УДК 615.856; 616-089.811; 616.45-001

ВЛИЯНИЕ АКЦЕПТОРОВ ОКСИДА АЗОТА НА КРИТЕРИАЛЬНО ЗНАЧАЩИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ У КРЫС С НИТРИТНОЙ НАГРУЗКОЙ

Н.П. Дмитренко, д.б.н., С.В.Сноз, к.б.н., с.н.с, С.Г. Шандренко, Т.О. Кишко, Л.Н. Смердова, Л.М. Веременко, инженер I категории

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя МЗ Украины, г. Киев

Оксид азота (NO) синтезируется в организме животных и человека NO-синтазой из гуанидинового азота L-аргинина клетками разных типов, имеет свободнорадикальные свойства, контролирует многие биохимические процессы и выполняет важную роль в реализации свойственных этим клеткам функций и поддержании их жизнеобеспечения. Так, оксид азота принимает участие в регуляции тонуса гладких мышц сосудов, осуществлении иммунитета, нейромедиации, угнетает агрегацию тромбоцитов, опосредует взаимодействие последних с эндотелиальными клетками и т.д. Изменение уровня NO в тканях и жидкостях организма опосредует действие многих лекарственных препаратов и токсичных веществ как доноров, так и акцепторов этого соединения [1—4].

Синтез NO значительно усиливается под влиянием гормонов, нейромедиаторов, в ответ на действие микроорганизмов, вирусов и других чужеродных агентов. Влияние NO в организме, например, активация гуанилатциклазы, опосредуется через взаимодействие с ионами железа и SH-группами белков и низкомолекулярных лигандов [1, 5]. Согласно гипотезе А. Ванина и др. [6, 7], NO, образовавшийся в клетках, транспортируется через клеточные мембраны наружу и осуществляет физиологическое действие в виде низкомолекулярных нитрозильных комплексов железа с лигандами, вмещающими SH-группы. При этом растрачиваются внутриклеточные фонды восстановленного железа и таких тиоловых соединений, как глутатион или цистеин, которые в условиях гиперпродукции NO могут в значительной мере истощиться. Гиперпродукция NO в организме часто сопровождается усилением образования супероксида О₂^–. Оба эти соединения могут реагировать между собой с образованием пероксинитрита. В нейтральных растворах последний быстро расщепляется с образованием NO₂⁺ NO₂^. и OH^., которые являются наиболее реактивными свободными радикалами, способными вызывать окислительное повреждение не только бактерий, но и собственных клеток и субклеточных структур [8].

Чрезмерное накопление NO в организме играет ведущую роль в развитии ряда патологий: нарушении тонуса и повреждении сосудов, шока, диабета и его осложнений, воспалительных, аутоиммунных и вызванных тканевой несовместимостью заболеваний [9—14]. Оно приводит к угнетению пролиферации и увеличению частоты апоптоза лимфоцитов и макрофагов, а следовательно, развитию вторичных иммунодефицитов [5, 15]. Одним из нежелательных последствий накопления NO в организме является усиление эндогеного синтеза канцерогенных N-нитрозосоединений [16]. Поэтому снижение содержания NO в организме может быть эффективным при лечении указанных патологий. Для достижения такого результата обычно пробуют использовать препараты, которые ингибируют индукцию и активность NO-синтаз, а также эндогенные "ловушки" NO, например, оксигемоглобин. Но эти препараты зачастую токсичны, вызывают побочные эффекты или не приводят к ожидаемым результатам [17, 18]. Учитывая изложенное, представляется особенно перспективным создание лечебных препаратов, которые могли бы конкурировать в организме за связывание NO с гемоглобином, белками, содержащими негемовое железо, а также парные SH-группы и низкомолекулярные железотиоловые комплексы.

В настоящей работе нами на модели нитритной нагрузки у крыс в субхроническом эксперименте исследовано действие трех препаратов, способных связывать оксид азота. Два из них представляют собой железо-серные комплексы — это известное соединение диэтилдитиокарбамат-Fe²⁺ (ДЕТК-Fe²⁺) [19] и созданный нами препарат нитоксидел, которые способны образовывать прочные мононитрозильные комплексы с NO, а также препарат N 3, ковалентно связывающий NO с образованием N-нитрозосоединения, которое не подвергается денитрозированию цитохромом Р-450 и выводится из организма с мочой.

Материалы и методы
Опыты проведены на крысах-самцах массой от 180 до 200 г, содержащихся на стандартном рационе вивария. Животные были разделены на 10 групп: контрольные (1, 2), получавшие внутрижелудочно нитрит натрия в дозе 0.1 ЛД₅₀ или 12 мг/кг массы тела (3, 4); крысы, помимо нитрита натрия получавшие также препарат нитоксидел подкожно в дозе 0.01 ЛД₅₀ или 8 мг/кг массы тела (5, 6), препарат ДЕТКFe²⁺ внутрижелудочно в дозе 120 мг/кг массы тела (7, 8) и препарат N 3 внутрижелудочно в дозе 200 мг/кг массы тела (9, 10) в течение 0,5 и 2 месяцев соответственно. Суточную мочу у крыс собирали с помощью стандартного устройства. После декапитации крыс осуществлялся забор крови и ткани печени. Мочевину, общий гемоглобин, креатинин, аланин- и аспартатаминотрансферазные активности определяли с помощью стандартных наборов "Сhemapol" (Чехия), ацетилхолинэстеразную активность согласно метода Хестрина (20). ЭПР-ные характеристики ткани печени, эритроцитов и плазмы крови получали путем замораживания указанных тканей в жидком азоте в специальных капсулах и последующей регистрации спектров в радиоспектрометре Varian E-109 при температуре 77 К. Оценку показателей производили, измеряя амплитуду ЭПР-сигнала с определенным g-фактором. В качестве внутреннего стандарта использовали рубин, помещенный внутри резонатора и дающий ЭПР-спектр определенной интенсивности в зависимости от условий записи и резонансных свойств исследуемого образца. Результаты выражали в относительных единицах как частное между размахами ЭПР-сигнала образца и стандарта (21). Количество нитритов в среде инкубации клеток определяли с помощью реактива Грисса (22) в нашей модификации метода. Она состоит в том, что определение нитритов проводят в малых объемах растворов в 96-луночном планшете. К 200 мкл исследуемого раствора вносят 20 мкл 1 % раствора сульфаниловой кислоты, через 3 мин. доливают 20 мкл 1 % раствора N-1-нафтилетилендиаминхлорида, спустя 40 мин. проводят фотометрическое измерение. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) определяли в гомогенате печени по образованию малонового диальдегида [23]. Свободные SH-группы крови определяли с помощью дитиобиснитробензойной кислоты [23]. Аллантоин в сыворотке крови, гомогенате печени и моче определяли по образующемуся при кислом гидролизе с 2,4-динитрофенилгидразином гидразону глиоксиловой кислоты [24]. Активности ксантиноксидазы та ксантиндегидрогеназы определяли в цитозольной фракции печени и сыворотке крови методом дифференциальной спектроскопии по образованию мочевой кислоты. Измерения проводили на спектрофотометре Specord M40 при 295 нм по заранее созданной программе (25). Метгемоглобин определяли путем измерения оптического поглощения лизата эритроцитов в областях a и b полос спектра гемоглобина. Белок определяли методом Лоури. Подсчет эритроцитов и лейкоцитов осуществляли на гемоцитометре ГЦМК-3. Результаты исследований подвергнуты статистической обработке [26].

Результаты и обсуждение Из данных, представленных в табл. 1, следует, что внутрижелудочное введение крысам нитрита натрия в дозе 0,1 ld₅₀ в течение 0,5 и 2-х месяцев не приводит к существенным изменениям в величинах биохимических показателей, которые обычно используются для характеристики токсического действия химических соединений. Так, оно не влияет на ацетилхолинестеразную активность мозга, аспартат- и аланинтрансферазную активность и уровень мочевины в сыворотке крови, а также содержание мочевины и креатинина в моче. Не изменяется существенно поведение животных, их общий вес и весовые коэффициенты органов, а также количество лейкоцитов и эритроцитов крови (данные не показаны). Следовательно, нитрит натрия в используемых дозе и сроках введения не вызывает общетоксические проявления.

Нами также не выявлено изменений в величинах сигналов ЭПР, характерных для окисленной формы цитохрома Р-450, уровня железо-серных белков и свободных радикалов в печени крыс, получавших нитрит натрия (табл. 2).

Введение крысам нитрита натрия в течение 0,5 и 2-х мес не приводит к существенному изменению содержания нитритов и нитратов в сыворотке крови и нитратов в моче. Вместе с тем оно приводит к увеличению количества нитратов, выделяемых с мочой, которое через 2 мес. достигает значительной величины. Под влиянием нитрита натрия постепенно возрастает уровень метгемоглобина: через 0,5 мес. наметилась тенденция (на 17 %), а за 2 мес. — на 70 %. На 29 % и 31 % возрастает количество свободных SH-групп в сыворотке крови соответственно за 0,5 и 2 мес. Перекисное окисление липидов в печени в 0,5 мес. опыте увеличивается на 84 %, а через 2 мес. оно снижается, но еще сохраняет тенденцию к увеличению (табл. 3).

Полученные изменения можно считать закономерными для субхронического действия нитрита натрия как агента, который вызывает гемическую гипоксию через увеличение процента метгемоглобина в эритроцитах крови, снижает окислительно-восстановительный потенциал и уровень окисленной формы глутатиона, а также увеличивает содержание восстановленной формы глутатиона в клетках и тканях организма животных [3, 27]. При этом, как видно из данных табл. 4, в крови крыс увеличивается ксантиноксидазная активность, а ксантиндегидрогеназная активность уменьшается. Увеличивается также ксантиноксидазная активность в ткани печени. Такая направленность изменений в ксантиноксидазной и ксантиндегидрогеназной активностях характерна для гипоксических состояний (25). Так как ксантиноксидазная реакция, в отличие от ксантиндегидрогеназной, протекает с образованием супероксидного радикала (25, 28), то при действии нитрита натрия в организме создаются условия для усиления ПОЛ. Одновременно усиливается накопление в ткани печени аллантоина, что указывает на ускорение катаболизма пуринов, конечным продуктом которого этот метаболит является. Нитрит натрия вызывает существенные изменения в содержании фондов таких важных для поддержания гомеостаза белков плазмы крови, как Fe³⁺-трансферрин и Cu²⁺-церулоплазмин. Fe³⁺-трансферрин осуществляет транспорт железа в различные клетки, где обеспечивает функцию железосодержащих белков и ферментов, в частности гемоглобина, цитохромов и других гемовых белков, а также рибонуклеотидредуктазы, катализирующей синтез дезоксирибонуклеотидов. Cu²⁺-церулоплазмин обеспечивает окисление ионов железа и их включение в апотрансферрин, обладает супероксиддисмутазной, пероксидазной и ферроксидазной активностями и поэтому обеспечивает антиоксидантные свойства плазмы крови. Фонд Fe³⁺-трансферрина возрастает на 69 % и 42 %, а Cu²⁺-церулоплазмина снижается на 28 % и 19 % соответственно за 0,5 и 2 месяца получения нитрита натрия (табл. 4). Это можно объяснить тем, что при нитритной нагрузке в крови образуется значительное количество нитрозильных комплексов железа, которые в процессе высвобождения no окисляют железо до трехвалентного состояния, при котором оно присоединяется к трансферрину и увеличивает фонд fe³⁺-трансферрина. Ускорение таким образом окисления fe²⁺ в fe³⁺ как бы дублирует действие церулоплазмина и тем самым, возможно, по принципу обратной связи тормозит его синтез, что и отражается в уменьшении сигнала ЭПР, характерного для церулоплазмина (g=2?05).

Введение крысам препарата нитоксидел и нитрита натрия в течение 0,5 и 2-х месяцев, также как и введение только нитрита натрия, не влияет на ацетилхолинэстеразную активность печени и мозга, аспартат- и аланинаминотрансферазную активность в сыворотке крови, количество лейкоцитов и эритроцитов и содержание гемоглобина в крови. Если нитрит натрия не вызывает существенных изменений в уровнях мочевины и креатинина, то при введении его вместе с нитоксиделом отмечается значительное (около 50 % и 70 % через 0,5 и 2 мес.) снижение концентрации мочевины в сыворотке крови относительно контрольных животных при незначительном увеличении ее концентрации в моче. Наблюдается тенденция к возрастанию креатинина в моче через 0,5 мес и увеличение его содержания на 46 % относительно контрольных животных через 2 мес после введения крысам нитоксидела (табл. 1). Полученные данные указывают на то, что снижение концентрации мочевины в сыворотке крови не связано с нарушением выделительной функции почек и повреждением печеночных клеток. Отсюда можно предположить, что оно обусловлено регулирующим влиянием нитоксидела на скорость синтеза белка и мочевины в организме.

Как и ожидалось, нитоксидел значительно снимает проявления влияния нитрита натрия. Так, он нормализует уровень метгемоглобина и SH-групп крови, скорость ПОЛ, содержание аллантоина в печени и моче, а также фонда Cu²⁺-церулоплазмина в сыворотке крови. Но при этом увеличивается количество фонда Fe³⁺-трансферрина в сыворотке крови как в сравнении с контрольными крысами, так и с теми, которые получали нитрит натрия, что, очевидно, вызвано значительным содержанием железа в препарате (табл. 1—4). Одновременно со снижением ПОЛ нитоксидел вызывает через 0,5 мес. приема снижение величины сигналов ЭПР свободнорадикальных и железо—серных центров печени соответственно на 25 % и 34 %, которое к 2-м месяцам нормализуется (табл. 4). Уменьшение величины этих сигналов ЭПР, представляющих в основном парамагнитные центры убихинон-q-оксидоредуктазного участка и железо-серных белков митохондриальной дыхательной цепи [21], указывает на снижение в последней процессов транспорта электронов. Это может быть причиной снижения образования активных форм кислорода и ПОЛ. Нитоксидел не оказывал существенного влияния на уровень нитритов и нитратов в сыворотке крови, а также количество нитратов, выводимых с мочой у животных, получавших нитрит натрия (табл. 2).

В результате действия нитоксидела суммарная КсО и КсДН активность в сыворотке крови и печени значительно снижается не только относительно животных, получавших нитрит натрия, но и интактных крыс. Это снижение происходит преимущественно за счет более неблагоприятной для организма формы, являющейся источником свободных радикалов, активность которой увеличивается при нитритной нагрузке (табл. 4). Ксантиноксидаза — это сложный фермент, содержащий две молекулы fad, два атома mo и восемь атомов fe, находящихся в составе железо-серных кластеров [28]. Возможно, с этим связано влияние на ее активность нитоксидела, также представляющего собой железо-серное соединение.

Диэтилдитиокарбамат в комплексе с железом (ДЭТК-Fe²⁺) нами выбран как позитивный контроль. Известно [19], что он, поступая в организм, образует комплекс, который в свою очередь способен акцептировать NO. Из данных табл. 1—4 следует, что направленность действия ДЭТК- Fe²⁺ на исследуемые показатели такая же, как и нитоксидела, но в некоторых случаях выражена слабее. Так, ДЭТК-Fe²⁺ нормализует относительно крыс, получавших нитрит натрия, уровень метгемоглобина и интенсивность ПОЛ, увеличивает в моче и снижает, хотя и менее выраженно, в печени содержание аллантоина, в такой же мере увеличивает фонд Fe³⁺-трансферрина и, в еще большей — фонд Cu²⁺-церулоплазмина. Такая же направленность действия ДЭТК- Fe²⁺, как и для нитоксидела, наблюдается в отношении величин сигналов ЭПР свободнорадикальных и железо-серных центров печени, но проявляется она позднее или сохраняется в течение 2 мес. (табл.4). ДЭТК- fe²⁺ , как и нитоксидел вызывает снижение КсО активности в печени и сыворотке крови, увеличивает КсДН активность в печени, но в отличие от нитоксидела не влияет на суммарную активность обеих форм фермента в исследуемых биосубстратах.

Еще один препарат, который может ковалентно связывать оксид азота (преп. N 3), не влияет существенно на используемые общетоксические показатели относительно крыс, получавших нитрит натрия (табл. 1). Он за 2 мес. нормализует уровень метгемоглобина, а также снижает концентрацию нитритов в сыворотке крови на 38 % и 63 % и нитратов в суточной моче на 57 % и 74 % соответственно через 0,5 и 2 мес. (табл.2). Под влиянием преп. n 3 происходят изменения в формах ксантиноксидазы, направленные в сторону снижения КсО, ответственной за выработку супероксидных радикалов, и увеличение КсДН-ной активности. Так, последняя в печени через 0,5 мес. увеличилась на 51% относительно крыс, получавших нитрит натрия, а КсО-дазная активность снизилась в сыворотке крови на 14 % и в печени на 13 % через 2 мес. Снизилось накопление конечного продукта катаболизма пуринов на 30 % и 49 % печени и сыворотке крови, а его содержание возросло на 33 % в моче через 0,5 мес. Через 2 мес. эта тенденция сохранялась (табл.3). Преп. n 3 нормализовал величину фонда cu²⁺-церулоплазмина, сниженную под влиянием нитрита натрия, и не влиял на другие ЭПР-ные характеристики, а также интенсивность ПОЛ (табл.2 и 4).

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что все три исследуемые препарата при введении на фоне нитрита натрия проявляют положительный эффект, ослабляя или устраняя его неблагоприятное действие на организм. Они в той или иной мере противодействуют изменениям в пуриновом обмене, содержании свободных SH-групп в крови, интенсивности ПОЛ, нормализуют уровень метгемоглобина и такие биофизические характеристики, как уровни железо-серных белков и свободных радикалов, Cu²⁺-церулоплазмина и др. показателей, вызванных воздействием нитрита натрия на организм. Это можно объяснить тем, что нитоксидел, ДЭТК- Fe²⁺ и преп. N 3 более или менее эффективно конкурируют с гемоглобином за связывание оксида азота и способствуют выведению его из организма. Исследованные соединения могут оказаться перспективными в качестве лекарств для устранения нитритных интоксикаций и других патологических состояний, сопровождающихся гиперпродукцией оксида азота в организме.

Литература
1. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology// Pharmacol. Rev. —1991. —43, N 1. —P. 109—142.
2. Stamler J.S., Singel D.J., Loscalzo J. Biochemistry of nitric oxide and its redox—activated forms // Science. —1992. —258. —P. 1898—1902.
3. Реутов В.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих //Успехи биологич. химии. —1995.—35. —С. 189—228.
4. Marletta M.A. Nitric Oxide Synthase: Structure and Mechanism // J.Biol. Chem. —1993. —268. — P. 1231.
5. Lancaster J.R., Langrehr J.M., Bergonia H.A., Murase N. EPR detection of heme and nonheme iron—containing protein nitrosylation by nitric oxide during rejection of rat heard allograft // J. Biol. Chem. —1992. —267, N 16. —P. 10994—10998.
6. Vanin A.F. Endothelium—derived relaxing factor is a nitrosyl iron complex with thiol ligands // FEBS LETTERS. —1991. —289, N 1. —P. 1—3.
7. Mulsch A.,Mordvintcev P.I., Vanin A.F., Busse R. Formation and release of dinitrosyl iron complexes by endothelial cells //Biochem. Biophys. Res. Communs. —1993. —196, N 3. —P. 1303—1308.
8. Van der Vliet A. et all. Interactions of peroxynitrite with human plasma and its constituents: oxidative damage and antioxidant depletion// Biochem. J. —1994. —303, N 2. —P. 295—301.
9. Culotta E., Koshland D.E. NO news is good news // Science.—1992.—258.—P1862—1865.
10. Ignaro L. Biological action and properties of endothelium—derived nitric oxide formed and released from artery and vein // Circulation Research. —1989. —65, N 1. —P. 1—21.
11. Thomas M., Thomas W.S. Nitric oxide synthase and cardiovascular signaling // Amer. J. Cardiology. — 1993. —72. —P. 33C—38C.
12. Rees D.D., Cellek S., Palmer R.M.J., Moncada S. Dexamethason prevents the induction by endotoxin of a effects on vascular tone: an insight into endotoxin shock // Biochim. Biophys. Res. Communs. —1990 .—173, N 2. —P. 541—547.
13. Corbett J.A., Lancaster J.R., McDaniel M.L. Interleukin—1b—induced formation of EPR—detectabl iron—nitrosyl complexes in inslets of Langerhans //J. Biol.Chem. —1991. —266, N 32. —P. 21351—21354.
14. Corbett J.A., Sweetlang M.A., Lancaster J.R. Aminoguanidine, a novel inhibitor of NO formation, prevents diabetic vascular disfunction // Diabets. —1992. —41, N 3. —P. 552—556.
15. Sarih M., Souvannavong V., Adam A. Nitric oxide syntase induced macrophage death by apoptosis // Biochim. Biophys. Res. Communs. —1993. — 193, N 3. —P. 503— 507.
16. Tamir S., Tannenbaum S.R. The role of nitric oxide (NO) in carcinogenic process// Biochimica et Biophysica Acta. —1996. —1288. —P. F31—F36.
17. Joseph J.., Kalyanaraman B., James S.H. Trapping of nitric oxide by nitronyl nitroxides an electron spin resonance investigation // Biochem. Biophys. Res. Communs. —1993. —192, N 2. — P. 926—934.
18. Woldman Y.Yu. et all. Spin trapping of nitric oxide by nitronylnitroxides: measurement of the activity of NO syntase from rat cerebellum // Biochem. Biophys. Res. Communs. —1994. —202, N 1. —P. 195—203.
19. Варич В.Я., Ванин А.Ф., Овсянникова Л.М. Обнаружение эндогенной окиси азота в печени мышей методом электронного парамагнитного резонанса// Биофизика. —1987. —32, вып 6. —С. 1062—1063.
20. Hestrin S. The reaction of acetylcholine and other carboxylic derivates with hydroxylamine and its analytical application // J.Biol.Chem. —1949. —180, N 1. —P. 243—249.
21. Ажипа Я.И. Медико—биологические аспекты применения метода ЭПР. —М: Наука, 1983. —528 с.
22. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J.G. Analysis of nitrate, nitrite and 15N—nitrate in biological fluids// Anal.Biochem. —1982. —126, N 1. —P. 131—138.
23. Биохимические, иммунологические и биофизические методы в токсикологическом эксперименте// Метод. рук-во. Сост. Кузьминская У.А., М.Г.Кокаровцева, Л.М.Овсянникова. —Киев, 1989. —184 с.
24. Borchers R. Allantoin determination// Anal. Biochem. —1977. —79, N 2. —P. 612—613.
25. Battelli M., Abboudauza A. Stirpe F. Effects of hypoxia and ethanol on xanthine oxidase// Chem. —Biol. Interact. —1992. —83, N 1.—P. 73—84.
26. Плохинский Н.А. "Биометрия" . —Изд. Московского университета. —1970. —367 с.
27. Опополь Н.И., Добрянская Е.В. Нитраты: гигиенические аспекты проблемы. —Кишинев, 1986. —115 с.
28. Ягнятинская А.М. О биологической роли ксантиоксидазы// Успехи совр. биологии. —1985. —99, вып.1. —С. 38—51.