в крові, яка протидіє інтенсифікації ПОЛ, була також знижена через 1 год і добу після введення децису. МОГС печінки реагувала індукцією, про що свідчило підвищення активності деметилювання амідопірину (рис. 1, В). Разом з тим, зменшення в подальшому сумарного випромінювання за 6 хв, тангенса кута повільного спалаху хемілюмінесценції, амплітуди повільного спалаху і тривалості латентного періоду (табл. 1) говорять про сповільнення процесів ПОЛ.

За даних умов досліду відмічалось суттєве пригнічення активності ХЕ в печінці — на 47 % (1 год.) і 36 % (1 доба), а також в мозку — на 31 % і 42 %, відповідно. Про пошкоджуючу дію децису в дозі, що становить 0,1 ЛД₅₀, свідчило підвищення активності АЛТ в сироватці крові одночасно зі зниженням її активності в печінці.

В дозі на рівні 0,02 ЛД₅₀ пошкоджуючої дії децис не чинив, активності ХЕ не гальмував. Зміни, що спостерігались при цьому (зниження активності МОГС, збільшення інтенсивності хемілюмінесценції) скоріше говорили про вплив на мембрани і ліпопротеїди, можливо, за рахунок зв'язування препарату з ними.

В субхронічному експерименті протягом 2 міс при щоденній дії піретроїдів при дозі на рівні 0,1 ЛД₅₀ в інтенсивності хемілюмінесценції сироватки крові відмічалось зниження кута нахилу, проте, достовірним воно було тільки при дії маврику, а також амплітуди повільного спалаху, достовірного за дії маврику, фастаку і децису (табл. 2). При дії маврику гальмування хемілюмінесценції було найбільш вираженим, оскільки при цьому знижувалось (на 41 %) також сумарне випромінювання за 6 хв.

Інтенсифікація процесів ПОЛ в печінці відмічена при дії фастаку і децису за збільшенням спонтанного накопичення ТБК-активних продуктів на 93 % і 78 % , відповідно.

Однонаправлених змін активності МОГС не виявлено (табл. 2). При цьому антирадикальна активність сироватки крові не відрізнялась від цього показника у контрольних тварин. Інтенсивність аскорбатзалежного накопичення ТБК-активних продуктів була однаково знижена при дії данітолу, маврику, фастаку і децису — приблизно на 30 %.

Активність ХЕ в еритроцитах при дії зазначених вище піретроїдів в субхронічному експерименті достовірно знижувалась на 46—64 % (табл. 2). Винятком був циболт, при дії якого активність ХЕ була вищою, ніж у контрольних тварин.

Результати субхронічного експерименту, свідчать, що найбільш вираженим і стабільним було гальмування активності ХЕ в еритроцитах.

Процеси ПОЛ порушувались в меншій мірі і не всіма досліджуваними препаратами. Так, накопичення ТБК-активних продуктів в печінці виникало тільки при дії фастака і дециса. Разом з тим, інтенсивність хемілюмінесценції при дії цих препаратів суттєво не відрізнялась від цього показника у контрольних тварин. Достовірне гальмування хемілюмінесценції спостерігалося при дії маврика, при цьому антирадикальна активність крові не порушувалась, що, можливо, пов'язано з впливом піретроїдів на ендокринну систему і подальшим виходом в кров гормонів [33].

Результати хронічного експерименту свідчать, що найбільший вплив щоденної дії децису спостерігався, в основному, через 0,5 та 1 міс від початку введення препарату. Зміни показників ПОЛ були виражені у більшій мірі в порівнянні зі змінами активності ХЕ та інших досліджуваних тестів (амінотрансфераз; К⁺, Na⁺ АТФ-ази, Р-450, білку, сечовини).

Протягом 6 міс щоденної дії децису спостерігалося дозозалежне збільшення спонтанного накопичення ТБК-активних продуктів в печінці (рис. 2). Максимальні зміни відмічалися через 1 міс від початку експеримента з нормалізацією на 6-му місяці при дії в дозі 0,01 ЛД₅₀ і на 3-му місяці — в дозі 0,001 ЛД₅₀.

Аналогічний характер змін спостерігався і в інтенсивності ініційованої хемілюмінесценції. При дії децису в дозах 0,01 ЛД₅₀ та 0,001 ЛД₅₀ через 1 міс від початку експерименту відмічалось збільшення сумарного випромінювання відповідно на 56 % і 93 %, тривалості латентного періоду на 93 % і 63 % через 0,5 міс, тангенсу кута нахилу повільного спалаху на 108 % і 137 % через 1 місяць. Статистично значимим було також зменшення тривалості латентного періоду через 3 міс і збільшення через 6 міс; зниження тангенса кута нахилу повільного спалаху через 0,5 міс та збільшення амплітуди повільного спалаху через 1 міс при дії 0,001 ЛД₅₀ (табл. 2).

В меншій мірі, але статистично значимо, знижувалась активність МОГС, холінестерази. Вміст цитохрому Р-450 не змінювався. В цей термін дослідження зареєстровано підвищення антирадикальної активності в сироватці крові, що може бути обумовлено підвищенням проникливості мембран і виходом в кров антиоксидантів. При цьому єдиною захисною реакцією було підвищення активності антиоксидантного захисту. Свідченням цього було зменшення аскорбатзалежного накопичення ТБК-активних продуктів, яке залежить не тільки від субстратів переокислення, а й від ферментів антиоксидантного захисту. Ця протидія у подальшому (3 і 6 міс) призводила до зменшення змін досліджуваних показників.

В активності амінотрансфераз та К⁺, Na⁺—- АТФ-ази спостерігалась фазовість змін, що притаманна біологічним системам при дії різних факторів, в тому числі хімічних.

Виходячи зі змін досліджуваних показників в хронічному досліді, дозу дециса на рівні 0,01 ЛД₅₀ можна розцінювати як діючу, 0,001 ЛД₅₀ — як порогову.

Висновки.
1. Отруєння теплокровних тварин синтетичними піретроїдами супроводжується активацією перекисного окислення ліпідів. Зміни інтенсивності переокислення ліпідів, як в печінці так і в крові, є свідченням пошкоджуючої дії пестицидів на відміну від індукції монооксигеназної гідроксилюючої системи печінки, що може бути проявом захисної реакції.

2. Одноразова і повторна дія синтетичних піретроїдів (децису, данітолу, маврику, фастаку) в токсичних дозах викликає у щурів значиме пригнічення активності холінестерази в еритроцитах, що переважає зміни інтенсивності ПОЛ, як за величиною, так і за частотою їх прояву. Разом з тим, тривале введення тваринам синтетичних піретроїдів (децису) в дозах на рівні порогових призводить до більш значимих порушень показників ПОЛ в порівнянні зі змінами активності холінестерази та інших показників (амінотрансфераз; К⁺, Na⁺ — АТФ-ази, білку, сечовини).

3. Одержані експериментальні дані про зміни інтенсивності ПОЛ в умовах одноразової та повторної дії п'яти синтетичних піретроїдів дозволяють рекомендувати показники ПОЛ в якості критеріїв пошкоджуючої дії пестицидів цього класу.

ЛІТЕРАТУРА
1. Курчий Б.А., Койдан Г.Н. Механизм действия регуляторов роста // Химия и жизнь. —1985. —N 10 —С. 68—69.
2. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран // Биофизика. —1987. —32, N 5 —С. 830—844.
3. Губский Ю.И. Коррекция химического поражения печени. —К.: Здоров'я, 1989. —168 с.
4. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов // Успехи совр. биол. —1991. —111, N 5. —С. 922—930.
5. Роль монооксигеназной системы в метаболизме и механизме действия некоторых пестицидов / Каган Ю.С., Ершова Е.А., Леоненко О.Б., Клисенко М.А., Жминько П.Т., Зейналова Т.А. // Вестник АМН СССР. —1988. —N 1. —С. 70—76.
6. Левицкий Е.Л., Марченко А.Н., Губский Ю.И. Механизмы генотоксичности фосфорорганических соединений // Современные проблемы токсикологии. —1998. —N 1. —С. 47—50.
7. Ames B.N. Enolodene DNA damage is related to cancer and agang // Mutat. Res. —1989. —214, N 1. —P. 41—46.
8. Kukielka E., Cederbaum A.I. DNA strend cleavage as a sensitive assay for the production of hydroxye radicals by microsomes: hole of cytochrome P-450 2 E 1 in the increased activity afterethanol treatment // Biochem. I. —1994. —302. N 3. —P. 773—779.
9. Кожевников Ю.Н. О перекисном окислении липидов в норме и патологии // Бюл. эксперим. биол. и медицины. —1985. —N 5. —С. 2—7.
10. Ланкин В.З. Ферментативное перекисное окисление липидов // Укр. биохим. ж. —1984. —56, N 3. —С. 317—331.
11. Halliwell B. Free radicals and metal ions in health and disease // Proc. Metr. soc. —1987. —46, N 1. —P. 13—26.
12. Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., Волков Г.Л. Жирнокислотный состав фракций хроматина печени крыс в условиях стимуляции перекисного окисления липидов // Укр. биохим. журн. —1991. —63, N 1. —С. 87—91.
13. Молекулярные механизмы повреждения фракционированного хроматина печени терахлорметаном / Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., Жила В.А., Литошенко А.Я. // Вопросы мед. химии. —1992. —38. N 3. —С. 54—58.
14. Левицкий Е.Л., Губский Ю.И. Свободнорадикальное повреждение ядерного генетического аппарата клетки // Укр. биохим. журн. —1994. —66, N 4. —С. 18—30.
15. Перекисное окисление липидов в печени крыс при стимуляции макрофагов / Семенюк А.В., Воронин А.Ю., Куликов В.Ю., Маянский Д.Н.// Бюл. эксперим. биол. и медицина. —1986. —N 6. —С. 453—455.
16. Cadenas E., Brigelius R., Sies H. Paraguat-induced chemiluminescence of microsomal fraction // Biochem., Pharmacol. —1983. —32, N 1. —P. 147—160.
17. Ogata T., Manabe S. Correlation between lipid peroxidation and morphological manifestation of paraguat-induced lung injuri in rats // Areh. Toxicol. —1990. —64, N 1. —P. 7—13.
18. Перекисное окисление липидов и транспорт Са²⁺ в микросомах печени крыс при интоксикации хлорофосом и действии атропина и верапамила / Губский Ю.И., Литвинова Н.В., Примак Р.Г., Курская Н.М. // Укр. биохим. журн. —1994. —6, N 1. —С. 73—78.
19. Авакян А.Х. Новые молекулярные критерии оценки токсического действия производных гидразина. Активные формы кислорода как ключевые агенты в механизме токсичности // Фармакология и токсикология. —1990. —N 1. —С. 70—73.
20. Aldrich K., Fisher A., Cadenas E. Evidence for lapid peroxidation by paraguat in the perfused rat lung // J. Lab. and Clin. Med. —1983. —101, N 1. —P. 66—73.
21. Новые аспекты механизма токсического действия линдана // Кокаровцева М.Г., Шушурина Н.А., Репецкая А.Г., Мурашко С.В., Куценко Л.А. // Гигиена применения, токсикология пестицидов и полимерных материалов. —Киев: ВНИИГИНТОКС, 1986. —Вып. 16. —С. 77—81.
22. Середа П.И. Антиамнестическая эффективность альфа-токоферола, селенита натрия и парацетамола у крыс, отравленных децисом или этиленгликолем // Фармакология и токсикология. —Киев: Здоров'я, 1992. —Вып. 27. —С. 7—12.
23. Сасинович Л.М., Паньшина Т.Н. Биологическая активность синтетических пиретроидов в зависимости от их химического строения // Актуальные вопросы токсикологии, гигиены применения пестицидов и полимерных материалов в народном хозяйстве: Киев, 1990. —С. 81.
24. Сасинович Л.М., Паньшина Т.Н., Ходоско О.В. Гепатотоксическое действие пиретроидов // Гигиена применения, токсикология пестицидов и полимерных материалов. —Киев: ВНИИГИНТОКС, 1986. —Вып. 16. —С. 74—77.
25. Владимиров Ю.А., Суслов Т.Б. Реакции цепного окисления липидов в мембранных структурах клетки // Сверхслабое свечение в биологии: Труды МОИП. —М.: Наука, 1974. —С. 38—51.
26. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. —М.: Наука, 1972. —252 с.
27. Esterbaner H., Koller E., Koster J. Possible involvement on the lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal in the formation of fluorencent chromolipids // Biochem. J. —1989, 239, N 2. —P. 405—409.
28. Hodson E., Fridovich J. The role of O2 in the chemiluminescence of Luminol // Photochemistry and Photobiology. —1973. —18, N 6. —P. 451—455.
29. Клингер В. Кинетика N-деметилирования амидопирина надосадочной частью центрифугата печени новорожденных и взрослых крыс в присутствии барбитала, фенобарбитала и фенилбитозона // Фармакология и токсикология. —1972. —N 1. —С. 63—68.
30. Reitman S., Frankel S. Acolorimetric method for the determination of serum glutamicoxalacetic and glutamicpyruvic transaminnases // Amer. J. Clin. Phath. —1957. —28. —P. 56—59.
31. Hestrin S. The reaction of acetylcholine and other carboxilic acid derivatives with hydroxylamine and its biologcal application //J.Biol. Chem. —1949. —180. —P. 249—262.
32. Веременко Л.М. Определение К⁺, Na⁺ — АТФ-азной активности "грубых мембран" головного и спинного мозга // Биохимические методы в токсикологическом эксперименте и клинике: Методическое руководство. —Киев, 1985. —С. 84—87.
33. Crеmer J.E., Seville M.P. Comparative effects of two pyrethroids deltametrin and cismethrin on plasma catecholamines and on blood glucose and lactate // Toxicol. appl. Pharmacol. —1982. —66. O. P. 124—133.