ФАРМАКОЛОГИЯ И ТОКСИКОЛОГИЯ ОКСИДА АЗОТА: ДВА «ЛИЦА» ОДНОЙ И ТОЙ ЖЕ МОЛЕКУЛЫ

А. И. Соловьев, д.м.н., А. В. Стефанов, д.б.н., гл. кор. АМН Украины

Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев

Введение
Когда в начале 80-х годов нашего столетия группой исследователей в составе Furchgott, Zavadzki и Palmer, Ferrige, Moncada была открыта биологическая роль монооксида азота (NO) это стало одновременно и концом, и началом событий мирового масштаба в биологических науках. Концом, потому что поставило точку в длинной, уходящей более чем на 130 лет назад, цепи исследований механизмов терапевтического действия нитроглицерина и других нитровазодилататоров. Начиная с 1867 г., когда Thomas Lauder Brunton впервые использовал амилнитрит для лечения грудной жабы, и вплоть до начала 80-х годов нашего столетия клеточные механизмы действия терапевтических нитровазодилататоров оставались неизвестными, несмотря на их самое широкое использование в клинике внутренних болезней. Кстати, в истории фармакологии и медицины это не единственный случай. Потребовалось больше века, чтобы стало ясным, что в основе действия амилнитрита и нитроглицерина лежит освобождение молекулы NO с последующей активацией ею фермента растворимой гуанилатциклазы, ростом внутриклеточного содержания циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) и запуском сложного комплекса внутриклеточных процессов, приводящих в итоге к расслаблению гладких мышц сосудов.

Но одновременно открытие NO как биологического регулятора стало началом развития нового направления в регуляции клеточных функций и коммуникаций. Количество публикаций по физиологии, фармакологии, биохимии и патофизиологии NO стало увеличиваться с необыкновенной быстротой, и в 1992 г. NO был объявлен молекулой года. Первоначально открытый Furchgott и Zavadzki эндотелиальный релаксирующий фактор, определяющий, как известно, уровень тонического напряжения гладких мышц сосудов, был затем идентифицирован как NO. Позже эта же молекула была идентифицирована как нейропередатчик в центральной и периферической нервной системе, где она, как оказалось, принимает участие в регуляции целого ряда важных биологических функциях, включая процессы обучения и памяти. Механизмы регуляции перистальтики кишечника, эрекции и регуляции выделения гистамина тучными клетками также оказались NO-зависимыми. Затем было установлено, что при воспалении и опухолевом росте клетки-киллеры используют NO для уничтожения бактерий и злокачественно перерожденных клеток. Число известных физиологических и патофизиологических функций, протекающих с участием NO, с каждым годом резко увеличивалось и продолжает расти с каждым днем.

Синтез NO в организме
Синтез NO в организме человека и животных осуществляется в результате 5-и электронного окисления концевого атома азота гуанидина аминокислоты L-аргинина с помощью семейства ферментов, определяемых как NO-синтазы (NOS) и относящихся к классу гем-содержащих циторедуктаз подобных цитохрому Р-450 [19]. Известно, что NOS бывают эндотелиальные, макрофагальные и нейрональные. Следует помнить, что название NOS вовсе не отражает места ее строгой локализации. Так, например эндотелиальная NOS широко распространена в нервной системе, где ее активность может быть в ряде случаев даже выше, чем в эндотелиоцитах. Каждая из них (за исключением макрофагальной NOS, которая бывает только индуцибильной) подразделяется на два подтипа — конститутивный и индуцибильный. Конститутивные NOS, функционально связанные с плазматической мембраной, экспрессированы постоянно и обеспечивают базальное освобождение NO. Этот тип фермента содержит места связывания для НАДФ, ФАД, тетрагидробиоптерина и их активность строго регулируется комплексом Са²⁺ — кальмодулин; индуцибильные же NOS экспрессируются под влиянием цитокинов и бактериальных полисахаридов, что требует времени порядка 4-6 часов. Главное отличие 2-х подтипов NOS заключается в том, что в индуцибильной NOS кальмодулин является как бы субъединицей фермента, и поэтому активность этого подтипа NOS не зависит от изменений концентрации внутриклеточного кальция [4].

Характеристика и механизмы действия NO
NO представляет собой гидрофобный газ с химическими свойствами, делающими его удивительно подходящим на роль внутри- и межклеточного посредника. Он может существовать в виде относительно стабильного, нейтрально заряженного радикала (NO^.) с липофильными свойствами и резко выраженной тенденцией взаимодействовать прежде всего с молекулами, обладающими неспаренным электроном, такими как супероксид анион, железо и молекулярный кислород. NO^. может также подвергаться одноэлектронному восстановлению с образованием нитроксил аниона (NO^-) или, потеряв электрон превращается в ион нитрозония (NO⁺).

Образовавшийся NO^. представляет собой многофункциональную эффекторную молекулу. Основной его мишенью в клетке (иногда даже говорят о внутриклеточном рецепторе NO^., что, конечно же, неверно) является растворимая гуанилатциклаза. NO^. связывается с железом каталитической субъединицы фермента, что приводит к росту активности гуанилатциклазы и накоплению внутри клетки цГМФ. Расслабляющий эффект цГМФ-зависимых протеинкиназ на гладкие мышцы реализуется главным образом посредством контроля концентрации Са²⁺ в цитозоле благодаря их влиянию на продукцию инозитол 1,4,5-трифосфата, активность кальциевых АТФ-аз и активации Са²⁺-зависимых К⁺ каналов [14]. Есть также данные о том, что NO^. может снижать вход Са²⁺ в гладкомышечные клетки через L-тип кальциевых каналов [5].

Недавно нами в опытах с использованием интактных и химически скинированных сосудистых гладких мышц и флуоресцентных методов измерения внутриклеточной концентрации Са²⁺ был обнаружен новый, цГМФ-независимый механизм расслабления гладких мышц, обусловленный прямым влиянием NO на сократительные белки гладкомышечных клеток. Было установлено, что NO обладает способностью снижать Са²⁺-чувствительность сократительных белков и этот феномен обусловлен активацией внутриклеточных фосфатаз, ответственных за дефосфорилирование легких цепей миозина [20, 21]. Это открывает перспективы создания принципиально нового класса вазоактивных препаратов, обладающих способностью избирательно модулировать Са²⁺-чувствительность сократительных белков и тем самым уровень сосудистого тонуса.

Важной мишенью для NO в клетке являются белки, содержащие SH-группы [4]. Производное NO, ион нитрозония (NO⁺), легко реагирует с SH-группами, образуя биологически активные S-нитрозосоединения. Очевидно, именно механизм нитрозирования сократительных регуляторных белков и белков ионных каналов лежит в основе прямого (цГМФ-независимого) и пока еще мало изученного действия NO.

NO может модулировать сосудистую функцию также посредством контроля за экспрессией генов, ответственных за синтез ряда вазоактивных белков, таких как, например, эндотелины, фактор роста сосудистых клеток и др.

Роль NO в развитии патологических процессов. Недавно было показано [13], что NO принимает участие в процессах мобилизации внутриклеточного кальция посредством стимуляции продукции циклической АДФ-рибозы и последующей активации рианодиновых рецепторов.

Параллельно с ростом числа клеточных функций, регулируемых NO, увеличивался и список заболеваний, связанных с нарушением синтеза и/или выделения NO: эссенциальная гипертония, ишемическая болезнь сердца и инфаркт миокарда, бронхиальная астма, первичная легочная гипертензия, невротическая депрессия, импотенция, диабет — все это далеко не полный перечень патологических процессов, в той или иной степени связанных с изменениями в метаболизме NO^. NO стали приписывать роль основного повреждающего фактора при ишемии мозга, обусловливающего, в частности, нейротоксичность глютамата. В то же время, в ряде случаев было показано, что NO может оказывать и отчетливое нейропротекторное действии при ишемии мозга.

Роль NO в процессах нейротрансмиссии и развития ишемии мозга требует более детального рассмотрения. Открытие NO принципиально изменило представления о механизмах передачи информации в нервной системе [8]. Классическая картина, когда передача информации между нейронами осуществляется в строго определенных местах (синапсах) и в одном направлении, сменилась концепцией диффузной передачи сигнала. Действительно, NO может распространяться от места его образования во все стороны, в том числе и ретроградно, легко проходя через липидную и водную фазы и взаимодействуя с нервными, глиальными и сосудистыми клетками. С учетом его пороговой концентрации (1 нМ), кинетики инактиваци и времени жизни (~ 5 сек), эффективный радиус действия NO^. составляет не менее 300—1000 мкм, что означает вовлечение в сферу активности NO миллионов синапсов.

Что же касается противоречивой роли NO и его производных в развитии ишемии мозга, то следует сказать, что в последние годы гибель нейронов при недостатке кислорода связывают с нейротоксичностью глутамата (Dawson, Snyder, 1994). Но взаимодействие глутамата с NMDA рецепторами и последующий массивный вход ионов кальция является лишь пусковым моментом в цепи событий, приводящих к повреждению нейрона и его гибели при ишемии мозга. Увеличение внутриклеточной концентрации Са²⁺ приводит к активации NOS и интенсивному образованию NO и пероксинитрита (ONOO^-) , являющегося непосредственной причиной гибели клеток. Это положение подтверждается тем фактом, что ингибиторы NOS в ряде случаев оказываются весьма эффективными для предотвращения повреждения нейронов при ишемии.

В то же время, есть и противоположные данные, когда NO оказывает нейропротекторный эффект. Это противоречие объясняется тем, что эффект монооксида азота на клетку зависит от окислительно-восстановительного состояния его молекулы: из NO. легко образуется токсичный ONOO^-, а NO⁺ обладает способностью нитрозировать NMDA-рецепторы, блокируя тем самым вход внеклеточного Са²⁺ и синтез NO [8]. Идеальным терапевтическим агентом для лечения инсульта был бы такой препарат, который бы предотвращал появление NO^., но в то же время способствовал бы накоплению NO⁺.

Механизмы образования и токсического действия ONOO^-
Превращение доброго и заботливого лица доктора Джекила (NO) в физиономию атакующего мистера Хайда (ONOO^-) происходит очень быстро, а последствия такой трансформации часто бывают фатальными для окружающих тканей и организма в целом. Поэтому есть смысл рассмотреть эти превращения более детально.

NO является самым стабильним из свободных радикалов. Превращение NO^. из физиологического регулятора в токсический агент происходит в результате взаимодействия NO. c супероксид анионом и образования ONOO^-, который, распадаясь в процессе диффузии от места его образования на ОН^- и NO₂, буквально сокрушает на своем пути самые различные биомолекулы и биомембраны.

Следует отдельно остановиться на свойствах супероксид аниона как ключевого компонента в реакции образования ONOO^-. Известно, что образование супероксида происходит при одно-электронном восстановлении молекулярного кислорода. Термин "супероксид" возник для обозначения необычной электронной конфигурации этой молекулы, но вовсе не из-за ее высокой реакционной способности [17]. Тем не менее, до последнего времени супероксиду даже в учебниках приписывают некие «суперокисляющие» свойства. На самом же деле, при физиологических значениях рН активность супероксида довольно низка, так как для этого требуется замещение второго отрицательного заряда на его молекуле. Нейтрализация первого отрицательного заряда при протонировании облегчает действие супероксида как оксиданта [2], но и в этом случае рКа для супероксида остается равным лишь 4.8 (аналогичная величина для ONOO^- равна 6.9). Иными словами, супероксид действует как оксидант лишь в кислой среде, когда молекула-мишень является хорошим одно-электронным донором, таким как, например, восстановленное железо. Только после соединения с NO^. и образования ONOO^- супероксид (точнее, то, во что он превратился) приобретает приписываемые ему токсические свойства.

Ранее токсичность супероксида объясняли образованием из него гидроксил радикала d катализируемой железом реакции Габера-Вейса:
О₂ + Fe³⁺ ==> O₂ + Fe²⁺ (1)
Fe²⁺ + H₂O₂ ==> ^.OH + ^-OH +Fe³⁺ (2)

В этой реакции супероксид действует как восстановитель для железа. Если учесть, что концентрация супероксида в тканях колеблется от 10 до 100 пМ [7], в то время как другие восстановители, например, аскорбат, присутствуют в гораздо больших концентрациях и восстанавливют Fe³⁺ до Fe²⁺ гораздо более эффективно, то протекание такой реакции в условиях in vivo представляется маловероятным. К тому же, если супероксид действительно служит лишь в качестве источника перекиси водорода, то супероксиддисмутаза не должна была бы обладать протективными свойствами при окислительном стрессе и реперфузионных поражениях миокарда.

Супероксид способствует также увеличению пула свободного железа путем освобождения его из ферритина. Но даже при высокой концентрации железа скорость восстановления перекиси водорода до гидроксил-радикала остается очень низкой — 10³—10⁴ М^-1 сек^-1 [18].

Таким образом, реакция Габера-Вейса требует наличия компонентов, концентрация которых in vivo очень низка из-за высокой эффективности молекулярных ловушек (супероксиддисмутаза, каталаза, ферритин), что делает скорость образования гидроксил радикала зависящей от 3-х субстанций, имеющихся в наличии в очень малых концентрациях и реагирующих между собой с очень низкой скоростью.

К тому же, эффективный радиус действия образовавшегося таким образом гидроксил радикала измеряется лишь несколькими ангстремами, т.е. он должен образовываться в непосредственной близости от молекулы или клетки-мишени. Все это заставляет искать другие механизмы, объясняющие токсичность супероксида. Итак, момент образования ONOO^- является ключевым для трансформации доброго фармаколога доктора Джекила в злого токсиколога мистера Хайда. Именно синтез ONOO^- является той точкой отсчета, за которой заканчивается физиологическое действие NO^. и начинается его деструктивное воздействие. Как уже было отмечено выше, ONOO^- образуется в ходе соперничества NO^. и супероксиддисмутазы за супероксид анион. К счастью, физиологическая концентрация супероксиддисмутазы в тканях в 100—1000 раз выше чем концентрация NO^., а константа скорости реакции супероксидисмутазы с супероксид анионом лишь в 3 раза ниже, чем для NO^. [12]. Следовательно, ONOO^- в нормальных условиях образуется мало. Если активность NO-синтаз низкая, то образовавшийся NO^. легко нейтрализуется кислородом [10]. В случае же массивного производства NO^. и супероксид аниона равновесие сдвигается в сторону образования ONOO^- [3], и тогда наступает катастрофа для клеточного окружения. Сам ONOO^- и продукты распада его протонированной формы повреждают или разрушают биологические структуры путем их окисления или нитрозилирования.

Синтез ONOO^- — это очень быстрая реакция с константой скорости 3,7 х 10⁷ М^-1 . сек^-1 :

О₂ + NO^. ==> ONOO^- (3)

В условиях in vivo это практически единственно реальный путь образования ONOO^-.

Распад (декомпозиция) ONOO^- происходит 3 различными способами [9]. Поскольку ONOO^- имеет рКа равную 6,9, то при физиологических значениях рН он подвергается протонированию :

ONOO^- + Н⁺ <==> ONOOH (4)

Затем ONOOН или распадается на ОН^. и NO₂ после взаимодействия с клеткой-мишенью :

ONOOН ==> ОН^. + NO₂ (5),

или же, в отсутствие «жертвы», распадается до нитратов:

ONOOН ==> HNO₃ <==> NO₃ + H⁺ (6)

Третий путь декомпозиции ONOO^- наиболее сложен. Он может быть описан следующим циклом реакций:

ONOO^- + метал ==> NO⁺² ...O^- - - - - - метал > белок - - - - тирозин - - - - NO₂ + HO-метал¹⁺ + метал ²⁺ + Н₂О (7)

Главным следствием этой реакции in vivo является модификация тирозиновых остатков белковых молекул. Интересно, что главный удар ONOO^- наносит именно по тирозину. Это приводит к деструкции не только многих ферментных и структурных систем, но и блокированию клеточной сигнализации, опосредуемой тирозинкиназой, так как образующийся в ходе реакции нитротирозин очень напоминает фосфотирозин, необходимый для этой цели.

Единственным шансом для сохранения структурной целостности молекулы тирозина в окружении ONOO^- является повышение концентрации SH-содержащих соединений (S-нитрозоглутатиона и/или S-нитрозоцистеина), которые способны образовывать, взаимодействуя с ONOO^-, безопасные S-нитрозотиолы. Учитывая время полужизни ONOO^-, составляющее в фосфатном буфере при рН 7,4 и температуре 37°С приблизительно 1 сек., можно предположить, что он успевает диффундировать от места его образования на расстояние, равное нескольким клеточным диаметрам, что вполне достаточно для того, чтобы проявить свой специфический разрушительный характер.

Основные механизмы повреждающего действия ONOO^- заключаются в: а) нарушении фосфорилирования тирозина; б) нарушении функции целого ряда важных белковых молекул; в) усилении протеолиза белков; г) инициации аутоиммунных реакций к гаптенам, возникающим в ходе нитрирования белков. ONOO--индуцированное нитрирование белков изменяет их конформацию вследствие снижения гидрофобности тирозина и/или путем изменения знака их заряда от нейтрального до отрицательного.

Итак, какова же роль NO^. и его метаболита — ONOO^- — в процессах жизнедеятельности организма? Защита или повреждение клеток? Регуляция функций или их нарушение? Ответ, очевидно, заключается в действующей концентрации NO^. При концентрациях порядка 10—100 нM, обеспечивающих процессы клеточной и межклеточной сигнализации, реальный вред клеткам нанесен быть не может, так как воздействию таких концентраций организм подвержен постоянно в течение 70—80 лет жизни и, несомненно, к ним адаптирован. К тому же высокий уровень активности супероксидисмутазы препятствует образованию ONOO^-. При повышении концентрации NO^. до 2—4 мкМ, как это имеет место при ишемии мозга, или даже до 10 мкМ, как это бывает в непосредственной близости от макрофагов [11] способность супероксиддисмутазы конкурировать с NO^. за супероксид анион резко падает и синтез ONOO^- увеличивается.

В некоторых случаях, однако, гиперпродукция NO^. может иметь положительные последствия. Например, для увеличения коллатерального кровотока в условиях окклюзии одной из коронарных артерий. Или для снижения адгезии нейтрофилов и агрегации тромбоцитов [15]. Но даже в этом случае оксид азота ведет себя как молекулярный хамелеон. Как известно, восстановление кровотока (реперфузия) сопровождается активацией процессов свободнорадикального окисления и, соответственно, создаются условия для образования ONOO^-. Полученные недавно нами экспериментальные данные как в условиях in situ, так и in vitro свидетельствуют о том, что ONOO^- может являться одним из основных факторов, обуславливающих появление сердечных аритмий в период реперфузии.

Степень токсичности связки NO^./ONOO^- определяется также и местом его образования. Известно, например, что конститутивная NO-синтаза в эндотелиальных клетках связана с плазматической мембраной. Гидрофобный и липофильный характер NO^. благоприятствует его компартментализации в липидном бислое, что защищает его от реакции с гидрофильным супероксид анионом. В то же время, внутри липидного бислоя NO^. может легко (константа скорости реакции — 3х10⁹ М^-1 сек^-1) реагировать с липидными пероксидными радикалами [16]. Образование стабильных органических нитратов (R-NO₃) эффективно тормозит перекисное окисление липидов и, следовательно, является защитной клеточной реакцией.

В заключение нельзя не остановиться на широко известной проблеме токсического действия нитритов и нитратов. Изучению токсического действия конечных продуктов метаболизма NO, нитритов и нитратов, на организм человека посвящено огромное количество работ. И все же, очевидно, прав В.П. Реутов, когда пишет, что первоначально было «трудно понять, почему такие простые молекулы, как ионы NO^3- и NO^2- со слабой или умеренной окислительностью способностью обладают такими свойствами». Используя методы ЭПР-спектроскопии, спектрофотометрии, спектрофлуометрии и полярографии, автору удалось показать, что в организме млекопитающих NO^2- легко восстанавливается в NO, образуя таким образом замкнутый метаболический цикл. Интересно, что этот механизм начинает действовать особенно активно в условиях гипоксии. В свете представленных выше данных о механизмах токсического действия NO^./ONOO^- становятся более понятными токсические эффекты нитритов и нитратов.

Литература
1. Реутов В.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих // Усп. биол. наук. —1995 .— Т. 35. —С. 189—228.
2. Baum R. Superoxide theory of oxygen toxicity is center of heated debate. // Chem. Engin. News. —1984. —V. 9. —P. 20—28.
3. Beckman J., Beckman T., Chen J. et al. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implication for endothelial injury from nitric oxide and superoxide // Proc. Natl. Acad. Sci USA. —1990. —V. 87. —P. 1620—1622.
4. Busse R., Fleming I., Schini V. Nitric oxide formation in the vascular wall: regulation and functional implications // In: The role of nitric oxide in physiology and pathophysiology (eds. Koprowski, H., Maeda, H.). — Springer—Verlag, Berlin—Heidelberg. —1995. —P. 7—18.
5. Clapp L., Garney A. Modulation of calcium movements by nitroprusside in isolated smooth muscle cells // Pflug. Arch. —1991. —V. 418. —P. 462—470.
6. Dawson T., Snyder S. Gases as biological messengers: nitric oxide and carbon monoxide in the brain // J. Neurosci. —1994. —V. 14(9). —P. 5147—5159.
7. Gardner P., Fridivich I. Inactivation—reactivation of aconitase in Escherichia coli A sensitive measure of superoxide radical // J. Biol. Chem. —1992. —V. 267. —P. 8757— 8763.
8. Garthwaite J., Boulton C. Nitric oxide signalling in the central nervous system // Annu. Rev. Physiol. —1995. —V. 57. —P. 683—706.
9. Crow J., Beckman J. The role of peroxynitrite in nitric oxide—mediated toxicity // In: The role of nitric oxide in physiology and pathophysiology (eds. Koprowski, H., Maeda, H.). —Springer—Verlag.— Berlin—Heidelberg. —1995. —P. 57—73.
10. Gryglewski R., Palmer R., Moncada S. Superoxide anion is involved in the breakdown of endothelial—derived vascular relaxing factor // Nature. —1986. —V. 320. —P. 454—457.
11. Ischiropoulos H., Zhu L., Beckman J. Peroxynitrite formation from macrophage—derived nitric oxide // Arch. Biochem. Biophys. —1992. —V. 298. —P. 446—451.
12. Klug D., Rabani D., Fridovich I. A direct demonstration of the catalytic action of superoxide dismutase through the issue of pulse radiolysis // J. Biol. Chem. —1972. —V. 247. —P. 4839—4832.
13. Lee H. Cyclic ADP—ribose: a new member of a superfamily of signalling cyclic nucleotides // Cell. Signal. —1994. —V. 6. —P. 591—600.
14. Lincoln T., Komanavilas P., Cornwell T. Pleotropic regulation of vascular smooth muscle tone by cyclic GMP-dependent protein kinase // Hypertension. —1994. —V. 23. —P. 1141—1147.
15. Macdonald P., Read M., Dusting G. Synergestic inhibition of platelet aggregation by endothelium-derived relaxing factor and prostacyclin // Thromb. Res. —1988. —V. 49. —P. 437—449.
16. Padmaja S., Huie R. The reaction of nitric oxide with organic peroxyl radicals // Biochem. Biophys. Res. Commun. —1993. —V. 195. —P. 539—544.
17. Pauling L. The discovery of superoxide radical // Trends Biochem. Sci. —1979. —V. 4. —P. N270—N271.
18. Rush J., Koppenol W. Reactive intermediates formed by the interaction of hydrogen peroxide and ferrous complexes // In: Beaumont, P. et al., (eds) Free radicals, metal ions and biopolimers. —Richelieu. —London. —1989. —P. 33—44.
19 Sessa W. The nitric oxide synthase family of proteins // J. Vasc. Res. —1994. —V. 31. —P. 131—143.
20. Soloviev A., Hellstrand P., Stefanov A. Nitric oxide decreases myofilament Ca²⁺-sensitivityi rat tail artery smooth muscle independent of guanylyl cyclase activation // J. Vasc. Res. —1996. —V. 33 (2). —P. 43.
21. Soloviev A., Hellstrand P., Stefanov A. Nitric oxide but not peroxynitrite relaxes a—toxin permeabilized smooth muscle of rat tail artery // J. Vasc. Res. —1997. —V. 34 (1). —P. 138.