ВОЗДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ АЗОТИСТОГО ИПРИТА НА КЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ СИГНАЛЬНОЙ ТРАНСДУКЦИИ

А.И. Луйк, д.м.н., С.Е. Могилевич, к.б.н.

Институт биоорганической химии и нефтехимии Национальной академии наук Украины, г.Киев

«Горчичный газ» — ди(b-хлорэтил) сульфид — был применен как один из первых отравляющих газов в войне 1914—1918 гг. в Европе. В 1935 г. K.Ward [1] предложил трис(b-хлорэтил)-амина гидрохлорид (азотистый иприт) в качестве нового вида химического оружия. Производные азотистого иприта, бис(b-хлорэтил) амины, явились основой для создания целого класса средств противораковой химиотерапии. Высокий интерес к биологическим алкилирующим агентам сохраняется благодаря их уникальной мутагенной активности. Следует подчеркнуть, что несмотря на многолетние усилия многочисленных групп исследователей, эффективные антидоты этих ядов так и не были созданы. Поэтому иприты остаются важной проблемой токсикологии независимо от того, насколько они актуальны сегодня как химическое оружие.

Главное внимание при изучении механизмов действия биологических алкилирующих агентов традиционно уделяется их влиянию на геном, сопровождающемуся нарушениями клеточного деления [2].

Вместе с тем, в последние годы, благодаря известным работам Y. Nishizuka et al. [3, 4] стало ясно, что инициация клеточного деления осуществляется Са-мобилизующим полифосфоинозитидным (Ca-PPI) сигнальным каскадом. Этот каскад находится в функциональном единстве с тирозинкиназной системой, воспринимающей сигналы факторов роста [5]. А аденилатциклазная система (АdC), напротив, тормозит пролиферацию и инициирует дифференцировку клеток, находясь таким образом в реципроктных взаимоотношениях с Ca-PPI и тирозинкиназной системой клеточной сигнализации [6-8]. На рис. 1 схематически показаны только основные элементы adc и ca-ppi систем.

Учитывая высокую реакционную способность биологических алкилирующих агентов по отношению к различным биосубстратам, можно было предположить, что наряду со связыванием с ДНК эти вещества могут непосредственно воздействовать и на упомянутые системы сигнальной трансдукции, управляющие как клеточным делением, так и другими функциями клеток. Некоторые экспериментальные и расчетные подтверждения этого предположения представлены в настоящей статье.

В исследованиях использовали бифункциональные производные азотистого иприта (HN2): бис(b-хлорэтил)амин (I), бис(b-хлорэтил)метиламин (II) и бис(b-хлор-этил)мета-толиламин (III).

Изучено взаимодействие этих веществ с рецепторами, активирующими AdC (b-адренергическими), тормозящими AdC (альфа₂-адренергическими, М₂-холинергическими) и активирующими Ca-PPI cистему (альфа₁-адренергическими, М₁-холинергическими и Н₁-гистаминергическими).

Для оценки интегрального влияния алкилирующих агентов на функции AdC и Ca-PPI систем избрана модель подвижности полиморфноядерных лейкоцитов (PML), поскольку известно [9], что эти две сигнальные системы детерминируют регуляцию как спонтанной (хемокинез), так и направленной (хемотаксис) подвижности PML: активация Ca-PPI и(или) угнетение AdC повышают, а обратные воздействия на мессенджерные системы подавляют подвижность клеток. Таким образом, можно заключить, что подвижность PML определяется соотношением активностей AdC и Ca-PPI. Для сравнения на той же модели активной подвижности PML оценивали активаторы бета, альфа₁ и aльфа₂ -адренорецепторов (изопротеренол, фенилэфрин, клонидин), а также блокаторы всех исследованных рецепторов: пропранолол (бета), иохимбин (aльфа₂), празозин (aльфа₁), атропин (М_1,2) и дифенгидрамин (Н₁).

Методы исследования.
Взаимодействие исследуемых веществ с рецепторами поверхностных клеточных мембран изучали общепринятыми радиолигандными методами [10,11]. Используемые клеточные мембраны и маркерные лиганды приведены в табл. 1. Плазматические мембраны кардиомиоцитов, гепатоцитов, клеток коры и стриатума мозга кроликов выделяли [11] и хранили в жидком азоте. Для определения констант ингибирования (ki) связывания маркерных радиолигандов с рецепторами концентрации исследуемых производных азотистого иприта варьировали в диапазоне от 1·10^-4 до 1·10^-8 моль/л. Для изучения кинетического механизма конкуренции алкилирующих агентов с маркерными лигандами применяли обратную постановку эксперимента: при постоянной концентрации исследуемого вещества варьировали концентрацией радиолиганда и анализировали результаты в координатах Скэтчарда.

Активную подвижность PML определяли по методу S. Boyden [12], основанному на способности лейкоцитов проходить через поры ацетатцеллюлозных мембранных фильтров ("Synpor", диаметр пор 2,5 мкм). PML выделяли из крови крыс Wistar методом градиентного центрифугирования. При изучении направленной стимулированной подвижности (хемотаксиса) PML в нижнюю камеру вносили хемоаттрактант formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) в концентрации 1·10^-7 моль/л, которая является максимально эффективной [13]. В экспериментах с ненаправленной миграцией (хемокинез) в нижней камере находилась только гомологичная сыворотка. Концентрация клеток в верхней камере всегда составляла (5—8)·10⁵ мл^-1. Преинкубацию клеток с исследуемым веществом (концентрация 5·10^-6 моль/л) проводили в течении 30 мин. Коклюшный токсин (КТ) вносили в концентрации 5·10^-10 моль/л за 30 мин. до внесения исследуемого вещества (молекулярную массу КТ принимали равной 118 КДа). Время инкубации составляло 2 ч при температуре 37 °С. Подвижность лейкоцитов оценивали, подсчитывая количество клеток, проникших в поры фильтра, в десяти полях зрения микроскопа при 160-кратном увеличении.

Эксперименты in vivo проводили на самках мышей массой 18—22 г. Алкилирующий агент вводили внутримышечно в дозе 3,0 и 5,0 мг на 1 кг массы тела. Исследуемые препараты вводили подкожно за 30 мин до введения алкилирующего агента.

Алкилирующие агенты высокой степени чистоты в виде гидрохлоридов получены из Института фармакологии и токсикологии АМН Украины (г. Киев), маркерные радиолиганды — от фирмы "Amer-sham", фенилэфрин и дифенгидрамин фармацевтической чистоты, изопротеренол, клонидин, пропранолол, иохимбин, празозин, атропин и все прочие реактивы — от фирмы "Sigma".

Результаты и их обсуждение.
Установлено (табл. 1), что ни одно из исследуемых соединений не взаимодействует с b-адренорецепторами в данных условиях эксперимента. Соединение i не взаимодействует и со всеми прочими исследованными рецепторами. Вещество iii обладает выраженной способностью к взаимодействию с рецепторами, активирующими ca-ppi и тормозящими adc системы. Вещество ii взаимодействует с теми же рецепторами, но со сродством примерно на два порядка ниже, чем у метатолильного производного.

Показано, что взаимодействие алкилирующих агентов с рецепторами практически не влияет на константу ассоциации (Кi) маркерных лигандов, а уменьшает число мест их специфического связывания (B_max). На рис. 2 приведены графики Скэтчарда для двух видов рецепторов: М₁-мускариновых и альфа₂-адренергических. Данный факт можно расценивать как свидетельство конкуренции алкилирующих агентов с маркерными лигандами за места связывания с рецепторами.

Опыты с PML позволяют оценить физиологические последствия взаимодействия производных азотистого иприта с рецепторами (табл. 2). В наиболее эффективной концентрации fmlp индуцирует хемотаксис (серия 2), и этот ответ pml полностью блокируется КТ (серия 3). Следовательно, сигнал хемоаттрактанта воспринимается рецепторами клеточной поверхности, которые активируют Са-ppi систему через КТ-чувствительные g-белки. Не может быть, по-видимому, исключено полностью и вовлечение в реализацию сигнала fmlp adc-инги-бирующих КТ- чувствительных ГТФ-связывающих белков (gi-типа) [14].

При отсутствии внешнего сигнала аттрактанта функциональный баланс AdC и Ca-PPI систем PML, скорее всего, не изменяется в зависимости от состоянния КТ-чувствительных G-белков, поскольку токсин не влияет на хемокинез (серия 4).

Вещество I, не взаимодействующее с исследованными рецепторами, практически не влияет ни на хемокинез, ни на хемотаксис (серии 5 и 6). Вещества II и III выраженно угнетают оба вида активной подвижности PML (серии 7, 8, 10, 11). КТ в значительной мере снимает ингибирование хемокинеза веществами II и III. Этот феномен позволяет предположить, что взаимодействие производных азотистого иприта с рецепторами клеточной поверхности приводит к угнетению Ca-PPI и активации AdC системы с участием КТ-чувствительных G-белков. Последнее (участие Gi-белка), а также описанный выше спектр взаимодействия алкилирующих веществ с исследуемыми рецепторами, дает основания считать, что активация AdC в данном случае достигается за счет блокады рецепторов, которые ингибируют эту мессенджерную систему (альфа₂-адренергических, M₂-мускариновых).

Эффекты блокады рассматриваемых рецепторов Ca-PPI и AdC веществами развиваются в отсутствие специфических физиологических агонистов: адреналина, ацетилхолина, гистамина. Это можно рассматривать как проявление феномена внутренней антагонистической активности данных веществ [15]. Эффекты алкилирующих агентов аналогичны действию прочих исследуемых веществ (серии 13—24), блокирующих рецепторы Ca-PPI (празозин, атропин, дифенгидрамин) либо рецепторы отрицательной регуляции AdC (иохимбин, атропин).

Агонист AdC изопротеренол также ингибирует хемотаксис и хемокинез (серии 25, 26). КТ практически не влияет на эффект изопротеренола (серия 27), поскольку коммутация b-адренергических рецепторов с AdC осуществляется КТ-нечувствительными Gs-белками.

Действие, обратное алкилирующим и прочим описанным выше агентам, оказывают вещества, тормозящие AdC (пропранолол, клонидин) и фенилэфрин, активирующий Ca-PPI через альфа₁-адренорецепторы (серии 28—36). Активацию подвижности PML пропранололом, повидимому, следовало бы объяснить внутренним антагонистическим действием вещества на AdC через бета-адренорецепторы. Однако в этом случае трудно объяснить зарегистрированный феномен отмены эффекта пропранолола КТ (серия 30).

Следующие серии экспериментов in vivo предприняты для оценки значимости описанных рецепторных эффектов алкилирующих веществ в реальных условиях их воздействия на целый организм. Показано, что исследуемые вещества рецепторного типа действия существенно влияют на тяжесть и исход интоксикации, вызван-ной смертельными дозами вещества II (табл. 3). Следует отметить, что избранное для этих опытов вещество ii, как установлено (см. табл. 1), взаимодействует с исследуемыми рецепторами со значительно меньшим сродством, чем вещество iii, и в то же время характеризуется значительно более высокой острой токсичностью. Это, в сочетании с характерными для алкилирующих радиомиметических ядов растянутыми сроками гибели животных (с 1 по 7 сутки после аппликации), позволяет считать, что вещество ii более селективно, чем мета-толильное производное, поражает геном. Поэтому установленный факт влияния рецепторных агонистов и антагонистов на выживаемость и продолжительность жизни животных, отравленных веществом ii, представляется весьма показательным.

Установлено, что вещества, которые тормозят Ca-PPI и активируют AdC через рецепторы, усиливают токсическое действие алкилирующего агента (табл. 3). Вещества с обратной направленностью влияния на клеточные сигнальные каскады увеличивают выживаемость и среднюю продолжительность жизни при отравлениях веществом ii. Зарегистрированные эффекты статистически достоверны, хотя, как может показаться, они и не очень велики. Однако, каждый, кто работал с ипритом и его производными, знает, как тяжело повлиять на исход отравлений этими токсическими агентами. Поэтому результаты опытов in vivo, на наш взгляд, свидетельствуют о существенной роли множественных рецепторных взаимодействий алкилирующих агентов в общем механизме их токсического действия. При этом подтверждается вывод о том, что внегеномные эффекты производных азотистого иприта приводят к торможению ca-ppi и активации adc-системы.

Полученные данные хорошо согласуются с развиваемой нами концепцией [14], согласно которой многочисленные вещества, тормозящие проведение сигнала в Ca-PPI и активирующие AdC-систему (главным образом, за счет блокады ее ингибирующего канала), обладают не только многими общими проявлениями физиологической активности, но и рядом сходных признаков молекулярной структуры. Этим, в частности, и определяется множественность точек воздействия такого рода веществ на основные элементы (рецепторы, ключевые ферменты) указанных мессенджерных систем. Такие сходные структурные признаки не могут быть сведены к наличию какого-либо конкретного химического радикала, а носят значительно более общий характер.

Так, ранее [16] с использованием электронно-топологического подхода на достаточно представительной выборке веществ, тормозящих Са-PPI и активирующих AdC, более чем в 80% случаев нами была выявлена сходно организованная группа атомов с характерными значениями зарядов и топологией их расположения в пространстве (рис.3). Данная группа была нами названа электронно-топологическим фармакофором. Основным его элементом является третичный атом азота с большим отрицательным зарядом (-0,35) и небольшими положительными зарядами на присоединенных к нему атомах углерода. Следующая связанная между собой пара атомов (С₆ и С₇), принадлежащая ароматическому кольцу, расположена на расстоянии 7 a от третичного атома азота и несет небольшой отрицательный заряд. С таким же отрицательным зарядом на расстоянии 5,5 a от азота расположен еще один атом углерода (С₄).

Анализируя геометрию и электронное строение исследуемых производных азотистого иприта теми же квантовохимическими методами [14, 16], нетрудно убедиться, что вещество III представляет собой описанный электронно-топологический фармакофор в практически "чистом виде", то есть почти без наслоения каких-либо дополнительных деталей химического строения. Заметим, что данные расчеты проводились с учетом этилениммониевой эндоциклизации, происходящей при проникновении данных алкилирующих соединений в биологическую среду. Вещество II содержит тот же фармакофор в редуцированном виде (без элементов С₆, С₇ и С₄). У вещества I данный фармакофор вообще отсутствует.

С учетом вышеизложенного становится понятным тот факт, что вещество III в наиболее полном виде проявляет свойства, характерные для класса веществ, тормозящих Сa-PPI и активирующих AdC. У вещества II эти свойства менее выражены, а у вещества I — практически отсутствуют.

Заключение.
Приведенные в настоящей статье результаты экспериментальных и расчетных исследований могут быть рассмотрены в двух основных аспектах: с точки зрения специальных проблем токсикологии ипритов и с более широких позиций, касающихся новых подходов к классификации физиологически активных веществ.

В первом аспекте полученные данные позволяют заключить, что наряду с детально изученным поражением ДНК биологические алкилирующие агенты оказывают множественные прямые воздействия на внешнемембранные клеточные рецепторы. Эти воздействия приводят к физиологическим реакциям, которые в наиболее общем виде можно квалифицировать как результат торможения системы Ca-PPI и активации AdC. Нарушение процессов клеточной сигнальной трансдукции сказывается на тяжести и исходе отравления, и этот факт может быть использован при разработке новых средств лечения поражений ипритами.

С другой стороны, полученные данные позволяют предполагать, что широкий круг веществ, оказывающих подобное влияние на главные мессенджерные системы, независимо от основного механизма действия на те или иные рецепторы либо ферменты и несмотря на широкую гетерогенность, имеют элементы структурной общности. При этом тот факт, что вещества с разнонаправленным влиянием на AdC и Ca-PPI системы объединяются в одну и ту же группу, можно объяснить тем, что в большинстве видов клеток эти системы находятся в реципрокных взаимоотношениях [3]. Таким образом, полученные результаты дают основание для дальнейшего изучения вопроса о возможности использования такого показателя, как направленность действия на главные мессенджерные системы, для классификации физиологически

Литература
1. K.Ward. The chlorinated ethylamines — a new type of vesicant // J. Amer. Chem. Soc. —1935. —V. 57. —P. 914—916.
2. P.Brookes. The early history of the biological alkylating agents, 1918 — 1968.// Mutation Research. —1990. — V. 233. —P. 3—14.
3. Y.Nishizuka, Y.Takai, A. Kishimoto. Phospholipid turnover in hormone action // Resent Progress in Hormone Research. —1984. —V. 40. —P. 301—341.
4. Y.Nishizuka. The molecular heterogeneity of PkC and its implicating for cellular regulating.// Nature. —1988. —V. 334. —P. 661—664.
5. T.Mustelin, K.Coggeshall, N.Isakov, A.Altman. T antigen receptor-mediated activation of phospholipase C requires tyrosine phosphorylation // Science. —1990. —V. 247. —P. 1584—1586.
6. S.Ivashita, K. Mitsui, Y.Shoji-Kasai, M.Senshu-Miyaike. cAMP- mediated modulation of signal transduction of epidermal growth factor (EGF) receptor systems in human epidermoid carcino-ma A431 cells // J. Biol. Chem. —1990. —V. 265. —P. 10702—10708.
7. T.Taoka, M.Tokuda, T.Tasaka. Induction of differentiation of HL-60 cells by protein kinase C inhibitor K 252 a // Biochem. Biophys. Res. Commun. —1990. —V. 170. —P. 1151—1156.
8. J.Erikson,I.Gause-Nilsson, P.Lоnnroth, U.Smith. The insulin-like effect of growth hormone on insulin-like growth factor II is opposite by cyclic AMP.// Biochem.J. —1990. —V. 268. —P. 353—357.
9. P.D.Lew. Receptor signaling and intracellular calcium in neutrophil activation.// Eur. J. Clin. Invest.. —1989. —V. 19. —P. 338—346.
10. E.J.Peck, K.L.Kelner. Receptor measurement: in "Handbook of neurochemistry (Second Edition)" (Ed. by Abel Lajtha); New-York, London; Plenum Press; 1982. —V.2 . —P. 53—75.
11. В.В.Мухин, Г.И.Пода, Г.Н.Балденков, А.И.Луйк. Мембранные механизмы действия алкилирующих агентов// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. —1990. —N 4. —C. 351—353.
12. S.Boyden. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antygen on polymorpho-nuclear leukocytes.// J. Exp. Med. —1962. —V. 115. —P. 453—466.
13. Th.Tornowitz, T.Herlin, K.Fogh. Human monocyte and polymorphonuclear leukocyte chemotactic and chemokinetic responses to leukotriene B and fMLP // Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. (Sect. C). —1987. —V. 95. —P. 47—54.
14. В.П.Кухарь, А.И.Луйк, С.Е.Могилевич и др. Химия биорегуляторных процессов. Киев: Наукова думка. —1991. —368 с.
15. C.Taylor. The role of G-proteins in transmembrane signaling // Biochem. J. —1990. —272. —P. 1—13.
16. Г.И.Пода, А.С.Димогло, В.Ю. Танчук, И.В.Тетко, М.И.Кошель, А.И.Луйк. Исследование «структура-активность» физиологически активных веществ, объединенных по общей направленности влияния на клеточную сигнализациюю//Хим.-фарм.ж. —1996. —Т. 30. —С. 29—35.