|
МЕХАНИЗМЫ ИНТОКСИКАЦИЙ УДК 576. 314: 615.9 ХАРАКТЕР НАРУШЕНИЯ СТРУКТУРНЫХ СВОЙСТВ МИКРОСОМ ГЕПАТОЦИТОВ СОЛЯМИ КАДМИЯ И ЛАНТАНА О.И. Лебедь Флуоресцентными методами изучено влияние солей кадмия и лантана на структуру мембран микросом гепатоцитов. Показано, что оба металла связываются с отрицательно заряженными группами мембран и тем самым модифицируют заряд их поверхности. При этом конформация мембранных белков не нарушается. Однако регистрируется существенное увеличение микровязкости гидрофобных участков липидного матрикса без изменения их полярности. Существуют многочисленные сведения о влиянии тяжелых металлов на биохимические процессы, на функции клетки и организма в целом. Так, эти элементы способны ингибировать ферменты за счет их тиолотропных свойств [1],повреждать ДНК [2], нарушать процессы липопериокисления в мембранных структурах [3] и хроматине [4]. Однако, учитывая загрязнение окружающей среды токсикантами самой различной химической природы из самых разных источников, представляет интерес выяснить: каким образом одни ксенобиотики могут изменять детоксицирующие функции клетки, тем самым ослабляя естественные защитные возможности организма по отношению к другим. В частности, эта проблема касается тяжелых металлов, которых по мере развития многих отраслей промышленности при недостаточной степени нейтрализации побочных продуктов производства и очистки отходов становится все больше в экосфере. Роль микросом в биотрансформации химических соединений хорошо известна. Причем белковые катализаторы, обеспечивающие эти процессы, локализуются главным образом на мембранах микросом. Известно также, что функциональные свойства мембраносвязанных ферментов указанных внутриклеточных образований в значительной мере зависят от структурных характеристик мембраны [5].Отсюда понятно, что любые нарушения информации и других структурных показателей микросомальной мембраны должны сказаться на детоксицирующих функциях клетки. Таким образом, цель исследований заключалась в установлении мембранотропных свойств солей кадмия и лантана по отношению к микросомам и выяснении молекулярных механизмов нарушения данными соединениями структуры микросомальных мембран. Материалы и методы В экспериментах использовали хлористый кадмий и азотнокислый лантан, концентрации которых варьировали в диапазоне 0,05—1,00 mM. Флуоресцентные исследования влияния солей металлов на структуру МкС и обработку спектральных данных осуществляли в соответствии с ранее описанными методиками [7, 8]. Для флуоресцентного зондирования мембран использовали 1-анилино-8-нафталинсульфоната магниевую соль (АНС) и пирен (оба фирмы "CEPBA", Германия) в концентрациях 5 мкМ. Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре "Hitachi"-MF-4 (Япония). Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре "Shimadzu"-MPS-5000 (Япония). Результаты исследований и обсуждение Из данных, касающихся белковой флуоресценции, следует, что оба металла уменьшают её интенсивность, не изменяя других спектральных параметров. Этот факт можно объяснить тушением металлами флуоресценции поверхностных триптофановых и тирозиновых остатков, поскольку флуоресценция первых формирует длинноволновое, а вторых коротковолновое крыло суммарного спектра. В противном случае, если бы тушению подвергалась флуоресценция лишь одной люминофорной группы, то в эксперименте регистрировалось бы изменение асимметрии спектральной линии. Здесь уместно напомнить, что при используемой длине волны возбуждения (280 нм) поглощают все белковые люминофоры [9]. Неизменность спектральных показателей, характеризующих положение максимума и формы спектра в микросомах подвергшихся воздействию металлов, по сравнению с нативными, позволяет однозначно говорить о том, что ни ионы кадмия, ни ионы лантана не вызывают нарушения конформации мембранных белков, так как на структурную перестройку в белках чутко реагируют изменением положения полосы флуоресценции их естественные люминесцентные метки- триптофанилы [9]. Обработка МкС металлами приводит к значительному возрастанию интенсивности флуоресценции АНС, что находит своё объяснение в увеличении связывания анионного зонда с модифицированной катионами металлов поверхностью мембран, несущей в нативном состоянии суммарный отрицательный заряд. Нужно отметить, что подобное увеличение интенсивности флуоресценции АНС может быть обусловлено и повышением гидрофобности мест локализации его люминофора, т. е. изменением конформации поверхностных участков мембраны, куда встраивается люминофорная группа зонда, поскольку известно, что квантовый выход этого соединения очень сильно зависит от полярности растворителя или микроокружения в биообъекте [10]. Вместе с тем в цитированной работе указывается также на то, что с уменьшением полярности происходит и значительный сдвиг максимума спектра в коротковолновую область, а это не наблюдается в эксперименте. Положение максимума полосы как в нативных, так и в обработанных металлами мембранах находится при 474±2 нм. Предварительно, перед изучением влияния металлов на структуру МкС с помощью пирена, было установлено отсутствие линейной зависимости между степенью эксимеризации и концентрацией зонда. Такой факт свидетельствует о том, что в данных мембранах пирен встраивается и в липидную, и в белковую фракции [10]. Инкубация МкС как с кадмием, так и с лантаном не влечёт за собой нарушения полярности в гидрофобных участках липидного матрикса и мембранных белков, поскольку значение индекса полярности остается постоянным. Неизменность полярности внутренних областей белков ещё раз подтверждает ранее сформулированный вывод об отсутствии влияния металлов на их конформацию. В то же время оба металла обусловливают уменьшение степени эксимеризации зонда. Это явление может быть вызвано двумя причинами: повышением микровязкости мест локализации пирена в районе гидрофобных остатков жирных кислот липидного бислоя [11] и перераспределением зонда из липидной фракции мембран в белковую. Так как в белках зонд не эксимеризуется [10], то будет наблюдаться кажущееся снижение степени эксимеризации, определенной по соотношению интенсивностей флуоресценции эксимерной и мономерной форм пирена. В то же время такого рода перераспределение возможно лишь в условиях, когда полярность гидрофобных участков мембранных липидов повышается, а белков понижается, что экспериментально не фиксируется (см. табл.). Следовательно, приведенные данные свидетельствуют об увеличении микровязкости глубинных зон липидного матрикса. Такая ситуация, по всей вероятности, связана с тем, что двухвалентные ионы металлов "сшивают" близлежащие отрицательно заряженные группы фосфолипидов, тем самым ограничивая их подвижность. В заключение нужно отметить, что регистрируемые флуоресцентными методами структурные изменения в МкС, возникающие при их взаимодействии с солями кадмия и лантана, носят линейный дозозависимый характер. Таким образом, на основании анализа результатов проведенных исследований можно прийти к заключению, что ионы кадмия и лантана связываются с отрицательно заряженными поверхностными группами микросомальных мембран, вследствие чего модифицируют заряд наружного мембранного слоя. При этом конформация белков не меняется, но происходит существенное увеличение микровязкости глубинных участков липидного матрикса без изменения их полярности. Учитывая упоминавшуюся во введении зависимость активности микросомальных ферментов от конформации мембраны и физико-химических характеристик липидного бислоя, надо полагать, что регистрируемые структурные изменения в мембранах микросом должны сказаться на детоксицирующих возможностях клетки. Литература |