|
ЛЕЧЕНИЕ ИНТОКСИКАЦИЙ УДК 615.357.631:577.611.657 КОРРЕКЦИЯ ПОРАЖЕНИЙ ЯДЕРНОГО ГЕНОМА АНТИОКСИДАНТАМИ В УСЛОВИЯХ ТОКСИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ (обзор) Е.Л. Левицкий, д.б.н., Ю.И. Губский чл.-корр. АМН Украины, А.Н. Марченко, к.б.н. , Р.Г. Примак, к.х.м., А.Г. Горюшко, к.х.н. Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, г. Киев Одной из основных причин ухудшения уровня здоровья населения Украины, увеличения смертности и широкого распространения ряда заболеваний является загрязнение окружающей среды химическими токсикантами. Вредные выбросы химических и других производств, внесение в почву удобрений, результаты аварии на ЧАЭС — вот основные источники токсикантов в воздухе, воде, пище. Попадая с ними в организм человека, они вызывают повреждения органов и тканей, в том числе важнейших биоструктур: мембран и ядерного генома. Последнее обстоятельство преобретает особое значение в связи с резким ухудшением состояния генофонда населения Украины, о чем неоднократно упоминалось в научной литературе. Увеличение случаев врожденных уродств, наследственных заболеваний, вклад генетической компоненты в ряду наиболее распространенных патологий (атеросклероз, заболевания органов дыхания и желудочно-кишечного тракта и т.д.) являются следствием увеличения в последние годы вклада повреждающих геном факторов в нарушение его структурной организации. Последствия этого могут быть самыми различными, однако основными из них являются сдвиги в процессах биосинтеза белка, синтез белков, прежде всего ферментов с измененными свойствами, часто не способными выполнять свои непосредственные функции биокатализа. Печень является основным органом, в котором происходит метаболизм и обезвреживание токсикантов. Этот факт определяет также то обстоятельство, что она является и основной мишенью действия токсических химических веществ [1]. Ядерный геном клеток высших организмов, в том числе и клеток печени носит название хроматин. Он состоит из ряда основных компонентов (ДНК, белки) и минорных соединений (РНК, липиды, микроэлементы). Содержание этих молекул строго дозированно, изменяется в узких пределах в процессе его функционирования, которое в конечном итоге определяется взаимодействием основных и минорных компонентов между собой [2]. Среди наиболее распространенных токсикантов химической природы важное место принадлежит хлор- и фосфорорганическим соединениям (ХОС и ФОС). Первые широко применяются в ряде производств в качестве растворителей, продуктов неорганического и органического синтеза, бытовой химии, вторые — используются в сельском хозяйстве, ряде отраслей промышленности и быту. Обладая высокой реакционной способностью, соединения этих классов при попадании в организм способны вызывать повреждения биомолекул, в том числе и важнейшего биомолекулярного комплекса — хроматина. Нами на модели ядерного хроматина клеток печени крыс были изучены механизмы генотоксического действия ХОС И ФОС. В качестве представителя первых из них мы использовали тетрахлорметан, а вторых — хлорофос [3]. Было показано, что мишенью генотоксического действия модельных представителей хлор- и фосфорорганических соединений - тетрахлорметана и хлорофоса — являются основные компоненты хроматина — гистоновые, негистоновые белки и ДНК. Повреждение последней является прямым проявлением генотоксического процесса, т.к. в результате подобного действия нарушается считывание генетической информации в хроматине — репликация и транскрипция [4]. Искажение этих матричных синтезов происходит как в результате непосредственного повреждения структуры ДНК-матрицы, так и изменения активности ферментов репликации и транскрипции — ДНК — и РНК-полимераз, соответственно [5]. Причем характерно, что транскрипционно активная часть хроматина, где репликация и транскрипция протекают наиболее интенсивно, и которая составляет всего 5—10 % от всей длины ядерного генома, повреждается прежде всего и в большей мере в результате генотоксического действия изученных соединений [6]. Эта фракция хроматина имеет более разрыхленную, релаксированную структуру вследствие, прежде всего, понижения степени спирализации ДНК и меньшего количества гистоновых белков, главным образом гистона Н1, являющегося основным эндогенным ингибитором репликации и транскрипции [2]. Повреждение белков хроматина — гистонов и негистонов (в состав последних входят ДНК- и РНК-полимеразы) также приводит к генотоксическому эффекту, так как ксенобиотики нарушают структурную упаковку хроматина и тем самым оказывают опосредованное влияние на репликацию и транскрипцию, изменяя доступность ДНК-матрицы для ферментов синтеза ДНК и РНК. В последнее время все большее внимание уделяется одному из основных минорных компонентов ядерного генома — хроматин-связанным липидам. Выделяют два основных класса липидов — хроматин-специфические и ДНК-специфические (прочносвязанные) [7]. Несмотря на незначительность вклада в структурный состав хроматина (около 5 %), хроматин-связанные липиды во многом определяют структурную упаковку и функционирование ядерного генома. Особое значение уделяется этим структурам в связи с механизмами генотоксического повреждения хроматина. Ранее нами было показано, что липиды в хроматине организованы в виде определенных бислоев, сходных по своей структуре мембранным [8]. В хроматине существует система реакций переокисления хроматин-связанных липидов, отличающаяся по ряду свойств от аналогичных реакций ПОЛ в биологических мембранах. Одной из возможных причин подобных отличий является специфичность состава липидов хроматина [9]. Другими возможными причинами являются особенности структурной упаковки хроматина, наличие в его составе протяженных молекул ДНК, ядерных белков, оформленных в виде нуклеосомных и наднуклеосомных комплексов и т.д. Специфичность реакций переокисления хроматин-связанных липидов по отношению к аналогичным реакциям в мембранах выражается в меньшей интенсивности и скорости ПОЛ в хроматине по сравнению с микросомами, отсутствии оптимальных концентраций Fe2+ для стимуляции ПОЛ в хроматине, большей доли НАДФН-зависимого ПОЛ по сравнению с аскорбатзависимым ПОЛ хроматина, изменении структуры НАДФН-зависимого пол в сторону увеличения доли неферментативной составляющей [10]. Все это необходимо учитывать при разработке методов защиты ядерного генома от действия повреждающих факторов окружающей среды. В эксперименте было показано, что при отравлении животных ХОС и ФОС ведущая роль в механизме повреждения хроматина принадлежит модификации реакций переокисления хроматин-связанных липидов [3]. Изменение этих реакций предшествует во времени нарушению структурно-функциональной организации хроматина (изменение активности ДНК- и РНК-полимераз, включение меченных предшественников синтеза ДНК, РНК и белка, физико-химических свойств компонентов хроматина) [5]. Исходя из концепции о свободнорадикальной природе повреждения хроматина при интоксикации ХОС и ФОС, логичным представляется использование препаратов антиоксидантов для фармакологической коррекции нарушений. Для защиты ядерного генома от повреждающего действия ХОС и ФОС нами был выбран ряд препаратов различных фармакологических групп, обладающих антиоксидантным действием: ярко выраженным (ряд препаратов и БАВ природного происхождения: «Мумие-Витас», экстракты розы дамасской и репейника обыкновенного), средней степени (ацетилсалициловая кислота, нефедипин). Для представителей этих классов фармпрепаратов — НПВС и блокаторов кальциевых каналов — было показано наличие антиоксидантных свойств по отношению к процессам ПОЛ в биомембранах [11,12]. В третью группу был включен препарат «Нормазе», у которого антиоксидантные свойства отсутствовали. При изучении действия препарата «Нормазе» на ядерный хроматин клеток печени в условиях повреждения тетрахлорметаном и хлорофосом было обнаружено следующее. Препарат взаимодействует с репрессированным (РХ) и транскрипционно активным (ТАХ) хроматином, что было непосредственно показано методом микрокалориметрии [13,14]. Это взаимодействие осуществляется в результате связывания с NH3+-группами гистоновых белков хроматина ОН - групп сахарных остатков «Нормазе». Однако, подобное взаимодействие не сопровождается антиоксидантным эффектом на процессы ПОЛ хроматина. Ряд физико-химических параметров, отражающих структурное состояние белков, ДНК и липидов хроматина, нарушенных в результате интоксикации, не изменяются под влиянием действия «Нормазе», то есть, этот препарат не обладает защитным по отношению к ядерному геному (генопротекторным) действием. Таким образом, в данном случае отсутствие у препарата антиоксидантных свойств в условиях свободнорадикального повреждения ядерного генома, по всей видимости, определяет его неспособность выступать в качестве средства, защищающего хроматин от химического повреждения. В группу препаратов с выраженными антиоксидантными свойствами были включены спиртовые экстракты розы дамасской и репейника обыкновенного, а также препарат «Мумие-Витас». В условиях отравления хлорофосом профилактическое введение «Мумие-Витас» уменьшает гибель животных (68,6 % погибших без препарата и 34,3 % при его профилактическом введении). При этом в значительной мере снижалась степень повреждения ядерного генома в результате генотоксического действия хлорофоса, что выражалось в нормализации ряда физико-химических показателей, характеризующих структуру ДНК, гистоновых и негистоновых белков, а также липидов в хроматине. Под влиянием введения животным препарата в значительной мере нормализуются процессы ПОЛ в хроматине, модифицированные в результате генотоксического действия хлорофоса. Таким образом, препарат обладает антиоксидантным эффектом по отношению к реакциям переокисления хроматин-связанных липидов [15]. Тот факт, что защитный эффект «Мумие-Витас» непосредственно связан с его антиоксидантным действием в хроматине в условиях отравления животных хлорофосом, подтверждается также результатами опытов in vitro. С этой целью исследовали антирадикальную активность растворов «Мумие-Витас» с помощью стабильного радикала дифенилпикрилгидразина. Полученные данные свидетельствуют о наличии у препарата антирадикальных свойств. Ранее было показано, что наличие у «Мумие-Витас» антиоксидантных свойств, которое является основой его защитного эффекта, обусловлено наличием в его составе ряда потенциальных антиоксидантных компонентов (фитостероидов, витаминов, аминокислот и т.д.) [16]. Для дальнейшего анализа состава таблетированной формы «Мумие-Витас» были записаны инфракрасные спектры препарата, которые подтвердили наличие в его составе вышеперечисленных компонентов, обусловливающих антиоксидантные свойства препарата. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о наличии генопротекторного эффекта у таблетированной формы препарата «Мумие-Витас» при его профилактическом введении животным, отравленным ХФ. Как было показано, этот эффект реализуется в первую очередь в результате взаимодействия его компонентов, которым присуща антиоксидантная активность, с фосфатидилхолиновыми липидами и ДНК фракций хроматина, в результате чего наблюдается угнетение процессов ПОЛ в хроматине, прежде всего, в его транскрипционно активной фракции. Генопротекторный механизм действия этого препарата реализуется в результате антиоксидантного эффекта входящих в его состав компонентов, что было показано нами ранее [6]. Геномозащитный эффект «Мумие-Витас» реализуется при его взаимодействии в первую очередь с транскрипционно активной фракцией хроматина, в которой находятся «активно работающие» гены и структурно-функциональная организация которой, вероятно, способствует более полному проявлению антиоксидантной активности препарата. Следовательно, генопротекторная активность представителя препаратов природного происхождения «Мумие-Витас» в условиях химического повреждения хроматина клеток печени ХФ и введения препарата экспериментальным животным проявляется в результате его антиоксидантного действия по отношению к процессам ПОЛ в хроматине. В исследованиях in vitro были изучены еще два препарата из группы природных биологически активных комплексов, обладающих антиоксидантными свойствами — спиртовые экстракты розы дамасской (Rosa dаmascena) [17] и репейника обыкновенного (Agrimonia eupatoria) [18]. Было установлено, что оба эти комплекса биологически активных веществ (БАВ) активно взаимодействуют с фракциями РХ и ТАХ печени интактных и отравленных тетрахлорметаном и хлорофосом крыс. Взаимодействие в условиях in vitro (в пробирке) проявляется в снижении интенсивности индуцированного НАДФН и аскорбатом ПОЛ и изменении значений ряда физико-химических показателей, характеризующих структуру хроматина. Добавление к фракциям РХ и ТАХ печени интактных крыс (0,15—0,5 мг/мл по белку) 0,01; 0,02 и 0,05 мл экстракта розы дамасской приводит к снижению активности индуцированного НАДФН и аскорбатом ПОЛ. Так, во фракции РХ добавление 0,05 мл экстракта достоверно снижает величину НАДФН-индуцированного ПОЛ с 9685,91 нмоль МДА/мг белка за 2 ч инкубации до 6189,0 нмоль МДА/мг белка. Аскорбат-индуцированное ПОЛ снижается при добавлении 0,01 мл экстракта с 2552,1 до 973,2 нмоль МДА/мг белка . Во фракции ТАХ под влиянием добавления экстракта (0,01 и 0,05 мл) снижается величина аскорбат-зависимого ПОЛ с 4567,4 соответственно до 2651,4 и 2292,1 нмоль МДА/ мг белка за 2 часа. Более значительному антиоксидантному действию БАВ экстракта розы подвержены процессы ПОЛ во фракции ТАХ по сравнению с РХ и процессы неферментного ПОЛ по сравнению с ферментативным. Логично допустить, что данная фитокомпозиция ввиду наличия антиоксидантных свойств по отношению к реакциям ПОЛ во фракциях хроматина будет обладать нормализующим (генопротекторным) действием, «исправляя» повреждения структуры хроматина, вызванные в результате отравления животных тетрахлорметаном. С этой целью измеряли величины некоторых физико-химических параметров, характеризующих структуру хроматина при добавлении к фракциям РХ и ТАХ печени интактных и отравленных животных 0,01 мл экстракта розы дамасской. Результаты этой серии экспериментов свидетельствуют о том, что константа гашения триптофановой флюоресценции изменяется под влиянием интоксикации тетрахлорметаном: в РХ этот показатель увеличивается, а в ТАХ — снижается, т.е. интоксикация влияет на диффузию акриламида, приводя к компактизации структуры негистоновых белков в ТАХ и к релаксации — в РХ. Инкубация РХ с экстрактом БАВ розы приводит к частичной нормализации значений данного показателя, приближая его к контролю. Во фракции ТАХ его изменения не достоверны. При изучении флюоресценции флюорескамина, характеризующей структуру гистоновых белков, было обнаружено, что в условиях интоксикации наблюдается компактизация структуры гистоновых белков. Гистоновые белки вероятно, являются одной из основных мишеней связывания метаболитов тетрахлорметана в хроматине. В ТАХ изменение данного показателя носит противоположный характер, т.е. под влиянием интоксикации наблюдается релаксация структуры гистоновых белков. Добавление фитоэкстракта приводит к резкому снижению данного показателя в обеих фракциях. Это подтверждает тот факт, что в данном случае и яд и фитоэкстракт имеют одну и ту же мишень связывания в хроматине — гистоновые белки. Из этого следует, что профилактическое введение БАВ розы дамасской может иметь значительный генопротекторный эффект в условиях повреждения хроматина печени тетрахлорметаном. При изучении разности оптических плотностей растворов хроматина в присутствии и отсутствии разных концентраций экстракта розы было обнаружено, что при длине волны 270 нм с увеличением концентрации экстракта наблюдается нивелирование разности оптических плотностей между интактными и отравленными животными. Особенно ярко этот эффект выражен в ТАХ, что свидетельствует о восстановлении под влиянием экстракта in vitro структуры хроматина, нарушенной в результате интоксикации животных тетрахлорметаном, т.е. о наличии у данного комплекса БАВ из розы дамасской генопротекторных свойств. С помощью встраивания флюоресцентного поверхностного зонда 1-анилинонафталин-8-сульфоната аммония (АНС), которое оценивали по интенсивности флюоресценции, анализировали структурное состояние поверхности хроматина в условиях интоксикации животных тетрахлорметаном и добавлении in vitro экстракта розы. Было обнаружено, что в условиях отравления интенсивность флюоресценции зонда АНС несколько снижается, что свидетельствует о компактизации структуры фракций хроматина и об увеличении величины заряда его поверхности, одноименного по знаку с зарядом АНС. При значениях концентраций эндогенного экстракта > 10-5 М, наблюдается увеличение значений флюоресценции АНС в РХ и ТАХ из отравленных животных, что может свидетельствовать о релаксации поверхности (снижении заряда) хроматина. Данный защитный (генопротекторный) эффект экстракта розы дамасской более выражен во фракции транскрипционно активного хроматина по сравнению с РХ, приводя к разрыхлению поверхности ТАХ как из интоксицированных, так и из интактных животных, что имеет первостепенное значение, учитывая большую повреждаемость активной фракции при интоксикации ксенобиотиками. Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о наличии у БАВ экстракта розы дамасской выраженного генопротекторного действия (большего в случае ТАХ) относительно фракций хроматина. Данный эффект состоит в частичном восстановлении структуры хроматина, модифицированной действием яда. Другим объектом исследования антиоксидантных и генопротекторных свойств БАВ был спиртовый экстракт из репейника обыкновенного, содержащий дубильные вещества, эфирные масла, стероидные сапонины, кумарины, горечи, органические кислоты, холин, витамин С, никотиновую кислоту, витамины группы В и другие соединения. Галеновые препараты репейника обыкновенного проявляют вяжущие и мочегонные свойства. С точки зрения наличия антиоксидантных и генопротекторных свойств данный комплекс БАВ не изучали. В экспериментах in vitro изучали антиоксидантную активность экстракта — способность влиять на процессы индуцированного НАДФН и аскорбатом ПОЛ во фракциях РХ и ТАХ печени интактных крыс, а также его генопротекторную активность — способность модифицировать некоторые показатели структурной организации ядерного хроматина, нарушенные в результате отравления экспериментальных животных хлорофосом. При изучении влияния экстракта репейника на процессы ПОЛ хроматина было обнаружено, что антиоксидантная активность экстракта наблюдается только во фракции ТАХ. Добавление 0,01 и 0,05 мл экстракта к этой фракции хроматина достоверно снижает величину прежде всего аскорбат-зависимого ПОЛ, при этом величина НАДФН-зависимого ПОЛ и его составляющей, зависимой от нагревания, достоверно снижается лишь при добавлении 0,05 мл экстракта. Логично допустить, что данная фитокомпозиция ввиду наличия антиоксидантных свойств, будет обладать генопротекторным эффектом по отношению к нарушенной в результате интоксикации структуре хроматина печени, прежде всего — его транскрипционно активной фракции. С целью проверки этого предположения определяли некоторые физико-химические показатели, характеризующие структуру хроматина печени интактных и отравленных животных при добавлении 0,01 мл экстракта репейника в условиях in vitro. При определении активности тушения триптофановой флюоресценции акриламидом (показатель, характеризующий структуру негистоновых белков) была обнаружена релаксация негистоновых белков в результате интоксикации животных хлорофосом. При добавлении экстракта репейника к фракциям РХ и ТАХ защитный эффект (т.е. приближение данного показателя к контролю) был обнаружен только во фракции ТАХ, т.е. именно там, где ранее был показан антиоксидантный эффект данной фитокомпозиции. В целом обнаруженные антиоксидантный и генопротекторный эффекты экстракта репейника обыкновенного выражены в меньшей мере по сравнению с аналогичным экстрактом розы дамасской и проявляются только по отношению к активно транскрибируемой фракции хроматина. Таким образом, проведенные исследования показывают эффективность использования комплексов БАВ природного происхождения, обладающих антиоксидантными по отношению к процессам ПОЛ хроматина свойствами, в качестве средств, предохраняющих ядерный геном от химического повреждения. Взаимодействуя определенным образом с компонентами хроматина, они защищают их (прежде всего, активно транскрибируемые последовательности ДНК) от повреждающего действия свободных радикалов (кислорода, перекисей липидов и т.д.), выступая в данном случае либо как ловушки для свободных радикалов, либо изменяя структуру участков хроматина таким образом, что они становятся недоступными для повреждающего действия свободных радикалов. Кроме того, перспективность использования данных препаратов (комплексов БАВ) в качестве геномопротекторов определеяется отсутствием у них выраженного токсического действия и побочных эффектов. И наконец, в третью группу исследованных препаратов — потенциальных антиоксидантов и генопротекторов — входили представители нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) (ацетилсалициловая кислота) и блокаторов кальциевых каналов (нифедипин). Исследования были выполнены в условиях in vivo (введения препаратов экспериментальным животным на фоне повреждения хроматина тетрахлорметаном и хлорофосом) и in vitro (добавление препаратов непосредственно в пробирке к изолированным фракциям РХ и ТАХ, выделенным из печени интактных и отравленных крыс). Эти препараты, согласно данным литературы, обладают средней степенью антиоксидантной активности. В серии опытов in vivo по выяснению влияния ацетилсалициловой кислоты на генотоксический процесс, индуцированный у крыс введением 1 ЛД50 тетрахлорметана, животным вводили препарат внутрибрюшинно через 0,5 и 3 ч после яда в дозе 0,9 мг/100 г массы тела. Концентрация аспирина в физиологическом растворе — 1,8 мг/мл. В условиях отравления в репрессированной фракции хроматина повышается интенсивность НАДНФ- и аскорбат-индуцированного ПОЛ. Введение аспирина экспериментальным животным частично нормализует значения данных показателей, возвращая их к уровню, характерному для РХ из печени интактных крыс. Что касается процессов спонтанного ПОЛ, оцениваемого по концентрации промежуточных продуктов ПОЛ — диеновых конъюгатов, то их концентрация возрастает в условиях отравления тетрахлорметаном в обеих фракциях хроматина. Введение экспериментальным животным аспирина в значительной мере нормализует течение процессов спонтанного ПОЛ в РХ и ТАХ. Таким образом, в условиях отравления экспериментальных животных тетрахлорметаном обнаружено антиоксидантное действие ацетилсалициловой кислоты на течение процессов спонтанного и индуцированного НАДФН- и аскорбатом ПОЛ. В большей мере антиоксидантный эффект препарата проявляется по отношению к процессам спонтанного ПОЛ. Нормализация процессов ПОЛ во фракциях хроматина под влиянием введения животным аспирина положительно сказывается на структурной организации РХ и ТАХ. В условиях интоксикации резко нарушается структура хроматина, что выражается в увеличении доли ТАХ с 9,8 до 20,2 %. В условиях введения аспирина этот показатель приближиется к уровню интактных животных и его значение составляет 18,7 %. Во фракции РХ в условиях интоксикации растет уровень отношения белок/ДНК с 1,44 до 1,65 (р < 0,05). Введение животным аспирина нормализует данный показатель, который в этих условиях равен 1,59. Были определены спектрофотометрически некоторые показатели, характеризующие структуру хроматина в условиях интоксикации и введения аспирина: Д 216 0/Д 4240 0- показатель, характеризующий липид-белковые отношения в хроматине и Д216 /Д240 — 0ДНК-белковые взаимодействия. У отравленных животных первый показатель достоверно возрастает в ТАХ по сравнению с интактными с 4,0 до 4,5. Введение отравленным животным аспирина в значительной мере нормализует липид-белковое соотношение в ТАХ: в этих условиях значение данного показателя равно 4,15. ДНК-белковое взаимодействие также достоверно изменяется в ТАХ в течении интоксикации: Д260 0/Д240 равно у интактных 1,32, а у отравленных — 1,08, что свидетельствует о компактизации нуклеосомной структуры хроматина в условиях отравления, т.к. ДНК при этом больше «маскирована» (покрыта) белками хроматина. Введение аспирина полностью нормализует данный показатель (1,29). Дальнейшее изучение структурных особенностей липидной и белковой составляющих РХ и ТАХ в условиях интоксикации тетрахлорметаном позволило выявить новые доказательства генопротекторного действия аспирина. Изучали показатели, которые характеризуют структуру РХ и ТАХ: константу Штерна-Фольмера (негистоновые белки хроматина), вероятность индуктивно-резонансного переноса энергии (ИРПЭ) с липидов на белок (липид-белковые взаимоотношения в хроматине) и отношение флюоресценции мономерных форм липидного зонда пирена к его эксимерным формам (равно микровязкости липидного бислоя в хроматине). При отравлении первый показатель не изменяется ни в РХ, ни в ТАХ, что свидетельствует о неизменности структуры негистоновых белков в хроматине отравленных животных по сравнению с интактными. Однако, вероятность ИРПЭ резко возрастает в обеих фракциях хроматина при интоксикации животных тетрахлорметаном. Введение животным аспирина в значительной мере нормализует значение данного показателя (0,08 — у интактных, 0,14 — у отравленных, 0,11 — при введении аспирина в РХ и 0,118; 0,22 и 0,118 в ТАХ). Данные факты свидетельствуют о повышении белок-липидных взаимоотношений в хроматина при отравлении, возможно вследствие стимуляции процессов ПОЛ и о положительном влиянии на эти процессы введения аспирина — опять-таки скорее всего в результате нормализации влияния препарата на процессы ПОЛ хроматина. Под влиянием введенного тетрахлорметана значительно возрастает микровязкость липидного бислоя в активной фракции хроматина, что свидетельствует о компактизации структуры би-слоя в условиях отравления (0,9; 1,3 и 1,1 у интактных, отравленных и при введении аспирина). При изучении показателей, характеризующих структурные особенности негистоновых (собственная белковая флюоресценция) и гистоновых (флюоресценция зонда флюорескамина) белков, было обнаружено, что в условиях интоксикации значения этих показателей выше по сравнению с интактными животными в обеих фракциях хроматина. Введение отравленным животным аспирина приводит к нормализации значений данных показателей, что свидетельствует о наличии у данного препарата генопротекторного эффекта. Для изучения структурного состояния ДНК хроматина в условиях интоксикации и введении животным аспирина изучали степень встраивания (интеркаляции) флюоресцентного зонда этидий бромида между нитями двойной спирали. Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях интоксикации ДНК РХ становится более доступной для встраивания зонда, что свидетельствует о некоторой релаксации ее структуры, в то время как ДНК ТАХ, наоборот, становится более компактной, возможно в результате либо ее суперспирализации, либо образования сшивок ДНК-белок. Это приводит к снижению флюоресценции этидий бромида в результате снижения степени его интеркаляции между нитями двойной спирали. Введение отравленным животным аспирина в значительной мере изменяет значения изучаемого показателя, приближая их к уровню контрольных животных. Таким образом, введение животным с нарушенной структурой хроматина клеток печени аспирина обуславливает значительный генопротекторный эффект, что выражается в нормализации ряда показателей, характеризующих структуру основных компонентов хроматина: ДНК, белков и липидов. Последний подход для оценки влияния интоксикации тетрахлорметаном и антитоксической активности аспирина на структурную организацию хроматина заключается в зондировании экзогенным аспирином фракций хроматина из интактных, отравленных крыс и животных, получавших аспирин. Взаимодействие фракций хроматина с аспирином изучали с помощью метода микрокалориметрии. Было обнаружено, что кривые тепловыделения в зависимости от времени инкубации в значительной мере различаются у интактных и отравленных животных. Введение животным, отравленным тетрахлорметаном, аспирина в значительной степени нивелирует различия в интенсивности взаимодействия аспирина с фракциями хроматина из печени интактных и отравленных животных. В особенности генопротекторный эффект после введения животным аспирина выражен во фракции ТАХ. В этой серии экспериментов установлен еще один важный факт, который заключается в том, что интоксикация приводит к увеличению интенсивности взаимодействия фракций хроматина с экзогенным аспирином. Видимо, именно поврежденный хроматин является наиболее подходящей мишенью взаимодействия для молекул ацетилсалициловой кислоты. Этот вывод был подтвержден исследованиями in vitro, в которых геномозащитные свойства молекулы аспирина изучали в условиях добавления его к фракциям хроматина печени животных изученных групп в пробирке. С помощью метода микрокалориметрии было установлено, что аспирин интенсивно взаимодействует с фракциями РХ и ТАХ из печени интактных животных и отравленных тетрахлорметаном и хлорофосом. Причем, изменение структуры фракции РХ под влиянием интоксикации данными ядами носит неспецифический характер: в обоих случаях интенсивность взаимодействия аспирина с фракциями РХ печени отравленных животных выше по сравнению с интактными. В то же время изменение ТАХ под влиянием интоксикации специфичны: если в случае интоксикации тетрахлорметаном интенсивность взаимодействия повышается, то в случае интоксикации хлорофосом — снижается по сравнению с интактными животными. Эти данные являются иллюстрацией того факта, что именно изменение под влиянием интоксикации во фракции активно транскрибируемого хроматина определяет специфику генотоксического процесса. Подтверждением этому служат также данные о том, что в условиях фармакологической коррекции именно фракция ТАХ является первичной мишенью действия фармакологических препаратов [3, 6]. В условиях in vitro антиоксидантные свойства аспирина выражены в меньшей степени, чем in vivo . Так, при добавлении аспирина (10-5 0М) к фракциям хроматина печени из интактных и отравленных хлорофосом крыс антиоксидантный эффект был обнаружен только в случае РХ и ТАХ печени отравленных животных: в первом случае аспирин в данной концентрации достоверно снижал интенсивность аскорбат-индуцированного ПОЛ, во втором — НАДФ-индуцированного ПОЛ. По видимому, в условиях in vivo фармакологический эффект (антиоксидантная и генопротекторная активность) на хроматин обусловлен не самим аспирином, а его метаболитами, в частности, салициловой кислотой, которая в дальнейшем глюкуронируется на микросомах и выводится из клетки [19]. Правильность подобного предположения подтверждается данными флюоресцентного анализа, где было обнаружено, что в условиях добавления экзогенного аспирина (10-5 0М) к фракциям хроматина из печени интактных и отравленных тетрахлорметаном крыс интенсивность флюоресценции зонда для гистоновых белков — флюорескамина — увеличивается, в то время как в условиях in vivo введение аспирина вызывает снижение величины данного показателя (см. выше). В то же время интенсивность собственной флюоресценции — показателя, характеризующего структуру негистоновых белков хроматина, — снижается при действии аспирина как в условиях in vivo, так и in vitro. Однако, необходимо обратить внимание на тот факт, что первый показатель (флюоресценция флюорескамина) под влиянием аспирина изменяется в большей мере, чем второй (собственная белковая флюоресценция), из чего следует, что основной мишенью связывания аспирина в хроматине являются гистоновые белки (так же, по-видимому, как и изученных ядов), поэтому профилактическое или лечебное введение препарата в условиях интоксикации должно оказывать генопротекторное действие в результате конкуренции с ядом за одни и те же места связывания на хроматине, что и было подтверждено в опытах in vivo (cм. выше). Результаты спектрофотометрического титрования растворов фракций хроматина аспирином при различных длинах волн указывают на то,что повышение оптической плотности растворов аспирина в присутствии фракций хроматина наиболее выражено при длине волны 296 нм, причем для фракции ТАХ величина эффекта намного больше по сравнению с РХ. Это является подтверждением тому, что основной мишенью связывания аспирина с хроматином являются гистоновые белки активной фракции хроматина. Кроме того, было обнаружено, что при концентрации аспирина 5 х 10-5 и 10-4 М нивелируется разница между кривыми титрования ТАХ из интактных и отравленных животных, т.е. при данных концентрациях препарат оказывает генопротекторное действие в условиях in vitro. В дальнейших экспериментах было установлено, что изменение разности оптической плотности растворов аспирина в присутствии и отсутствии фракций хроматина в зависимости от длины волны наиболее выражено для РХ — в районе поглощения ДНК (260 нм), а для ТАХ — в районе поглощения белков (220—230 нм), из чего следует, что в РХ в процессе взаимодействия с аспирином принимают участие как белки так и ДНК, а в ТАХ взаимодействие и генопротекторная активность аспирина реализуется через белки (прежде всего гистоновые). В условиях in vitro было изучено влияние аспирина на способность комплексообразования флюоресцентного зонда этидий бромида с ДНК РХ и ТАХ. Было обнаружено образование двух форм комплексов ДНК с этидий бромидом, что соответствует данным литературы. Инкубация катиона этидий бромида с ДНК РХ и ТАХ в присутствии аспирина приводит к изменению количества мест связывания зонда с ДНК: в РХ их количество снижается с 16 до 8, а в ТАХ — с 17 до 10 (р < 0,05). Интоксикация тетрахлорметаном приводит к резкому изменению структуры ДНК обеих фракций, что вызывает нивелирование различий в количестве мест связывания при добавлении аспирина. В РХ их количество равно: без аспирина — 18, в присутствии аспирина — 20, в ТАХ: без аспирина — 21, с аспирином — 18 (различия недостоверны). Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие in vitro аспирина с ДНК фракций хроматина печени интактных животных сопровождается снижением его комплексообразующей способности с катионом этидий бромида, что может быть обусловлено конкуренцией последнего с аспирином за места связывания с ДНК. У интактных животных добавление аспирина к фракциям хроматина не приводит к ощутимым изменениям показателей, характеризующих взаимодействие ДНК хроматина с зондом. Интоксикация тетрахлорметаном приводит к изменению константы связывания ДНК ТАХ с зондом с 90 мл/мг до 43 мл/мг. Инкубация с экзогенным аспирином приводит к еще большему снижению этого показателя (18 мл/мг). То есть, в отличие от экспериментов in vivo, описанных выше, в условиях in vitro аспирин не вызывает нормализации показателей, характеризующих взаимодействие зонда с ДНК, что может свидетельствовать о том, что в условиях in vivo генопротекторный эффект в отношении ДНК хроматина оказывают метаболиты аспирина. Тем не менее, нельзя исключить того, что какая-то часть молекул ацетилсалициловой кислоты достигает ядра и хроматина в неизмененном состоянии и связывается с геномом, оказывает на него разностороннее действие, в том числе и повреждающее. Последнее предположение во многом объясняет эмбриотоксический и тератогенный эффекты аспирина. Итак, результаты опытов свидетельствуют о наличии у представителя группы НПВС — аспирина — геномозащитных свойств в условиях химического повреждения клеток печени тетрахлорметаном. Это проявляется в нормализации ряда показателей, характеризующих структуру основных компонентов хроматина — ДНК, белков и липидов. Учитывая во многом подобный эффект аспирина в условиях in vitro, можно утверждать, что геномопротекторный эффект препарата реализуется за счет связывания метаболитов аспирина, близких к нему по своей структуре (возможно, салициловой кислоты), с компонентами фракций хроматина, вследствие чего происходит «гашение» стимулированных в результате отравления свободнорадикальных реакций переокисления хроматин-связанных липидов, особенно во фракции ТАХ, которая в наибольшей степени ответственна за структурно-функциональную целостность генома. Полученные данные согласуются со значениями показателей, которые характеризуют относительное количество выживших в результате отравления животных на фоне введения аспирина. Если в случае введения одного тетрахлорметана этот показатель равен 44,6 %, то при введении животным после яда аспирина он увеличивается до 75,6 % (р < 0,05). Таким образом, введение отравленным животным аспирина оказывает положительное влияние на токсический процесс, в котором, возможно, не последнюю роль играет восстановление структурной целостности (интактности) хроматина, нарушенной в результате генотоксического действия тетрахлорметана. В этой группе препаратов, обладающих средней степенью антиоксидантной активности, был изучен представитель блокаторов кальциевых каналов — нифедипин. В результате всестороннего изучения влияния введения нифедипина в терапевтической дозе животным, отравленным тетрахлорметаном, было обнаружено, что препарат не обладает геномозащитным эффектом. Этот вывод был подтвержден также исследованиями in vitro. Хотя, как было установлено с помощью метода микрокалориметрии, нифедипин активно взаимодействует с фракциями РХ и ТАХ из печени интактных и отравленных тетрахлорметаном крыс. Однако, в отличие от аспирина, это взаимодействие не сопровождается геномопротекторным эффектом. Ранее нами было установлено отсутствие геномозащитного действия у одного из представителей группы блокаторов кальциевых каналов — верапамила в условиях повреждения хроматина печени хлорофосом [20]. Таким образом, в результате проведенных экспериментальных исследований было установлено, что препараты и комплексы БАВ, обладающие в той или иной мере антиоксидантным эффектом по отношению к процессам переокисления хроматин-связанных липидов, проявляют геномозащитный эффект в условиях генотоксического процесса, вызванного введением хлор- и фосфорорганических соединений. Величина геномозащитного эффекта, как правило, коррелирует со степенью их антиоксидантной активности. Изученные вещества, не обладающие такой активностью, были также лишены защитного действия по отношению к ядерному геному. Литература |