УДК 615.9:616-073.584:615.849.19

ЛАЗЕРНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ — НОВЫЙ МЕТОД МОНИТОРИНГА В ТОКСИКОЛОГИИ

Ю.И. Бажора, В.И. Кресюн д. м. н., профессор, Л.А. Носкин , В.В. Годован, Д.Ю. Андронов, Б.А. Волошенков

Одесский государственный медицинский университет

Важными проблемами клинической токсикологии являются, во-первых, изучение механизмов действия токсикантов на различные уровни организации человеческого организма, поиск объективных и информативных критериев ранней диагностики патологических изменений в организме, возникающих на ранних этапах воздействия токсического вещества, а также доступный, объективный и надежный мониторинг значительных контингентов населения.

Известно, что большинство токсических веществ природного и искусственного происхождения, повреждая то или иное звено метаболизма, приводит к нарушению клеточных и органных функций, что в конечном итоге вызывает изменения в системе гомеостаза и развитие патологического процесса [1]. В связи с этим определенный интерес представляет применение в токсикологических исследованиях лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС).

В течение последних десятилетий ЛКС применяется в биологических ис-следованиях для определения гидродинамических размеров различных биоло-гических объектов, степени сольватирования и гидратирования сферических частиц. Применение ЛКС ограничивалось изучением монодисперсных систем заведомо известного состава. Анализу подвергались отдельные фракции, предварительно выделенные трудоемкими процедурами. В растворах и взвесях исследовали содержание желатина, глобулинов, ДНК, гликопротеидов [2—6].

Метод сразу же привлек внимание медиков, так как давал возможность подвергнуть исследованию нативные биологическое жидкости без какой-либо предварительной их обработки. Вместе с тем, для таких биологических жидкостей как плазма, сыворотка крови, лимфа и др., являющихся гетерогенными по своему составу средами, отсутствовал совершенный математический аппарат, который мог бы применяться для обработки полученных результатов и позволял получать достоверную информацию о составе многокомпонентных систем. Необходимы были адекватные методы математической обработки спектров квазиупругого рассеяния света в многокомпонентных полидисперсных системах. Подобная задача относится к классу обратных задач спектрального анализа с плохо обусловленной матрицей [7].

Один из подходов корреляционных функций основан на методе регуляризации, применение которого позволяет получить функцию распределения светорассеивающих частиц по их размерам в форме гистограммы (рис.1). По оси ординат гистограммы отражен вклад частиц в светорассеяние, а по оси абсцисс — размеры частиц (в нм), вычисляемые в рамках моделей жестких сфер. Такой подход сегодня представляется предпочтительным с точки зрения как полноты использования экспериментальных данных, так и возможности достаточно полной интерпретации результатов обработки.

Применение указанного метода позволило предложить новую структурную модель липопротеидов очень низкой плотности [8, 9], стала возможной оценка степени загрязненности различных образцов посторонними включениями [9, 14, 15], открылись новые возможности в изучении явлений модификации [10], полимеризации [11], расслоения [12] в биологических системах. Новые перспективы появились в изучении конформационных изменений молекулярных и субмолекулярных биологических структур [13]. Особое значение имело применение ЛКС в сочетании с программами регуляризации в медицинских и, в частности, иммунологических исследованиях. Высокая скорость измерений изучаемого образца дает исследователю инструмент, позволяющий оценивать характер и соотношения нативных структур, представленных в биологических жидкостях в норме и патологии. Поскольку частицы в биологических жидкостях заведомо полидисперсны, их изучение в условиях, близких к естественным, может опираться только на методы регуляризации спектральных данных. Таким образом, возможности метода ЛКС продолжают раскрываться, появляются новые области его применения.

Первые сообщения об использовании упомянутой модификации ЛКС в медицине относятся к 1987 г., когда появились работы [16], посвященные изучению этим методом сыворотки крови больных вирусными гепатитами, другими инфекционными заболеваниями, а также сыворотки крови здоровых людей. Различные авторы [9, 17] сошлись во мнении о том, что метод ЛКС открывает новые подходы в изучении вирусемии и других патогенетических аспектов при патологических процессах, а также для изучения других биологических жидкостей. Подчеркивалась возможность привлечения данных ЛКС для исследования механизмов гуморальных иммунологических реакций.

Плазма крови — чрезвычайно гетерогенная и многокомпонентная среда. В ней представлены не только низко- и высокомолекулярные биологические структуры (альбумины, глобулины, липопротеиды и т.д.), но и их агрегаты и комплексы, которые находятся в динамическом взаимодействии. Если учесть тот факт, что вклад в светорассеяние частиц с большим гидродинамическим диаметром значительней вклада мелких частиц, очевидной становится непременная зависимость функции распределения частиц по размерам в плазме от факторов, влияющих на агрегативные способности частиц (температура, рН, концентрация и т.д.). Помимо этого существуют довольно большие физиологические колебания уровня отдельных элементов сыворотки и плазмы крови, что не может не приводить к соответствующим изменениям функции распределения частиц по размерам. И, наконец, в крови непрерывно протекают иммунологические реакции, неразрывно связанные с процессами агрегации и дезагрегации иммунных комплексов.

Характер субфракционного состава сыворотки крови в конечном счете определяется системой гомеостаза, функциональное состояние которой всегда связывали со специфическими процессами, протекающими в отдельных органах и тканях. Поэтому предпринимались многочисленные попытки разработки параметров, характеризующих систему гомеостаза. К ним относятся многочисленные способы кондуктометрии, рН-метрии, определения концентраций отдельных фракций белков, нуклеиновых кислот, ионов и т.д. Наиболее адекватными в последние годы оказались методы исследования субфракционного макромолекулярного состава сыворотки крови с помощью осадочной хроматографии. Данный метод перспективен не только с целью дифференциальной диагностики различных видов аутоиммунных заболеваний, но и с целью прогнозирования эффективности применяемой терапии [18]. Биологическая аргументация метода осадочной хроматографии в наибольшей степени из всех используемых подходов к исследованию системы гомеостаза близка к предлагаемому нами методу ЛКС. Вместе с тем, основными ее недостатками являются:

1) большие объемы используемой сыворотки крови (10—20 мл);
2) длительность анализа (несколько часов на одно разделение);
3) необходимость постоянной регенерации сорбентов после каждого анализа;
4) в разделяющихся компонентах не учитывается природа межмолекулярных взаимодействий. Все эти недостатки отсутствуют у метода ЛКС.

Учитывая вышеизложенное, нам представляется, что ЛКС может найти применение как эффективный метод для оценки токсического воздействия на организм различных ксенобиотиков. Следует отметить, что он применим как в экспериментальной, так и в клинической токсикологии.

Наши экспериментальные исследования показали, что усредненные гистограммы распределения частиц плазмы крови интактных крыс имеют конфигурацию с модами в низко- (8,19 нм) и среднемолекулярной (73,1 нм) фракциях. Внутри низкомолекулярной фракции наблюдается плавное нарастание вкладов частиц от 2,8 нм до 9,3 нм с последующим образованием плато (до 16,5 нм). Затем резко увеличивается вклад частиц среднемолекулярной фракции с пиком 66,0 и 85,0 нм. Эта фракция и дает 85,6 % вклада в светорассеяние. Вклад высокомолекулярных частиц практически не влияет на характер спектра. Таким образом, ЛК-спектр контрольной группы животных определяется характерным распределением низко- и особенно среднемолекулярных частиц. Мы столь подробно остановились на описании ЛК-спектра интактных животных, потому что при воздействии на их организм токсических агентов появляются характерные отличия, возникающие в различных его областях.

Необходимо также отметить, что ЛКС-метрия как очень чувствительный метод улавливает сезонные колебания параметров гомеостаза у экспериментальных животных. Хотя визуально усредненные «зимние» и «весенние» спектры были весьма схожи, за исключением диапазона от 10 до 20 нм (рис. 2), но при классификационном анализе была выявлена дифференциация сравниваемых групп (рис. 3). Индивидуальные колебания в «весенней» группе были менее выражены, чем в «осенней». Следовательно, необходимо учитывать сезонные колебания показателей плазмы крови животных.

В качестве модели токсического воздействия на организм избрали гепатит, вызванный однократным внутрижелудочным введением четыреххлористого углерода (ССl₄) в дозе 5 мл/кг массы животного в виде 50 % масляного раствора. Данная модель характеризуется тем, что к настоящему времени достаточно изучены биохимические, морфологические и другие проявления токсического гепатита, известна четкая стадийность и временные параметры развития каждой стадии течения. В частности, хорошо известны гистохимическая картина поражения печени, функциональное состояние клеточных и субклеточных структур, активность ключевых ферментов обмена белков, жиров и углеводов. Ряд этих показателей использовался для верификации и интерпретации результатов ЛКС.

Проведенные исследования показали, что через 1 сут. после введения ССl₄ ЛК-спектр имел вид бимодального распределения (рис. 4). Низкомолекулярная фракция была фрагментирована с модами 2,48; 643,00 и 18,38 нм, которые вносили 0,56, 19,57 и 12,23 % вкладов в светорассеяние соответственно. Такой «хвост» низкомолекулярной фракции ЛК-спектра, вероятно, неспецифичен для гепатита и скорее является следствием действия любого сильного возмущающего фактора на параметры гомеостаза. При классификационном анализе выявлялась лишь дифференциация этих спектров по сравнению с нормой.

В плазме крови в этот срок наблюдали выраженные нарушения активности ферментов цитолиза: аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ) и холестаза: гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ), щелочной фосфатазы (ЩФ). Причем активность АЛТ и АСТ в сыворотке крови повышалась соответственно в 3 и 2 раза, а в гомогенате печени угнеталась более чем в 6 раз. Активность фермен-тов холестаза изменялась однонаправленно в сыворотке крови и гомогенате печени. Так, активность ГГТ увеличивалась соответственно в 2,6 и 5,3 раза, а активность ЩФ — на 57 и 28 %.

При гистологическом исследовании наблюдали полнокровие центральной вены, расширение межбалочных синусов, отек стромы. Дольчатое строение печени сохранялось. Гепатоциты, как и у интактных крыс, располагались в виде печеночных пластинок, радиально конвергирующих к центральной вене. Однако в отдельных участках долек уже отмечался полиморфизм клеток, очаговая паренхиматозная гидропическая дистрофия, встречались мелкоочаговые кровоизлияния. Гистохимически определялось уменьшение гликогена, в гепатоцитах периферических отделов долек появлялись мелкие капельки жира. В портальных трактах встречались очаги пролиферации клеток, воспалительный инфильтрат содержал, наряду с лимфоцитами, макрофаги, небольшое количество нейтрофилов.

На этом фоне изменялась структурная организация клеточных мембран как гепатоцитов, так и эритроцитов, активировались процессы перекисного окисления липидов: содержание диеновых конъюгатов в мембранах гепатоцитов и эритроцитов увеличилось почти в 2 раза, а малонового диальдегида — соответственно в 2,5 и 1,5 раза.

Такое несоответствие между данным ЛКС, с одной стороны, и биохимическими, и гистохимическими процессами, с другой стороны, может быть связано, во-первых, с тем, что процесс не достиг стадии генерализации, во-вторых, — с устойчивостью параметров гомеостаза плазмы крови в данный временной промежуток.

На 3-и сутки развития токсического гепатита гистограмма приобрела выраженную мономодальную структуру с пиком в области среднемолекулярной фракция (52,37 нм) и сформировалась, в основном, за счет вкладов в светорассеяние низко- и среднемолекулярных компонентов размером от 2,50 до 66,00 нм, затем происходило убывание функции. При этом вклад высокомолекулярной фракции (564,50 нм) заметно увеличивался по сравнению с интактной группой, несмотря на мощный экранирующий эффект среднемолекулярных компонентов. Этот эффект (так называемое заполнение «окна прозрачности») уже описывался в литературе при изучении спектров вирусного гепатита В у человека [19]. Заключается он в заметном включении в светорассеяние частиц радиусом 30—60 нм. Авторы с помощью иммунных критериев и прямой электронной микроскопии связали отмеченные сдвиги с прямой циркуляцией частиц Дейна (специфического патогенетического для гепатита В элемента с сорбированным НBs-антигеном). То, что симптоматически устанавливаются аналогичные сдвиги в плазме крови при вирусном и токсическом гепатите говорит, видимо, о том, что природа этих изменений связана не только с появлением патогенетически значимых иммуногенных частиц, но и с опосредованными процессами нарушения липопротеидного метаболизма, общими для вирусного и токсического гепатитов.

Описанные сдвиги в ЛК-спектрах наблюдались на фоне еще высокой ак-тивности ферментов как холестаза, так и цитолиза, но уже имеющих направленность в сторону нормализации. При этом морфологические изменения нарастали. Нарушалось балочное строение большинства долек, был более выраженным полиморфизм клеток и ядер: клетки набухали, менялись их размеры, ядра приобретали различную величину и форму. Более выраженным становилось полнокровие сосудов, усиливался отек. В центральных отделах долек преобладала вакуольная и балонная дистрофия гепатоцитов, в которых отмечалось разрушение клеточной мембраны. В различных отделах долек встречались очаги колликвационного некроза, множественные кровоизлияния. Портальные поля утолщались, значительно инфильтрировались лимфогистиоцитарными элементами. По периферии долек в гепатоцитах появлялись мелкие капли, содержащие липиды. Местами они заполняли всю цитоплазму. Резко снижалось содержание гликогена, а в отдельных дольках он отсутствовал вообще.

Нарастало содержание гидроперекисей липидов, подавлялась антирадикальная защита клетки. Существенно уменьшалось содержание белка и увеличивалось количество липидов, что изменяло обычное соотношение белок/липид. Свидетельством мембранодеструкции и ферментемии в этот период явилось увеличение суммарной пероксидазной активности плазмы крови более чем на 300 %, перекисного гемолиза эритроцитов более чем на 170 %. Происходило увеличение содержания холестерина, уменьшалось содержание фосфолипидов, изменялось их соотношение. В 2,2 раза уменьшалось количество наиболее легко окисляемой фракции — фосфатидилэтаноламина, в 2,7 раза уменьшалось содержание фосфатидилхолина. При этом более чем на 70 % увеличивалось содержание лизофосфатидилходина — специфического маркера фосфолипазной активности; в 1,5 раза повышалось содержание сфингомиелина — самой трудно окисляемой фракции. Описанные выше биохимические и морфологические изменения в печени на 3-и сут. исследования свидетельствовали о развитии неспецифического реактивного гепатита, при котором также отмечалось повреждение белоксинтезирующего аппарата печени, что приводило к диспротеинемии, нарушению обмена жиров, активации процессов ПОЛ. В эти же сроки наблюдений существенно изменялась и картина гистограммы, приобретавшей четкую мономодальную конфигурацию и, очевидно, отражавшей нарастающую диспротеинемию, липидемию и уровень циркулирующих иммунных комплексов.

Изменения в ЛК-спектрах на 5, 7-е и 14-е сутки заключались в постепенном (этапном) формировании из одномодальной функции бимодальной за счет образования сначала плато, а затем четким разделением пиков. Таким образом, к 14-м сут. экспериментального гепатита у крыс в ЛК-спектре восстанавливалось «окно прозрачности» в диапазоне частиц радиусом 10—60 нм, и гистограмма практически не отличалась от таковой в контрольной группе.

Динамика процесса иллюстрируется при графическом отображении результатов классификационного анализа и выражается в максимальном перекрытии облаков, соответствующих контрольной группе и группам с токсическим гепатитом на 1-е и 14-е сут. модели (рис. 5). Максимальные различия наблюдаются при попарном сравнении результатов, полученных в контрольной группе и при гепатите на 3-е сут.

Для клинической токсикологии важным представляется не только диагностическая ценность ЛКС-метода, но и его возможности в оценке эффективности лечебных мероприятий, направленных на ликвидацию токсического воздействия.

В настоящей работе приведены результаты изучения гепатопротекторного действия соединений германия с биолигандами — никотиновой и янтарной кислотой (МИГУ-1 и МИГУ-3 соответственно) и никотинамидом (МИГУ-2).

Предварительное введение МИГУ-1 значительно сказывается на динамике ЛК-спектров во все сроки наблюдений после токсического воздействия. Через 1 сут. после введения ССl4 гистограмма сохраняет бимодальность (рис. 4, 5). Низкомолекулярная фракция в эти сроки характеризуется модой 5,96 нм с относительным вкладом в светорассеяние 10,94, что очень близко к данным в контрольной (интактной) группе. При этом пик среднемолекулярной фракции у подопытных животных смещен в сторону частиц с меньшими гидродинамическими радиусами и описывается модой 47,58 нм (вклад в светорассеяние 89,06 %). Самые крупные частицы спектра ограничиваются размером 95,20 нм, тогда как у интактных животных — 264,45 нм. Обращает на себя внимание тот факт, что на 3-и сут в разгар токсического гепатита в ЛК-спектрах сохраняется бимодальность распределения. При этом отмечается увеличение вклада в светорассеяние низкомолекулярной фракции с появлением незначительного количества мельчайших частиц (2,48 нм). На 5-е сут. гистограмма приобретает форму, очень сходную с таковой у интактных животных. У крыс, которым препарат не вводили, аналогичная картина наблюдалась лишь на 14-е сут. течения экспериментального гепатита.

Метод ЛКС оказался очень чувствительным в объективизации эффективности и при сравнительной оценке гепатопротекторного действия различных БАВ. Об этом свидетельствуют результаты сопоставления ЛКС-метрии плазмы крови в группах животных: I – не леченые животные, подвергнутые затравке ССl4; II и III группы – животные, которым предварительно 6 дней вводили МИГУ-1 и МИГУ-2 соответственно, а на 7 сут производили затравку ССl4 и продолжали введение изучаемых средств еще в течение 7 дней. Так, у животных III группы ЛК-спектры через 1 сутки были аналогичны таковым у животных II группы. Однако, на 3-и сут развития токсического гепатита усредненная гистограмма животных III группы имела нечетко выраженную бимодальность, даже стремящуюся к мономодальной структуре с предварительным вкладом в светорассеяние частиц среднемолекулярной фракции (59,79 нм — 89,9 %), что напоминает конфигурацию спектра животных нелеченой группы на 3-и и 5-е сут. На 5-е сут. гистограмма у животных III группы имеет четко выраженную бимодальность, которая отличается от таковой у животных II группы, а тем более от ЛК-спектра интактных крыс. В ней имеются четко разграничивающиеся низкомолекулярная (7,15 нм) и среднемолекулярная (67,16 нм) фракции, вклады которых в светорассеяние, в отличие от гистограммы интактных крыс, примерно одинаковы (40,1 и 59,9% соответственно). Лишь на 7-е сут. усредненный спектр крыс III группы приближается к таковому у ин-тактных животных (рис. 4).

Из полученных данных ЛКС-метрии можно сделать вывод, что соединение МИГУ-1 обеспечивает более выраженное удержание параметров плазменного гомеостаза в пределах их нормальных колебаний, в то время как МИГУ-2 с этой задачей справляется менее эффективно. Тем не менее, введение обоих БАВ сократило длительность течения патологического процесса. При этом МИГУ-1 оказался более эффективным, так как нормализация ЛК-спектра была четко выражена на 5-е сут., а при применении МИГУ-2 — приближалась к норме только на 7-е сут. Т

аким образом, метод ЛКС, обладая в сравнении с традиционными методами энзимологии более выраженной чувствительностью относительно природы воспалительных и некробиотических процессов в печени, позволяет объективизировать контроль эффективности различных фармакологических средств. Приведенные выше результаты ЛКС-метрии сыворотки крови крыс при токсическом гепатите показывают перспективы использования метода в экспериментальной и клинической токсикологии.

ЛКС позволяет выявить новые механизмы развития токсического гепатита, установить динамику изменения интегрального показателя гомеостаза — динамического взаимодействия биомолекул крови в различные сроки развития.

При этом ЛКС является чувствительным диагностическим критерием. Характеристика ЛК-спектров может отражать определенные стадии токсического поражения, которые верифицируются другими, более сложными методами исследования.

И, наконец, ЛКС позволяет с высокой степенью достоверности оценивать эффективность фармакотерапии.

ЛИТЕРАТУРА
1. Губский Ю.И. Коррекция химического поражения печени. —К.: Здоров’я, 1989. —168 с.
2. Amis N.B., Jannaray P.A., Ferry J.D. Ynasi-elastic light-scate ring of gelation solution and gels // Macromolecules. —1983. —V. 16, N 3. —P. 441—446.
3. Horn D.S., Dalgleeish D.G. A photon correclation spectroscopy study of size distributions of casein micell suspensions // Eur. Biophys. —1985. —V. 11, N 4. —P. 249—258.
4. Hwand I.S., Cummins H.Z. Dynamic light scattering of collageen // T. Chem. Phys. —1982. —V. 77, N 2. —P. 616—627.
5. Kam Z., Borochov N. Dependens of lazer scattering of DNA // Biopolymers. —1981. —V. 20, N 12. —P. 2671—2690.
6. Schwenke K.D., Schultz M. Hydrodynamic and light scattering studies of the 12-S-globulin // J. Peptid. Protein Res. —1982. —V. 16, N 1. —P. 12—18.
7. Спектроскопия оптического смещения и корреляция фотонов / Под ред. Г. Камминса, Э. Пайка. —М.: Мир, 1978. —583 с.
8. Размеры плазменных липопротеидов по данным трех независимых методов / Лазовский В.Т., Шмелев Г.Е., Носкин В.А и др. // Биофизика. —1982. —Т. 27, N 3. —С. 258—291.
9. Лазерная корреляционная спектроскопия и биология / А.Д. Лебедев, Ю.Н. Левчук, А.В. Ломакин, В.А .Носкин. —К.: Наукова думка, 1987. —256 с.
10. Изменение распределения по размерам липопротеидов плазмы крови человека / Климов А.Н., Шмелев Г.Е., Носкин В.А. и др. // Биофизика. —1982. —T. 27, N 3. —С. 458—461.
11. Исследование полидисперсных растворов актина методами квазиупругого светорассеяния / Добычин П.Д., Ломакин А.В., Мевх Н.Г. и др. // Биополимеры и клетка. —1986. —Т. 2, N 1. —С. 23—29.
12. Левчук Ю.Н., Воловик Э.Н. Размеры лецитиновых липосом, образующихся при воздействии ультразвука // Биофизика. —1983. —N 28. —С. 266—269.
13. Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином / Носкин В.А., Шмелев Г.Е., Ломакин А.В. и др. // Биополимеры и клетка. —1987. —Т. 2, N 6. —С. 293—301.
14. Применение лазерной корреляционной спектроскопии для изучения ЭФ биологических объектов в растворах / Лебедев А.В., Ломакин А.В., Носкин В.А. и др. // Инструментальные методы в физиологии и биофизике. —Л.: Наука, 1987. —С. 90—95.
15. Акцепция холестерина липопротеидами высокой плотности у лиц с дисли-попротеинемией и возможная роль в этом процессе аполипопротеина Е / Кожевникова К.А., Петрова-Маслакова Л.Г., Парфенова Н.С. и др.// Вопр. мед. химии. —1989.—N 4.—С. 43—49.
16. Балабонов С.М., Лебедев А.Д., Носкин В.А. Вирусологические аспекты применения ЛКС // Сборник науч. работ ЛИЯФ. —Л., 1987. —С. 16—19.
17. Лазерная корреляционная спектроскопия для скрининговых обследований / Яковлев А.А., Яковлев А.М., Омельченко В.С. и др. // Диспансеризация больных с инфекционной патологией. —Л., 1987. —С. 77—84.
18. Гемосорбция и изменение некоторых показателей гомеостаза крови при иммунозависимых заболеваниях / Шумаков В.И., Гбриэлян Н.И., Дмитриев А.А. и др. // Тер. архив. —1982 —Т. 54, N 1. —С. 72—75.
19. Lipin A.T., Tytovsky V.I., Yeligulashvili R.K. Correlative laser spectroscopy for the determination of hepatitis in virus structures // Hepatology letters. —1988. —N 6. —P. 21—23.