СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БУПРОФЕЗИНА НА ФУНКЦИЮ ГОНАД И ФЕРТИЛЬНОСТЬ КРЫС WISTAR

Н.Р. Шепельская, к.м.н

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя МЗ Украины, Киев

Введение
Целью настоящих исследований являлось изучение гонадотоксической активности действующего вещества пестицидного препарата апплауда — бупрофезина.

Исследования были проведены по заказу японской фирмы Nihon-Nohyaku Company Limited, являющейся единственным производителем бупрофезина и его препаративных форм. Необходимость в проведении указанных исследований возникла в связи с предложением этого препарата на рынок Украины. Тщательный анализ представленных фирмой материалов о репродуктивной токсичности технического бупрофезина не позволил нам согласиться с заключением специалистов фирмы о том, что в проведенных фирмой экспериментах были определены недействующие дозовые уровни по репродуктивной токсичности. Как известно, отсутствие экспериментально установленной недействующей дозы лишает возможности определения потенциальной опасности и оценки риска пестицидных препаратов для здоровья человека [2]. В результате длительной научной дискуссии фирма вынуждена была согласиться с обоснованностью наших аргументов, касающихся интерпретации и трактовки представленных токсикологических данных, и обратилась с предложением о проведении дополнительных экспериментальных исследований по выявлению недействующего уровня бупрофезина на гонады и репродуктивную функцию.

Исследования гонадотоксичности технического бупрофезина выполнены на 400 крысах Вистар обоего пола. В экспериментах использованы методические подходы, отвечающие требованиям "Методических указаний по гигиенической оценке новых пестицидов" [1], а также современным международным требованиям, принятым в такого рода исследованиях.

Бупрофезин вводился внутрижелудочно с помощью зонда. Дозовые уровни и методические подходы были выбраны с учетом результатов изучения репродуктивной токсичности бупрофезина на 3-х поколениях крыс, представленных фирмой Нихон Нояку.

Исследования проводились в лаборатории канцерогенеза, тератогенеза и токсикологии репродуктивной функциии института Экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя МЗ Украины.

Бупрофезин технический (Lot N 2 AD 0004Р) был предоставлен фирмой Nihon-Nohyaku Company Limited однократно на весь курс исследований в количестве 500 г:

Название:Бупрофезин технический
Чистота :99 %
Назначение: инсектицид
Внешний вид :порошок серого цвета
Хранение:воздухо- и светонепроницаемый контейнер,
при температуре не выше 20 °С

Документация на методы синтеза изучаемого соединения и методы определения представленного образца, его состав, химическую идентичность, чистоту, стабильность и другие параметры, необходимые для его характеристики, принадлежит спонсору (ф. Nihon-Nohyaku Company Limited), который несет за нее полную ответственность.

Перед началом эксперимента 50,0 г изучаемого вещества было отобрано в плотно закупоренную стеклянную емкость и хранилось в тех же условиях, что и основная масса изучаемого соединения. Эта навеска хранится в архиве лаборатории.

Материалы и методы
Схема эксперимента. Подопытные самцы крыс Вистар получали бупрофезин ежедневно, внутрижелудочно с помощью зонда в течение 12 недель. По окончании запланированного периода затравки часть подопытных самцов использовалась для изучения морфо-функциональных показателей, а оставшиеся животные спаривались с интактными самками. На 20-й день беременности самки умерщвлялись и у них определялись показатели, характеризующие репродуктивную функцию.

Подопытные самки подвергались воздействию бупрофезина в течение 9 недель. На протяжении последних 2-х недель периода затравки у самок изучали гормональный статус, определяя цикличность и продолжительность эстрального цикла. По окончании затравки подопытные самки спаривались с интактными самцами. На 20-й день беременности самки умерщвлялись и у них регистрировались показатели, характеризующие состояние функции воспроизводства.

Все животные, вскрывавшиеся в ходе эксперимента, подвергались тщательному макроскопическому исследованию. У 10 самцов и самок из каждой группы определялись коэффициенты относительной массы органов и проводились гистологические исследования гонад.

Животные. Крысята-отъемыши (самцы и самки) были получены из питомника мелких животных "Аидма" ЛТД.

Для изучения гонадотоксической активности бупрофезина при воздействии на самцов была получена партия животных из 100 самцов и 100 самок массой от 120 до 130 г для самцов и от 110 до 120 г для самок.

Вторая партия животных, предназначенных для эксперимента по изучению гонадотоксической активности бупрофезина у самок, состояла также из 200 крыс массой от 115 до 130 г для самцов и от 110 до 125 г для самок.

18 дней у самцов и 25 дней у самок продолжался адаптационный период, в течение которого животные адаптировались к новым условиям и переходили на рацион вивария института. Полученные животные были распределены по клеткам, за ними осуществлялось ежедневное наблюдение. При наличии признаков какой-либо патологии или значительном отклонении от средней массы животные выбраковывались. Каждому животному был присвоен индивидуальный номер. Перед началом воздействия масса тела самцов составляла 153-160 г, самок — 143—147 г.

Условия содержания животных. Животные были размещены в специально оборудованном помещении, доступ в которое был ограничен.

Комната была обеспечена принудительной вентиляцией (12 объемов в час), исключающей рециркуляцию воздуха. Температура и относительная влажность воздуха регистрировались ежедневно, колебания температуры составляли от 20 до 25 °С, влажности — от 40 до 70 %. Освещение было естественным.Животные получали питьевую воду без ограничения из стеклянных бутылок объемом 0,5 литра через стеклянные наконечники.

На протяжении всего эксперимента крысы получали ad libitum сбалансированный корм, содержащий все необходимые компоненты и составленный в соответствии с нормами, установленными Приказом МЗ СССР N 1179 от 10.10.1988 года.

В различные стадии эксперимента максимальное количество крыс в одной клетке было:

Стадии исследованияКоличество животных
самцысамки
1) Период адаптации55
2) Затравка55
3) Изучение функциональных
показателей состояния гонад
55
4) Спаривание55
5) Самки до 20 дня беременности  3

Затравка препаратом. Путь введения и продолжительность. Изучаемое соединение вводилось экспериментальным животным в виде свежеприготовленной водной суспензии ежедневно, кроме субботы и воскресенья, внутрижелудочно с помощью зонда в течение 12 недель самцам и 9 недель самкам.

4 группы животных, состоящие из одной контрольной группы и трех подопытных групп самцов и самок, получали соединение в следующих дозах:

N
групп
ПрепаратДозовый уровень
мг/кг м. тела
К-во животных
самцысамки
1Контроль02525
2Бупрофезин тех0,012525
3Бупрофезин тех2525
4Бупрофезин тех1,02525

Параллельно с контрольными и подопытными животными содержались интактные самцы (100) и самки (100), предназначенные для спаривания. Интактные животные были также распределены по группам и промаркированы.

Приготовление вводимого раствора и введение. Раствор для введения готовился ежедневно ex temроrе в концентрациях:

1 гр. — 0 % бупрофезина
2 гр. — 0,0001 % бупрофезина
3 гр. — 0,001 % бупрофезина
4 гр — 0,01 % бупрофезина

Введение осуществлялось с помощью зонда из нержавеющей стали с оливой на конце.

Исследуемые показатели. Все животные на протяжении всего периода исследования ежедневно обследовались с целью регистрации каких-либо видимых признаков реакции на воздействие изучаемого соединения. Погибшие животные или животные, которые были умерщвлены in extrеmis, вскрывались и подвергались тщательному макроскопическому анализу внутренних органов. Подопытные самцы взвешивались еженедельно в течение всего периода затравки. Подопытные самки взвешивались еженедельно до периода спаривания и на 0, 6, 13 и 20 дни роst соitum.

Интактные самцы взвешивались 2 раза в месяц, интактные самки — еженедельно. В течение последних 2-х недель периода затравки у подопытных самок ежедневно делали вагинальные мазки с целью определения продолжительности всего эстрального цикла, частоты и длительности его отдельных стадий.

Мазки также делали с первого дня подсаживания интактных самцов к подопытным самкам и подопытных самцов к интактным самкам для определения момента спаривания.

По окончании запланированного периода затравки из каждой подопытной группы в произвольном порядке отбирались по 10 самцов, которые подвергались исследованию морфо-функционального состояния гонад (общее количество, количество подвижных, неподвижных, патологических форм сперматозоидов, продолжительность двигательной активности спермиев).

Оставшиеся 15 подопытных самцов из каждой группы спаривались с интактными самками, а подопытные самки — с интактными самцами. Каждое утро на протяжении периода спаривания готовились вагинальные мазки для каждой самки, которые исследовались на наличие сперматозоидов. День обнаружения спермиев в вагинальном содержимом самки принимался за 0 день беременности.

Определяли время, прошедшее от момента подсаживания самцов к самкам до момента установления факта оплодотворения (длительность прекоитального периода).

На 20-й день беременности интактных самок, спаренных с подопытными самцами и подопытных самок, забеременевших от интактных самцов, умерщвляли, вскрывали брюшную полость, извлекали и вскрывали матку, затем подсчитывали и регистрировали для каждой самки:

а) общее количество желтых тел в яичниках;
б) количество мест имплантации;
в) количество резорбированных зародышей и плодов;
г) количество мертвых плодов;
д) количество живых плодов;
е) наличие грубых аномалий развития у плодов;
ж) среднюю массу плодов.

Умерщвление животных осуществлялось путем помещения их в камеру с парами диэтилового эфира для наркоза.

Для оценки репродуктивной функции животных определяли индексы спаривания, зачатия, беременности и фертильности.

Все подопытные самцы и самки, вскрывавшиеся в ходе эксперимента, а также животные, найденные мертвыми, подвергались макроскопическому обследованию.

Внутренние органы 10 самок и 10 самцов из каждой группы выделялись и взвешивались. Семенники и яичники от десяти контрольных и подопытных самок и самцов каждой группы подвергались дальнейшему гистологическому изучению.

Статистическая значимость межгрупповых различий оценивалась по критерию t - теста Стьюдента.

Результаты
Самцы. Бупрофезин технический ни в одной из испытанных доз не оказывал влияния на общее состояние подопытных самцов, не вызывал смертности животных и не оказывал влияния на прирост массы тела.

Макроскопическое обследование семенников и придатков не обнаружило видимой патологии этих органов.

У животных, подвергавшихся воздействию бупрофезина в минимальной и средней дозе, не обнаружено отличий в абсолютной и относительной массе семенников и придатков по сравнению с контролем. У самцов 4 группы статистически достоверно уменьшалась абсолютная и относительная масса придатков семенников.

Бупрофезин технический не оказал отрицательного влияния на такой показатель, как общее количество сперматозоидов. Вместе с тем имелась тенденция к снижению относительного количества (процента) подвижных спермиев. В группе самцов, получавших максимальную дозу препарата, это снижение достигло уровня достоверности. Процент патологических форм сперматозоидов у подопытных животных достоверно не отличался от контроля (табл. 1).

Подавляющее большинство интактных самок во всех группах было покрыто подопытными самцами в первую же стадию эструса.

Значение величины прекоитального интервала в 3-й и 4-й подопытных группах было ниже,чем в контроле, во 2-й группе — на уровне контроля (табл. 1).

Оплодотворяющая способность самцов и их плодовитость, о которых судили по индексам зачатия и фертильности интактных самок, не изменялись под влиянием тестируемого соединения.

Количество живых плодов во 2-й и 3-й подопытных группах было на уровне контроля. Общая эмбриональная смертность в этих группах также достоверно не отличалась от контроля. Несколько снижалось число живых плодов и повышалась величина общей эмбриональной смертности в 4-й группе, однако эти отклонения не достигали статистически значимого уровня (табл.2).

Масса тела плодов изменялась в пределах физиологических колебаний и достоверно не отличалась от контроля во всех подопытных группах.

Гистологическая оценка семенников контрольных самцов и животных, получавших бупрофезин, не выявила изменений, которые могли бы быть связаны с воздействием тестируемого соединения.

Самки. Бупрофезин технический не оказал влияния на общее состояние самок, получавших минимальную и среднюю дозу препарата. В этих двух группах и в контроле не наблюдалось гибели животных. В группе самок, получавших бупрофезин в максимальной дозе (1 мг/кг), было зафиксировано 4 случая гибели животных. Две самки погибли на 8 неделе периода воздействия, две другие — на 9. Макроскопическое обследование при вскрытии показало наличие признаков интеркуррентной инфекции у погибших животных.

Бупрофезин технический не оказал влияния на массу тела самок, получавших минимальную дозу препарата (0,01 мг/кг). В группе самок, подвергавшихся воздействию средней дозы, с 6-й недели затравки наметилась тенденция к снижению массы тела животных, которая достигла уровня достоверности на 6-й и 7-й неделях введения препарата. В 4-й группе у подопытных самок статистически достоверное снижение массы тела наблюдалось с 4-й недели затравки до окончания периода воздействия.

В нулевой день беременности у самок 3-й и 4-й групп сохранялась тенденция к снижению массы тела по сравнению с контролем. В 4-й группе это отличие было статистически достоверным. К 20-му дню беременности масса тела животных всех групп практически не отличалась от контроля. У самок 4 группы статистически достоверно уменьшается абсолютная масса яичников.

В течение 2-х недельного периода наблюдения за гормональным статусом у самок всех групп не отмечалось значительных отклонений в частоте и продолжительности эстрального цикла и каждой его стадии. Большинство подопытных самок спарилось с интактными самцами в первую же стадию эструса.

Способность к зачатию у самок всех подопытных групп практически была одинаковой. Индекс беременности изменился только при воздействии препарата в дозе 1 мг/кг, у самок этой же группы несколько снижается индекс фертильности (табл. 3).

Величина длительности прекоитального периода во всех группах находилась в пределах физиологических колебаний и достоверно не отличалась от контроля (табл. 3).

Во всех группах подопытных самок, получавших бупрофезин, наблюдалась тенденция к снижению количества желтых тел в яичниках, достигающая статистически достоверного уровня в четвертой группе (1 мг/кг).

В этой же группе самок статистически достоверно уменьшилось количество живых плодов в помете, что отчасти связано также с повышением относительного количества (%) погибших до имплантации зародышей.

Во всех подопытных группах средняя масса тела плодов несколько выше контрольного уровня, хотя и статистически недостоверно, что связано с некоторым уменьшением количества живых плодов в группах самок, получавших бупрофезин (табл. 3).

При макроскопическом обследовании беременных самок, умерщвленных в конце эксперимента, никаких изменений, связанных с воздействием, не выявлено. Гистологическая оценка яичников контрольных самок и самок, получавших бупрофезин, не выявила изменений, которые могли бы быть связаны с воздействием тестируемого соединения.

Выводы
1. На основании проведенных исследований можно сделать заключение о том, что бупрофезин технический при ежедневном внутрижелудочном введении в течение 12 недель до спаривания оказывает минимальный антиандрогенный эффект у самцов в дозе 1 мг/кг массы тела, проявляющийся снижением абсолютной и относительной массы придатков семенников и уменьшением количества подвижных сперматозоидов. Однако изменения этих показателей не отражаются на репродуктивной способности самцов.

2. Самки оказались более чувствительными к изучаемому соединению. В дозе 1 мг/кг массы тела бупрофезин оказывает как общетоксический, так и гонадотоксический эффект. Начиная с 4-й недели и до окончания периода затравки у самок наблюдается достоверное снижение прироста массы тела. Отмечено 4 случая гибели животных, что, по-видимому, можно рассматривать как результат снижения сопротивляемости организма к интеркуррентной инфекции под влиянием вводимого препарата.

Статистически достоверно уменьшается количество желтых тел в яичниках и число живых плодов в помете. Снижается абсолютная масса яичников по сравнению с контролем. Уменьшаются индексы беременности и фертильности.

3. В диапазоне изученных доз наблюдается зависимость "доза-эффект". В дозах 0,1 и 0,01 мг/кг массы тела препарат не оказал влияния на гонады и фертильность самок и самцов.

4. В условиях проведенного эксперимента недействующей дозой по гонадотоксическому эффекту является доза 0,1 мг/кг массы тела. Эта величина оказалась лимитирующей при изучении токсикологических параметров бупрофезина.

5. Результаты, полученные в эксперименте, позволили обосновать токсиколого-гигиенические регламенты применения препарата.

ЛИТЕРАТУРА
1. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. —Киев. —1988. —С. 55—67.
2. Principles for evaluating health risks to progeny associated with exposure to chemicals during pregnancy // Environmental health criteria 30. —1984. —P. 155.


| Содержание |