ПРОБЛЕМА ГЕНОТОКСИЧНОСТИ НА VIII МЕЖДУНОРОДНОМ КОНГРЕССЕ ТОКСИКОЛОГОВ

5-9 июля в Париже состоялся очередной VIII Международный конгресс токсикологов. Программа конгресса была чрезвычайно насыщенной и разнообразной. На этом представительном Всемирном Форуме токсикологов среди приоритетных направлений развития современной токсикологии были рассмотрены следующие: репарация ДНК и риск опухолеобразования, нарушения клеточных сигнальных систем, активация пероксисом, роль апоптоза в токсикологии и патологии, генетический полиморфизм ферментов метаболизма ксенобиотиков, генетическая чувствительность к возникновению профессиональных заболеваний, некоторые вопросы химического канцерогенеза и другие. Уже из этого краткого перечня видно, что на конгрессе четко прослеживалась тенденция главенствующей роли молекулярно-токсикологических исследований. Это нашло свое отражение и в перечне рабочих групп конгресса, среди которых можно выделить такие как механизмы возникновения и определение аддуктов ДНК, генотоксические агенты и апоптоз, применение трансгенных животных в токсикологии и другие. В числе основных направлений самой молекулярной токсикологии наиболее важным и приоритетным было рассмотрение механизмов генотоксичности. Учитывая неблагоприятную экологическую ситуацию в Украине, все возрастающее отрицательное влияние повреждающих факторов химической и радиационной природы на здоровье населения, рассмотрение современного состояния исследований по генотоксичности является крайне актуальным.

Экспериментальным исследованиям, прямо связанным с вопросами генотоксичности, на конгрессе было посвящено 49 докладов. Общим для этих исследований является применение современных методов молекулярной генетики для выяснения молекулярных механизмов повреждения ДНК в составе ядерного хроматина. Кроме возросшего методического уровня исследований по генной токсикологии необходимо также отметить попытки ученых, работающих в этой области, создать наиболее адекватные экспериментальные модели, позволяющие с максимальной полнотой ответить на вопросы, касающиеся механимов возникновения конкретной молекулярной патологии и подходов к ее возможной коррекции.

В докладе M. Aujoulat et al. использовали in vivo тест состояния микронуклеуса эритроцитов костного мозга крыс при различных путях введения маркерного токсиканта — циклогексимида (перорального, внутривенного и внутрибрюшинного). Было обнаружено, что при этих путях введения циклогексимида частота соотношения "полихроматиновые/нормохроматиновые" эритроциты остается неизменной. Это позволяет рекомендовать использование внутрибрюшинного пути введения мутагенов экспериментальным животным для выяснения механизмов генотоксичности данного класса токсикантов. В особенности примененение данного подхода оправдано в тестах хронической токсичности, когда применение трудоемкого внутривенного или перорального путей введения токсикантов доставляет определенные неудобства экспериментатору.

В своем исследовании D.Brault et al. применили тест "гель-электрофорез одной клетки" ("single cell gel electrophoresis") для обнаружения тканеспецифических повреждений ДНК в клетках слизистой кишечника мышей после перорального введения N-метил-N¹-нитро-нитрозогуанидина и бэта-пропиолактона. Данный тест авторы использовали для определения органной специфичности токсикантов, которые известны как высокотоксичные алкилирующие агенты, способные вызывать повреждения ДНК и образование опухолей у грызунов при пероральном введении. Для обоих соединений была обнаружена значительная индукция разрывов ДНК через 1 и 2 часа после введения (первое соединение вводили в дозе 20 мг/кг, а второе — 25 мг/кг). Данный эффект быстро снижался через 4 часа после введения токсикантов. Подобный "хвостовой эффект" был отмечен также в клетках печени и костного мозга. Однако, графическая форма подобного эффекта отличалась для данных тканей по сравнению со слизистой желудка, где она была более вытянутой. Авторы делают вывод о том, что данный тест может быть использован для предсказания органной специфичности генотоксических канцерогенов.

В докладе S.Sardas et al. при использовании этого же метода регистрации повреждений ДНК (SCGE-comet assay) анализировали наличие подобных повреждений в лимфоцитах пациентов перед и после анестезии изофлураном. Авторы обнаружили наличие подобных повреждений у пациентов, подвергнутых анестезии данным токсикантом по сравнению с контрольной группой. Через 2 часа после анестезии интенсивные процессы репарации ДНК привели к нивелированию различий между опытной и контрольной группами. Используя этот же метод фиксации генотоксических нарушений структуры ДНК, а также метод обнаружения подобных нарушений в щелочных условиях с последующим флуоресцентным зондированием разрывов ДНК, иммобилизированной в ЭФ-геле, S.Devery et al. исследовали непрерывно делящиеся клеточные линии и сравнивали их с контрольными клетками (первичная культура). Основанием для проведения подобного исследования послужили факты о том, что непрерывно делящиеся клетки по ряду свойств (измененная морфология, метаболические свойства и клеточный ответ на воздействия) отличаются от контрольных. По базальному уровню ряд исследованных клеточных линий (мышиные кератиноциты, линия гепатомы человека и ряд других) не отличаличь по базальному уровню повреждений ДНК от контрольных (первичных культур), однако кератиноциты были менее чувствительными к повреждающему воздействию перекиси водорода, вызывающей образование разрывов в ДНК по сравнению с гепатоцитами. Авторы также обнаружили, что первый из названных методов (SCGE) является более чувствительным при обнаружении повреждений ДНК, чем второй (метод мутационного скрининга — PCR). Используя тот же методический подход (SCGE), A.E.Karakaya et al. изучили состояние ДНК лимфоцитов у персонала, подвергавшегося воздействию анестезирующих газов (галотан, окись азота, изофлуран). Авторы обнаружили, что в лимфоцитах 66 исследованных лиц, подвергшихся воздействию этих агентов уровень повреждений ДНК был достоверно выше по сравнению с другими клетками и лицами контрольной группы. Кроме того, количество таких повреждений было значительно выше у курящих лиц по сравнению с некурящими. Авторы делают вывод о том, что данный метод может найти широкое применение в будущем при проведении широкомасштабных исследований биомониторинга различных групп населения. Этот же метод регистрации генотоксических повреждений ДНК использовали Z.X.Zhaung et al. при исследовании периферических мононуклеаров пациентов с опухолями яичников в условиях терапии циклофосфамидом /карбоплатиной. Кроме вышеназванного методического подхода, авторы определяли также активность ДНК-репарирующего фермента — поли (АДФ-рибозо)-полимеразы по включению 32Р-НАД. Было обнаружено, что уровень повреждения ДНК у пациентов, подвергнутых химиотерапии, был выше в 1,68 раза по сравнению с контрольной группой и в 1,51 раза выше, чем до начала химиотерапии. Эти данные могут лечь в основу мониторинга лекарственной чувствительности и устойчивости во время проведения противоопухолевой химиотерапии.

R.Stenina et al. провели сравнительное исследование способности индуцировать повреждения ДНК ряда метилирующих (SO, моноэпоксибутан, оксид пропилена) и алкилирующих агентов (метилметансульфонат, N-метил-N-нитрозогуанидин). Было обнаружено, что данные группы генотоксических агентов индуцировали мутации предпочтительно в N-7-положении гуанина. Кроме того, вызванные ими повреждения ДНК отличались по щелочночувствительности и по механизмам репарации. Yi-Ching et al. исследовали геноспецифические повреждения и репарацию ДНК, индуцированные бензо(а)-пирен-транс-7,8-дигидродиол-9,10-эпоксидом в клетках опухоли легкого человека (А427и CL-3), гепатомы человека и клетках человека, дефицитных по репарации ДНК (ХР-А). Изучали кинетику возникновения и репарацию повреждений ДНК в гене р-53-супрессоре опухоли ,K-ras-онкогене (который является транскрипционно активным) и бэта-глобиновом гене (который является транскрипционно неактивным). Для определения уровня гено-специфических повреждений и репарации ДНК авторы использовали количественную полимеразную реакцию синтеза новой цепи. В качестве контроля использовали интактные клетки легких. При этом было обнаружено, что ген опухолевого супрессора и интактные клетки легких являются более чувствиттельными к действию генотоксического агента по сравнению с клетками опухоли легких. Новый оригинальный методический подход применили B.Salles et al. при исследовании повреждений ДНК, индуцированных генотоксическими агентами в клетках млекопитающих — тест хемилюминесценции для обнаружения репарации микроколичеств ДНК ( chemiluminescence micro-plate DNA repair assay). После включения поврежденных сайтов в структурно интактную ДНК они были обнаружены с помощью хемилюминесценции в ELISA-подобной реакции. Этот новый анализ позволяет: тестировать ДНК-повреждающие агенты в клеточных линиях крысиных гепатоцитов in vitro, определять скорость репарации поврежденной ДНК при удалении генотоксического агента, оценивать генопротекторный потенциал БАВ. С этой точки зрения в докладе представлены данные, полученные при использовании известных канцерогенов в качестве генотоксинов и в качестве генопротекторных средств — антиоксидантов. Эти же авторы представили еще один доклад, в котором представлены результаты исследований при использовании того же методического подхода определения оксидативных повреждений ДНК при использовании в качестве моделей культур клеток и бесклеточных систем, а также определения протекторной роли антиоксидантов. Подробно данный метод описан в другом месте (Anal. Biochem., 1995, V. 232, P .37—42). В качестве модельной поврежденной ДНК использовали плазмидную ДНК и ДНК из культур клеток. Данный методический подход может быть успешно использован при анализе большого количества токсикантов, а также для скрининга потенциальных антиоксидантов и определения механизмов репарации ДНК при действии генотоксических факторов на клетку.

Используя клетки человека и крыс линии S9, S.Suzuki et al. изучили мутагенность ряда химических соединений. Они обнаружили, что 2-аминоантрацен обладал гораздо большей мутагенностью на клетках человека, чем на клетках крыс. Напротив, бензо(а)пирен, афлотоксин В1, 6-аминокринозен и 2-(ацетиламино)фтор обладали намного меньшей степенью мутагенности на клетках человека по сравнению с крысиными клетками. При использовании клеток печени человека авторы не обнаружили индивидуальных различий в чувствительности к данным мутагенам. Результаты этих исследований in vitro позволяют определять дифференциальную чувствительность индивидуальных клеточных линий к действию генотоксических агентов.

Важные с практической точки зрения данные представили в своем докладе B.Marchinski et al. Они изучали генотоксичность одного из наиболее широко применяемых мономеров пластика стирена. Известно, что основным метаболитом этого соединения является его окись, которая вызывает генотоксические повреждения у работающих с этим соединением, что выявляется в появлении аддуктов и разрывов нитей ДНК. Авторы изучали фрагментацию ДНК клеток крови у работающих со стиреном. При действии на фрагменты высокомолекулярной ДНК SO и перекиси водорода, они обнаружили более высокую степень повреждений у опытных индивидуумов по сравнению с контрольными. Эти результаты показали, что у работающих со стиреном наблюдаются оксидативные повреждения ДНК клеток белой крови. На основании этих данных авторы выдвигают новую гипотезу генотоксического действия стирена.

Используя тест Эймса, И.Р.Барыляк и соавт. изучали генотоксичность частиц атмосферного воздуха в нескольких городах Украины: Полтаве, Севастополе, Симферополе, Житомире. Наибольшей "мутагенностью" обладал воздух Полтавы, наименьшей — Житомира. Высокая степень генотоксичности исследованных частиц атмосферного воздуха была связана с высокими концентрациями бенз(а)пирена, которые превышали предельно допустимый уровень в 7—12 раз.

Оригинальный методический подход для определения уровня генотоксичности использовали H.Frei et al. Он заключается в том, что при действии генотоксических факторов соматические клетки Drosophila melanogaster теряют гетерозиготность. Эта закономерность была обнаружена при использовании ряда известных генотоксических агентов. Новейшие молекулярно-биологические и биохимические методы были использованы A.Hock et al. для обнаружения аддуктов в молекулах ДНК при действии генотоксических факторов на клетку. Они включали пост-мечение ДНК Р32 , ON-LINE HPLC ENRICHMENT и блоттинг. Этот подход позволяет обнаружить менее одного аддукта на 1010 нуклеотидов. Метод был успешно использован для обнаружения аддуктов 4-аминобифенила, о-толуидина и бензо(а)пирена. Использование высокоразрешающей хроматографии высокого давления с протяженными колонками позволяет повысить порог чувствительности метода в 25 раз без какой-либо ощутимой потери разрешающей способности. M.O.Ali et al. сообщили о генотоксическом действии пищевого красителя кармоизина на хромосомы клеток костного мозга крыс. При этом в хромосомах определяли содержание ДНК и РНК. Крысам вводили две дозы Carmoisine limdose: 0,011 мг/ 100 г/день и 0,022 мг/100 г/день в течение 30, 60 и 90 дней. Авторы обнаружили, что в этих условиях кармоизин индуцирует появление хромосомных аберраций в клетках костного мозга крыс. С другой стороны, было обнаружено достоверное возрастание содержания в хромосомах общего белка и РНК. При этом содержание ДНК достоверно падало в течение исследованных временных интервалов, в особенности через 90 суток от начала введения токсиканта.

Доклад S.Lautraite et al. был посвящен изучению ингибирования кверцетином роста опухоли при использовании клонированных человеческих и крысиных генов цитохрома Р-450 в клеточных линиях V-79. При этом изучали модулирующие эффекты кверцетина на метаболическую активацию модельных канцерогенов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что кверцетин может ингибировать активацию токсиканта IQ геном Р-450 1А2, но при этом он не оказывает влияния на активацию ВаР крысиным или человеческим геном Р-450 1А1. Интересные данные были получены P.Cassand et al. при изучении защитного эффекта бутирата натрия в условиях мутагенеза, индуцированного бензо(а)пиреном. Известно, что волокна пищи оказывают ингибирующий эффект на развитие опухолей. При этом бутират является основной короткоцепочечной жирной кислотой, образованной при бактериальной ферментации пищевых волокон и он частично отвестственен за протекторный эффект этих волокон. В докладе сообщается об эффекте бутирата на мутагенез у Salmonella typhimurium TA 98 и TA 100, вызванный действием бензо(а)пирена. При этом было показано, что бутират инигибирует мутагенез, вызванный на штамме ТА 100, что связано с подавлением метаболической активации мутагена (посредством биоалкилирования), но при этом он не оказывал влияния на мутагенез, индуцированный в штамме ТА 98, где для проявления мутагенного действия этап биоалкилирования не требуется. Для более детального изучения механизмов защитного действия бутирата необходимо проведение дополнительных экспериментов.

Результаты, представленные в докладе P.Hrelia et al., были посвящены влиянию желчных кислот на повреждения клеточной ДНК и параметры клеточного цикла в культурах клеток человеческих лимфоцитов. Данные последних лет свидетельствуют о том, что желчные кислоты являются эндогенными промоторами опухолеобразования. Повышение уровня вторичных желчных кислот (таких как дезоксихолевая) в фекалиях положительно коррелирует с процессами опухолеобразования у человека. Точный механизм этого феномена неизвестен. В клетках млекопитающих in vivo эти соединения вызывают повреждения ДНК. В условиях in vitro высокие концентрации желчных кислот вызывают цитотоксический эффект, некроз и гибель клетки. Авторы предполагают, что в основе механизмов опухолеобразования под действием желчных кислот лежит их способность влиять на клеточную пролиферацию. Представленные результаты демонстрируют преимущество использования цитогенетического анализа и проточной цитофотометрии для понимания механизмов формирования клеточного ответа при воздействии мутагенного стресса, вызванного желчными кислотами.

E.Badr et al. изучали физико-химические свойства хроматина, а также механизмы генотоксических эффектов, возникающих в хроматине под влиянием различных экологических токсикантов, в частности сточных вод. С этой целью были выбраны два экологически разных региона, различающихся по уровню загрязнения сточных вод. Хроматин выделяли из двух видов Tilapia: T.nilotica и T.zillii. Хроматин фракционировали на транскрипционно активную и репрессивную составляющие. Под влянием сточных вод температура плавления хроматина увеличивалась. Повышенный уровень загрязнения также вызывал снижение его транскрипционной активности. При этом второй вид более толерантен к уровню загрязнения по сравнению с первым. Эти данные указывают на то, что сточные воды могут обусловить изменение физико-химических свойств ядерного хроматина различных видов Tilapia и этот феномен может быть положен в основу изучения генотоксических эффектов загрязнителей-токсикантов окружающей среды.

В докладе I.Sebestyen et al. были представлены результаты генотоксического действия нового инсектицидного синергиста МВ-599 (тривиальное название — Вербутин). Это соединение повышает инсектицидную активность ряда препаратов против широкого спектра насекомых-вредителей, что может найти применение в сельском хозяйстве, ветеринарии и медицине. Изучали мутагенную активность Вербутина на штаммах Salmonella typhimurium TA 98, 100, 1535, 1537 и 1538. При этом не было обнаружено увеличения количества колоний-ревертантов. Кроме того, при использовании теста на наличие сестринских хроматидных обменов также не было выявлено у данного соединения мутагенных эффектов. E.Beres et al. представили результаты исследования генотоксичности нового акарицида SZI-121 (тривиальное название — Флуфензин) тетразолинового ряда. Это соединение является чрезвычайно активным по отношению к фитофагам и обладает хорошими экологическими и токсикологическими характеристиками. Авторы представили расширенный отчет об изучении генотоксических свойств данного соединения. Для изучения мутагенной активности препарата они использовали тест Эймса. Исследования были выполнены на тех же штаммах Salmonella typhimurium, что и предыдущем докладе. По количеству образованных колоний опытные и контрольные пластинки не отличались. При этом количество ревертантных колоний (< 156) не изменялось под влиянием использованных концентраций SZI-121. Авторы использовали тест-систему микронуклеуса для обнаружения повреждений хромосом и митотического аппарата клеток мышей NMRI в условиях in vivo. Проведенные исследования не выявили наличия генотоксических эффектов у данного вещества при использовании вышеупомянутых тестов.

Доклад F.Desmots et al. был посвящен геномной организации субъединицы человеческого гена глутатионтрансферазы А4. Было подчеркнуто, что важным метаболическим путем детоксикации ксенобиотиков-продуктов оксидативного метаболизма является конъюгация с глутатионом. В этом контексте глутатионтрансферазе отводится ключевая роль в защите внутриклеточных компонентов от оксидативного повреждения и электрофильных метаболитов. Авторы представили данные, касающиеся выделения и характеристики субъединицы А4 гена глутатионтрансферазы. Локализация этого гена была определена на хромосоме N 6, бэнд N 12 с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. Его протяженность составляет 18 килобайз и состоит он из семи экзонов. Границы "интроны/экзоны" подчиняются стандартным правилам и открытие рамки считывания начинается в положении 153 в экзоне N 2, тормозной кодон находится в положении N 822 в экзоне N 7. Эти кодирующие экзоны проявляют степень гомологии 62% с hgsta1 и с другими известными cDNA. Был также определен сайт инициации транскрипции с помощью праймерного экстензионного анализа. Приведенная детальная молекулярно-генетическая характеристика организации этого гена должна облегчить детальный анализ регуляции транскрипции и последующей сборки глутатионтрансферазы.

В исследовании P.T.Tang et al. был выявлен комбинированный эффект высокой температуры и никотина на экспрессию генов HSP и ее регуляцию. Экспрессия генов HSP 70 и HSP 127 была индуцирована высокой температурой и никотином. Концентрационные уровни этих генов и их и-РНК не увеличивались при комбинированном воздействии данных индуцирующих факторов. Однако, эти показатели достоверно повышались для гена HSF1, который локализовался главным образом в ядрах после тепловой обработки в течение 30 минут. После 60- и 120-минутной обработки значительно возрастало количество и-РНК этого гена. Однако, при комбинированном воздействии данных индукторов экспрессия и-РНК была ниже, чем при действии высокой температуры и никотина в отдельности. Эти результаты означают, что экспрессия и-РНК гена HSF1 может играть важную регуляторную роль в экспрессии генов HSP. Не исключен также значительный вклад в эти процессы ионов кальция, так как на уровень транскрипции HSF оказывает влияние степень фосфорилирования протеинкиназы С.

В докладе H.N.El-Khatib et al. были представлены результаты исследований цитогенетических и молекулярно-генотоксических эффектов пестицида Vertemic. Они были оценены на самцах белых крыс после острой и субхронической интоксикации. Полученные данные свидетельствуют о значительном увеличении частоты хромосомных аберраций и появления микроядрышек в клетках костного мозга. С помощью методики Random Amplified Polymorphic DNA Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR) было определено влияние пестицида на ДНК тестируемых животных. Была также определена рестрикционная "картина" для обнаружения полиморфной ДНК.

Таким оборазом, представленный анализ докладов Парижского конгресса токсикологов, посвяшенных проблеме генотоксичности, позволяет сделать вывод о том, что использование современных методических подходов определения структуры ядерного генома позволяет по-новому оценить общие механизмы действия генотоксических агентов. Это касается прежде всего сайтов их непосредственного влияния на ядерный геном и вовлечение в эти процессы вторичных механизмов, направленных на экспрессию адекватного адаптационного ответа, выражающегося в уровне и направленности реакций детоксикации. Парижский конгресс был прекрасно организован. Помимо обширной научной программы, дополненной выставками последней литературы по экспериментальной токсикологии и антидотной терапии, участников ожидала интересная культурная программа с посещением достопримечательностей одного из красивейших городов мира. На заключительном заседании было решено провести следующий Всемирный Форум токсикологов в 2001 году в австралийском городе Брисбене. Тезисы докладов конгресса опубликованы в дополнительном выпуске журнала "Toxicology Letters".

Доктор биологических наук Е.Л.Левицкий
Академик АМН Украины И.М.Трахтенберг