|
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ УДК 615.357.631:577.611.657 МЕХАНИЗМЫ ГЕНОТОКСИЧНОСТИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ Е.Л. Левицкий, д.б.н., А.Н. Марченко к.б.н., Ю.И. Губский, д.м.н., чл. кор. АМН Украины Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, г. Киев Охрана окружающей среды по своей значимости и масштабности представляет собой одну из наиболее актуальных задач современности. Одним из важных вопросов этой проблемы является загрязнение биосферы мутагенными факторами, обусловливающими целый ряд неблагоприятных генетических последствий [1]. В последние годы отмечается резкое возрастание удельного веса наследственной патологии и болезней с несомненной генетической компонентой в общей структуре заболеваний населения, что связано с постоянным ухудшением экологической ситуации. В силу данных обстоятельств поиск и разработка лекарственных средств защиты ядерного генетического аппарата человека от повреждающих факторов является одной из наиболее важных медицинских и социальных задач, стоящих перед современной наукой. Ее решение неразрывно связано с пониманием молекулярных механизмов их генотоксического действия, проявляющимся на различных этапах реализации генетической информации. До недавнего времени наиболее изученным мутагенным фактором была радиация. Однако помимо радиации человек сталкивается со множеством химических соединений (ХС), широко применяемых в промышленности, сельском хозяйстве,медицине и быту. Рост химической промышленности во всех странах приводит к постоянному увеличению частоты контактов человека с чужеродными ксенобиотиками. Достоверно установлено, что многие ХС обладают мутагенным действием, не уступающим ионизирующей радиации, а некоторые превосходят ее в десятки раз [2]. Потенциальная опасность многих химических мутагенов отягощается тем обстоятельством, что как и для радиационного воздействия, предельно допустимой дозы (концентрации) для них не существует, т.е. порог действия практически отсутствует [3, 4]. Кроме того, в окружающей среде присутствует значительное количество токсических веществ, по-видимому, неспособных вызывать мутации, однако существенно усиливающих генотоксическую активность других ХС [1, 3]. Особое место среди ксенобиотиков, присутствующих в биосфере, по праву отводится пестицидам. Если попадание в окружающую среду разнообразных по структуре и биологической активности ХС является, как правило, незапланированным и крайне нежелательным, то внесение в среду пестицидов, применяемых главным образом для защиты сельскохозяйственных культур от насекомых-вредителей, является одним из этапов агротехнической деятельности человека. В анализе токсического действия пестицидов особое место занимает влияние на генетический аппарат, ибо многочисленные данные литературы свидетельствуют, что именно клеточное ядро является вероятной мишенью их действия [2, 5, 6]. Многие пестициды и их метаболиты, проникая в клеточное ядро, изменяют структурно-функциональную организацию ядерного генома. Отмечено, что пестициды вызывают увеличение частоты генных, хромосомных аберраций и обмена сестринских хроматид, биотрансформацию эмбриональных клеток, внеплановый синтез, а также нарушение синтеза, репликации и транскрипции ДНК, синтеза РНК, изменяют работу ферментных систем, приводят к появлению одно- и двунитевых разрывов ДНК, образованию сшивок ДНК-ДНК, ДНК-белок, окислительной модификации оснований, угнетают репаративные системы клетки и т.д. Экспериментально доказано, что лиганд-опосредованный механизм взаимодействия ксенобиотиков определяет и регуляцию специфической транскрипции определенного набора генов, что дает логическое обоснование и объяснение чувствительности тканей к пестицид-индуцированному воздействию [7]. К числу наиболее широко используемых в сельском хозяйстве пестицидов относятся фосфорорганические соединения (ФОС). Данные литературы свидетельствуют, что соединения этого класса обладают в той или иной мере генотоксическим действием и способны вызывать мутации в различных биообъектах, проявляя активность в большинстве используемых тестов [5, 8]. Так, производство и применение, до недавнего времени считающегося безвредным для теплокровных животных и человека хлорофоса (ХФ) (синонимы — трихорфон, дилон, негувон, дирекс, метрифонат и др.), широко используемого ранее без учета возможных отдаленных последствий, запрещено. Накоплен значительный материал о мутагенной активности данного соединения [8, 9, 10]. Особый интерес представляют данные, полученные в опытах на высших животных и наблюдения за людьми, т.к. установление факта мутагенного действия на микроорганизмах, дрожжах, растениях и насекомых может лишь косвенно указывать на наличие потенциальной опасности для человека. Способность ХФ индуцировать сестринские хроматидные обмены в клетках китайского хомячка без метаболической активации продемонстрированна в работах H.Chen и соавт. [11]. Показано, что метаболическая активация способствовала индуцирующему влиянию ХФ. Генотоксическое действие ХФ при остром отравлении наблюдается в виде нарушений ДНК-синтезирующей активности в семенниках, нарушений хромосом и патологических митозов в клетках костного мозга мышей [9]. Данные изучения цитогенотоксической активности ХФ на культуре фибробластов эмбриона человека указывают, что с повышением дозы значительно увеличивается число митозов за счет нарастания К-метафаз. При низких дозах увеличивается количество мостов и отставание хромосом в метакинезе и при расхождении их к полюсам [7]. Цитогенетическое изучение культуры клеток периферической крови лиц, работающих в производстве таких ФОС, как хлорофос, диазинон и имидан, свидетельствует о достоверном увеличении частоты хромосомных аберраций в исследуемой группе по сравнению с контрольной [10]. Обследование лиц сельскохозяйственных районов, специализирующихся на садоводстве и виноградарстве, имеющих постоянный контакт с фосфорорганическими пестицидами, и в частности ХФ, показало, что количество клеток с хромосомными нарушениями колеблется от 4,0 до 11 %, в то время как в контрольной группе этот показатель не превышает 2,0 % [9]. В ряде публикаций отмечено, что ХФ вызывает кластогенный эффект в лимфоцитах периферической крови рабочих, занятых его производством, повышение частоты спонтанных абортов у женщин, имеющих контакт с ним, и врожденных пороков развития у детей, чьи родители имели профессиональный контакт с пестицидами данной группы [10]. Отмечается значительный выход хромосомных нарушений при действии ХФ в больших дозах, при этом значительно повышается частота доминантных мутаций на стадии сперматозоидов [9]. Анализ данных литературы указывает на способность ХФ оказывать воздействие на состояние гонад, эмбриогенез, развитие потомства лабораторных животных, канцерогенез [9]. Таким образом, представленные данные позволяют постулировать наличие у ФОС генотоксической активности. Для более полного изучения ее механизмов нами были проведены исследования влияния отравления одним из представителей ФОС — хлорофосом на структурно-функциональную организацию ядерного хроматина печени крыс. В последнее время возрос интерес к внутриядерным липидам. Он обусловлен их участием как в структурной упаковке ядерного хроматина, так и в регуляции его функциональной активности. Показано, что липиды играют важную структурную роль в организации надмолекулярных комплексов ДНК [12], принимают участие в формировании ее четвертичной структуры. Качественный и количественный состав ДНК-связанных липидов существенно изменяется в зависимости от активности генома и стадии клеточного цикла, а также при переходе от суперспирализованной к релаксированной ДНК. Внутриядерные липиды играют важную роль в регуляции генной экспрессии наряду с негистоновыми белками. Так, фосфолипиды принимают активное участие в репликации и транскрипции как на стадии изменения структуры ДНК-матрицы, так и энзиматической модификации РНК- и ДНК-полимераз. Установлено, что кислые фосфолипиды (фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, кардиолипин) деконденсируют хроматин и активируют РНК-полимеразу, тогда как нейтральные фосфолипиды (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, сфингомиелин) оказывают обратный эффект . Показано, что сфингомиелин активирует, а продукты его ферментативного гидролиза (сфингозин и холин) ингибируют энзиматическое метилирование ДНК, а также то, что значительное обогащение ДНК диглицеридами, свободными жирными кислотами и кардиолипином имеет важное значение, т.к. эти липиды активируют протеинкиназу С, которая осуществляет необходимый для репликации процесс фосфорилирования ДНК-полимеразы и других ядерных регуляторных белков (РНК-полимеразы, ДНК-топоизомеразы II). В связи с тем, что кардиолипин принимает активное участие в активации репликационного белка dna A, а также стимулирует ДНК полимеразу II и ДНК- полимеразу III, предполагают его вхождение в состав реплисом. Обнаружена обратная корреляционная связь между количеством липидов в матрице ДНК и уровнем транскрипции [13]. Особое внимание уделяется роли липидов ядерного генома в связи с их участием в реакциях свободнорадикального окисления, в первую очередь, в реакциях перекисного окисления липидов (ПОЛ). О значительной роли свободных радикалов различной химической природы (кислорода, азотистых оснований, липидов и др.) в повреждении ядерного генома указывает целый ряд работ [14, 15]. Показано, что свободные радикалы вызывают несколько типов повреждений ДНК: одно- и двунитевые разрывы цепей, образование сшивок ДНК-белок, окислительные модификации оснований. При этом стоит отметить, что однонитевые разрывы, возникающие на одной из цепей ДНК, являются репарируемым типом повреждений. Обычно это самый распространенный тип повреждения ДНК. Двунитевые разрывы происходят редко и обычно при большой дозе повреждающего фактора или при длительном его воздействии. Только часть этих повреждений является репарируемыми, вследствие чего наличие этого типа повреждений ДНК в хроматине обычно коррелирует с гибелью клетки . Сшивки ДНК-белок в хроматине возникают при одновременном повреждении молекулы ДНК и белка. Повреждения такого типа частично репарируются ,т.к. процесс репарации требует одновременного удаления участка ДНК и молекулы белка с последующей их заменой на вновь синтезированые компоненты хроматина. При усилении процессов ПОЛ происходит необратимое окисление SH-групп белков , что, соответственно, ведет к нарушению их функции и всего хроматина в целом. Активация процессов ПОЛ может приводить к образованию поперечных белковых сшивок и ковалентно связанных белковых полимеров [16]. Поперечносшивающими свойствами обладают вторичные продукты ПОЛ, в том числе и МДА. Способностью образовывать ковалентно связанные белковые полимеры обладают свободные радикалы липидов [16, 17]. Изменение физико-химических свойств липидного компонента хроматина (состава, текучести, заряда и др.), обусловленное усилением процессов ПОЛ, влияет на полярные и гидрофобные белок-липидные и ДНК-липидные связи, конформацию белка, доступность белка и ДНК для различных ферментов. До недавнего времени инициация перекисного окисления липидов в результате действия разнообразных факторов констатировали только в биомембранах. При этом упускалось из виду, что сам хроматин содержит собственные липиды. В настоящее время установлено, что ядерный геном обладает собственной системой переокисления хроматин-связанных липидов [18, 19]. Отмечено, что по ряду характеристик (отношение к индукторам и ингибиторам, временная кинетика накопления конечных продуктов и др.) процессы липопереокисления в хроматине существенно отличаются от таковых, происходящих в мембранах эндоплазматического ретикулума клеток печени [19]. В настоящее время ПОЛ хроматина рассматривается в качестве одного из ведущих механизмов повреждения ядерного генетического аппарата. Свободнорадикальная природа повреждений хроматина доказана в результате изучения действия на него ионизирующей радиации, ионов тяжелых металлов и хлорорганических соединений. Что касается эффектов других факторов, в частности ФОС, широко применяемых в различных отраслях сельского хозяйства и вносящих значительный вклад в загрязнение окружающей среды, то роль модификации реакций липопереокисления в механизме их генотоксического действия была изучена намного хуже. В результате исследований, проведенных в условиях влияния хлорофоса, взятого как модельный препарат ФОС, на ядерной хроматин печени крыс в опытах in vivo и in vitro, были выявлены некоторые молекулярные механизмы повреждения ядерного генома этим ядом. Показано, что острое отравление животных ХФ в дозе 1 ЛД50 приводит к выраженной модификации интенсивности перекисного окисления хроматин-связанных липидов. Первоначально изменения ПОЛ обнаруживают во фракции транскрипционно активного хроматина (ТАХ). Так, в ней уже через 10 мин. после введения яда наблюдается рост интенсивности реакций НАДФН-зависимого и спонтанного ПОЛ. С увеличением времени после отравления степень модификации ПОЛ в хроматине возрастает. Теперь уже изменения отмечаются и в репрессированнам хроматине (РХ). Так, в нем через 2 ч после введения ХФ интенсивность реакций НАДФН- и аскорбатзависимого переокисления значительно выше по сравнению с контролем. Модификация процессов липопереокисления в хроматине приводит к нарушению его структурно-функциональной организации, наиболее выраженной через 24 ч после отравления. Под влиянием яда снижается интенсивность синтеза ДНК и увеличивается транскрипционная активность в ТАХ, что сопровождается увеличением включения 14С-лейцина в белки РХ. Подобные нарушения функциональной активности хроматина под влиянием ХФ хорошо коррелируют с изменением активности ферментов синтеза ДНК и РНК-ДНК- и РНК-полимераз. Так, в ТАХ через 10 мин после отравления отмечается снижение татальной ДНК-полимеразной активности, происходящей за счет уменьшения активности репликационной ДНК-полимеразы альфа и репаративной ДНК-полимеразы бета. Увеличение транскрипционной активности ТАХ обусловлено ростом активности РНК-полимеразы I, ответственной за синтез рибосомальной РНК в хроматине. В РХ через 2 ч после введения животным яда обнаружены разнонаправленные изменения активности эндогенных РНК-полимераз: увеличение — для РНК-полимеразы I и снижение — для РНК-полимеразы II, в результате чего суммарная РНК-полимеразная активность в этой фракции хроматина несколько увеличивается. Аналогичная взаимосвязь активации процессов ПОЛ во фракциях ядерного хроматина с изменением в них активности ДНК- и РНК-полимераз была ранее показана в работах Ю.И. Губского и Е.Л. Левицкого при изучении свободнорадикальных механизмов повреждения ядерного генетического аппарата хлорорганическим соединением тетрахлорметаном [19]. Полученные результаты также согласуются с приведенными выше данными о влиянии внутриядерных липидов на функциональную активность ядерного генома. В основе перекисной модификации функций хроматина, вызванной отравлением ХФ, могут лежать нарушения структуры его интегральных компонентов: ДНК, белков, липидов. Особый интерес в данном случае представляет повреждение ДНК, являющейся носителем генетической информации. Результаты нуклеазного зондирования фракций хроматина эндо- и экзогенными ДНКазами через 24 ч после введения яда экспериментальным животным свидетельствует о том, что ДНК обеих фракций отравленных животных отличается по чувствительности к расщеплению как эндо-, так и экзогенными нуклеазами по сравнению с контролем. Так, в условиях отравления ДНК ТАХ расщепляется эндогенными ДНКазами хроматина в 1,5 раза менее интенсивно по сравнению с контролем. Менее чувствительной оказывается ДНК ТАХ и в условиях переваривания экзогенными ДНКазами. Так, кратковременное переваривание ДНКазой I при комнатной температуре расщепляет 10,5 % ДНК печени контрольных животных и не приводит к появлению кислоторастворимой радиоактивности ДНК у отравленных. В условиях более жесткого переваривания ДНКазой I степень переваривания ДНК ТАХ увеличивается и не отличается у контрольных и отравленных животных. Сравнивая эти результаты, можно сделать вывод о том, что в данном случае подобная "компактизация" структуры ДНК ТАХ в условиях отравления не имеет жестких структурных ограничений и, вероятно, обусловлена либо незначительной суперспирализацией нуклеосомной (линкерной) ДНК, либо образованием сшивок ДНК-белок. Подобное предположение подтвердилось результатами, полученными при изучении расщепления ДНК ТАХ S1-нуклеазой, избирательно переваривающей однонитевые участки ДНК. В условиях отравления количество этих участков снижается по сравнению с контролем как в нативной, так и в денатурированной ДНК. Если в первом случае фактор повышения спирализации может вносить свой вклад в повышение степени устойчивости ДНК ТАХ отравленных животных к ферменту, то в условиях денатурации, приводящей к изчезновению вторичной структуры, имеет значение только количество сшивок ДНК-белок. Тем не менее, в компактизации структуры ДНК ТАХ отравленных животных, по-видимому, участвуют оба эти фактора, о чем свидетельствует меньшая величина различий в устойчивости к расщеплению S1-нуклеазой между контрольными и опытными образцами в условиях денатурации и без нее (4,4 и 5,3 раза соответственно), хотя вклад увеличения суперспирализации в этот процесс оказывается незначительным. Что касается фракции РХ, то, наоборот, отравление животных ХФ приводит к релаксации структуры ДНК этой фракции. Причем здесь, во-первых, различия между контрольной и опытной группой животных не столь очевидны, как в случае ТАХ, во-вторых, они обусловлены, по всей вероятности, ослаблением ДНК-белковых контактов (поскольку различия в чувствительности к S1-нуклеазе проявляются только в условиях денатурации). При действии ХФ в РХ увеличивается количество как двуспиральной ДНК (свободной от связи с белками), так и потенциально односпиральных участков (появляющихся в условиях денатурации), которые в интактном хроматине недоступны действию фермента ввиду структурных ограничений, обусловленных увеличением степени спирализации. Структурная компактизация ДНК в составе ТАХ и релаксация в составе РХ при отравлении животных ХФ подтверждается результатами флюоресцентного зондирования этих фракций бромистым этидием. Отравление животных ХФ приводит к изменению физико-химических свойств белков (гистоновых, негистоновых) и липидов, при этом более значительные структурные нарушения отмечаются в составе ТАХ. Подтверждением предположения, что не сам ХФ, а его активные метаболиты вызывают повреждения ядерного хроматина клеток-мишеней в условиях in vivo, являются результаты экспериментов, в которых ХФ добавляли непосредственно к фракциям РХ и ТАХ, а также данные исследования взаимодействия яда с модельными системами. Они свидетельствуют о незначительных или разнонаправленных изменениях показателей, характеризующих структурно-функциональную организацию ядерного генома в условиях in vivo и in vitro. Полученные результаты экспериментальных исследований, а также обширные данные, свидетельствующие о генотоксическом действии продуктов ПОЛ [15], позволяют прийти к заключению о первостепенной роли модификации процессов перекисного окисления хроматин-связанных липидов в молекулярных механизмах генотоксического воздействия ФОС. В ходе дальнейших исследований были разработаны модели и методы фармакологической защиты и коррекции повреждений ядерного генетического аппарата, возникающих при отравлении животных ХФ, позволяющие вести целенаправленный скрининг лекарственных средств при отравлении ФОС. Для коррекции повреждений ядерного генома, возникающих при отравлении животных ХФ, вводили атропин, являющийся антидотом при отравлении ФОС; верапамил — блокатор кальциевых каналов, применяемый для нормализации внутриклеточного обмена кальция, т.к. предполагалось, что в результате отравления ХФ нарушается именно внутриклеточный метаболизм ионов кальция, что способствует началу токсического процесса, включая и его генотоксическую компоненту ; комплекс биологически активных соединений БТК-8Л (на основе фитоэкдистероидов серпухи венценосной), обладающий антиоксидантными свойствами, обнаруженными при изучении его действия в условиях отравления тетрахлорметаном [19]. В результате проведенных исследований установлено различное влияние этих препаратов на модифицированные вследствие отравления процессы ПОЛ хроматина. Введение верапамила стимулирует антиоксидантное действие в случае спонтанного ПОЛ в РХ и нормализует в ТАХ. При индукции ПОЛ НАДФН и аскорбатом наблюдается прооксидантный эффект в ТАХ. При введении атропина в большинстве случаев обнаружен ярко выраженный антиоксидантный эффект в обеих фракциях хроматина (прооксидантное действие отмечено в гептановом слое липидного экстракта ТАХ). БТК-8Л, так же как атропин, проявляет свои антиоксидантные свойства в обеих фракциях, однако они более выражены в ТАХ. Так, в РХ величина зависимого от нагревания НАДФН-индуцированного ПОЛ снижается, а в ТАХ помимо нормализации аскорбатзависимого ПОЛ достоверно снижается по сравнению с контролем не измененная в условиях отравления величина НАДФН-зависимого ПОЛ. Различное действие этих препаратов на процессы ПОЛ хроматина, верояннее всего, и обуславливают их специфическое влияние на структурно-функциональную организацию хроматина. Еще одним моментом, имеющим принципиальное значение, является вопрос о непосредственном или опосредованном характере влияния этих препаратов. Принимая во внимание хорошо известный механизм действия атропина как антогониста ацетилхолина, трудно ожидать какого-то ощутимого эффекта в результате его непосредственного взаимодействия с хроматином. Скорее всего, в данном случае ярко выраженный антиоксидантный эффект атропина и другие аспекты его действия на хроматин носят опосредованный характер. Верапамил же, как следует из полученных результатов, помимо опосредованного влияния на хроматин через Са2+-мембранные механизмы, непосредственно взаимодействует с ДНК, ухудшая в целом функционирование ядерного генома в условиях отравления ХФ, обуславливая, по всей видимости, сенсибилизацию ДНК, что и приводит к усилению генотоксического действия ХФ. В механизме влияния БТК-8Л также имеется непосредственный характер влияния, однако он направлен на гистоновые белки хроматина обеих фракций, что влечет за собой такое изменение всей структуры нуклеопротеидного комплекса хроматина, в результате которого ДНК, гистоновые и негистоновые белки становятся менее подвержены повреждающему действию хлорофоса. Однако его генопротекторное действие прежде всего обусловлено предотвращением модификации процессов ПОЛ в обеих фракциях хроматина. Доказательством свободнорадикальных механизмов повреждения хроматина при отравлении животных ХФ свидетельствуют следующие факты. Изменение интенсивности процессов ПОЛ во фракциях ядерного хроматина совпадает с появлением нарушений его структурно-функциональной организации. Генотоксическое действие ХФ более выражено во фракции ТАХ по сравнению с РХ и прямо пропорционально модификации реакций ПОЛ в этих фракциях. Соединения, обладающие антиоксидантной активностью по отношению к процессам перекисного окисления хроматин-связанных липидов, оказывают значительное генопротекторное действие. Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что генотоксическая компонента при отравлении ФОС занимает значительное место в токсическом процессе и обусловлена свободнорадикальными механизмами повреждения ДНК хроматина, а также позволяют рекомендовать соединения, обладающие антиоксидантным действием по отношению к процессам ПОЛ хроматина, в качестве дополнительных лекарственных средств при отравлении ФОС. Литература |