СТАН ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ ТА ОКИСЛЮВАЛЬНОЇ МОДИФІКАЦІЇ БІЛКІВ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ ПРИ ДІЇ МЕТСУЛЬФУРОН-МЕТИЛУ В МАЛИХ ДОЗАХ

Інститут медицини праці, м. Київ

Вже на протязі багатьох років в медицині та біології приділяється значна увага процесам вільнорадикального перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), порушення яких вважають загальним механізмом розвитку різних патологій та несприятливого впливу ксенобіотиків на організм теплокровних. ПОЛ є процесом окисної деструкції ліпідів з ненасиченими подвійними зв'язками. Процес ПОЛ відбувається за ланцюговим механізмом. Почавшись, він розвивається спонтанно, не зупиняється і продовжується до обриву ланцюгу. Обов'язковою умовою його є наявність в системі вільних радикалів, які являють собою молекули або фрагменти молекул з неспареним електроном і мають високу хімічну активність. Вільнорадикальне окислення проявляється в клітинному метаболізмі як у нормі, так і при патології. Вільнорадикальне окислення відіграє важливу роль в таких біологічних процесах, як транспорт електронів у дихальному ланцюзі, синтезі простагландинів, лейкотриєнів, тромбоксанів, проліферації та диференціації клітин, метаболізмі і синтезі катехоламінів, фагоцитозі, обміні ліпідів, білків, нуклеїнових кислот, метаболізмі деяких ксенобіотиків тощо [1, 2]. Ініціальним етапом вільнорадикального окислення є утворення активних форм кисню. До останніх відносяться супероксидний аніонрадикал, пергідроксильний, гідроксильний радикали та пероксид водню. Окрім продуктів відновлення кисню до активних форм його належать активовані кисневі метаболіти — молекули в синглетному стані та оксид азоту, пероксинітрит, гіпогалогеніти. Серед активних форм кисню найбільш стабільним є пероксид водню, найсильнішим окисником — гідроксильний радикал.

В організмі існує декілька джерел активних форм кисню, але первинним у всіх оксирадикалогенеруючих системах є супероксидний аніон-радикал.

Надмірне утворення активних кисневих метаболітів призводить до нагромадження продуктів ПОЛ, що при порушенні функціювання антиоксидантних систем негативно впливає на різноманітні ланки гомеостазу і є однією з причин багатьох захворювань [2, 3].

Активні форми кисню викликають також окисну модифікацію білків (ОМБ) за умов норми та патології. Підвищення ОМБ є результатом порушення рівноваги між процесами, що регулюють синтез та оксидацію протеїнів, і зменшення активності протеаз, які селективно розщеплюють оксидовані форми білків. Однією з причин змін ОМБ може бути неконтрольована інтенсифікація ПОЛ. Відомо, що продукти ПОЛ, зокрема малоновий диальдегід, реагуючи з лізиновими залишками білків, спричиняють їх деградацію з утворенням різноманітних цитотоксичних сполук. Інтенсифікація ОМБ може бути наслідком порушення функціювання захисних протирадикальних систем. В свою чергу, окислювальній модифікації піддаються, насамперед, металоензими (супероксиддисмутаза, каталаза, глютатіонпероксидаза, цитохром Р-450). Будь-яка система, що утворює пероксид водню і відновлює залізо трьохвалентне до двовалентного або мідь двовалентну до міді одновалентної, може викликати вибіркову модифікацію білків [4].

ОМБ може включати пряму фрагментацію білків або викликати їх денатурацію з частковою чи повною втратою функцій. Фрагментовані та денатуровані білки є субстратами для внутрішньоклітинних протеаз.

За нормального функціонування організму підтримується динамічна рівновага між антиоксидантною й прооксидантною системами [5]. Виражене порушення цієї рівноваги з розвитком окислювального стресу призводить до посилення процесів окислювальної деструкції ліпідів, білків, нуклеїнових кислот. При вільнорадикальній патології перш за все відбувається окислення ліпідів, інтенсивність якого в значній мірі залежить від стану антиоксидантного захисту. Білки окислюються на другому етапі, і в цей процес включаються не тільки активні форми кисню, а й інші продукти, в тому числі перекисного окислення ліпідів [3].

Таким чином, як ПОЛ так і ОМБ є нормальними функціональними процесами в організмі, з якими пов'язані життєво важливі функції. Причому, останні в значній мірі асоційовані з захисними та адаптаційними реакціями організму. При дії низьких рівнів ксенобіотиків, що має місце при контакті працюючих з пестицидами, перш за все можуть проявлятися зміни неспецифічних захисних реакцій, активація яких направлена на підтримку гомеостазу. Разом з тим, порушення захисних реакцій призводить до зниження резистентності організму до інфекційних захворювань та зміни перебігу хронічних патологій. В експерименті важливо виявити інформативні показники пошкоджуючої дії малих доз для встановлення порогових та недіючих рівнів, на основі яких обґрунтовуються допустимі рівні та проводиться гігієнічне регламентування застосування засобів захисту рослин. Дослідження змін інтенсивності ПОЛ та ОМБ при дії високоефективних гербіцидів на основі похідних сульфонілсечовини, до яких відноситься і метсульфурон-метил, не проводились.

Мета роботи полягала в дослідженні процесів перекисного окислення ліпідів, окислювальної модифікації білків при дії гербіциду на основі метсульфурон-метилу на рівні малих доз в субхронічному експерименті.

Матеріали та методи дослідження

Дослідження проведені на статевозрілих білих щурах в динаміці при пероральному введенні протягом 30 діб гербіциду на основі метсульфурон-метилу, що вміщує 60% діючої речовини. Терміни дослідження — 7, 14, 30 доба та відновний період протягом 2 тижнів. Препарат вводили щурам у вигляді водного розчину щоденно, натщесерце в дозах 1,11 мг/кг, 3,5 мг/кг та 7,0 мг/кг в перерахунку на діючу речовину.

Вибір доз був обумовлений даними про наявність низьких рівнів препаратів у повітрі робочої зони при застосуванні засобів захисту рослин. Величини недіючих та порогових рівнів метсульфурон-метилу, встановлені в субхронічному і хронічному експериментах за біохімічними, гематологічними показниками, складають відповідно 50 та 23 мг/кг маси тіла лабораторних тварин. Разом з тим при повторному введенні метсульфурон-метилу відмічались зміни в показниках крові та активності індикаторних ферментів при дії менших доз (1,11 та 7,0 мг/кг). Тому, в наших дослідженнях використані вищевказані дози метсульфурон-метилу та проміжна між ними 3,5 мг/кг.

Стан ПОЛ оцінювали за інтенсивністю спонтанного накопичення ТБК-активних продуктів в печінці [6] та еритроцитах крові, дієнових кон'югатів (ДК) в плазмі крові [7]. Стан антиоксидантної системи оцінювали за вмістом SH-груп (метод Елмана) та церулоплазміну (ЦП) в плазмі крові [7]. Окислювальну модифікацію білків плазми крові щурів визначали за методом О.Ю. Дубиніної в модифікації І.Ф. Мещишена [3, 5]. Про ступінь окислення судили за утворенням альдегідних і кетонних груп у радикалах залишків аліфатичних амінокислот білків плазми крові. Альдегідо- і кетонопохідні нейтрального характеру (ОМБ370) реєстрували за оптичною густиною при 370 нм, основного (ОМБ430) — при 430 нм [5]. Білок визначали за біуретовим методом. Результати проведених досліджень оброблені статистично з використанням критерію t-Стьюдента.

Результати та їх обговорення

В результаті проведених експериментальних досліджень при пероральному введенні щурам гербіциду на основі метсульфурон-метилу виявлено порушення перебігу інтенсивності перекисного окислення ліпідів, ОМБ та активності антиоксидантної системи організму щурів.

Зміни інтенсивності ПОЛ в умовах даного експерименту були найбільш виражені в печінці піддослідних щурів (рис. 1). Свідченням цього було суттєве збільшення ТБК-активних продуктів в печінці на 7 добу при всіх досліджуваних дозах препарату (від 40 до 67% в порівнянні з контролем). В подальшому, на 14 добу експерименту, вірогідне збільшення накопичення ТБК-активних продуктів в печінці спостерігалось тільки при максимальній дозі (7 мг/кг) — на 98% в порівнянні з контролем. На 30 добу експерименту значимі зміни інтенсивності ПОЛ в печінці не відмічалися, а у відновний період навіть спостерігалась тенденція до зниження накопичення ТБК-активних продуктів в цьому органі.

В той же час кількість ТБК-активних продуктів в еритроцитах крові статистично значимо збільшувалась на 14 добу експерименту на 30% в порівнянні з контролем при дії середньої дози (3,5 мг/кг), та на 30 добу експерименту на 32% в порівнянні з контролем при дії максимальної досліджуваної дози (7 мг/кг). У відновний період кількість ТБК-активних продуктів в еритроцитах крові мала тенденцію до зниження при дії найменшої дози (1,11 мг/кг), аналогічно з накопиченням ТБК-активних продуктів у печінці, та статистично значимо не відрізнялась від контролю при дії двох інших доз.

В плазмі крові ПОЛ, що оцінювалось за кількістю дієнових кон'югатів, характеризувалось вірогідним збільшенням при дії метсульфурон-метилу в дозі 1,11 мг/кг на 7 добу експерименту та на 30 добу експерименту (на 40 та 29% в порівнянні з контролем, відповідно, рис. 1). При дії двох інших доз гербіциду інтенсифікації ПОЛ в плазмі крові не спостерігалось, навіть навпаки, в перший термін дослідження при дії максимальної дози та на 30 добу при дії середньої дози відмічалась тенденція до зниження цього показника.

Це може бути пов'язано з тим, що введення препарату в низьких дозах призводить до розвитку реакції антиоксидантного захисту організму щурів. Підтвердженням цього було збільшення в плазмі крові кількості церулоплазміну на 7 та 14 добу експерименту при дії двох менших доз метсульфуронметилу, а також збільшення кількості SH-груп на 30 добу експерименту при дії препарату (рис. 2).

Інтенсифікація ПОЛ при дії ксенобіотиків може відбуватися за різними механізмами [1, 8]: генерація активних форм кисню (як продуктів каталітичного циклу цитохрому Р450, синтази оксиду азоту, НАДФН-редуктази, діафорази та інших ферментів та активації макрофагів ксенобіотиками); утворення вільнорадикальних форм ксенобіотиків; внутрішньоклітинне накопичення прооксидантної форми іонів двовалентного заліза; зниження внутрішньоклітинного вмісту антиоксидантів (a-токоферолу, аскорбінової кислоти, селену та ін.); зниження активності ферментів антиоксидантної системи (супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази, каталази); порушення структури мембран.

Найбільш реальним механізмом інтенсифікації ПОЛ при дії метсульфурон-метилу може бути утворення активних форм кисню в монооксигеназній гідроксилюючій системі, за участю якої відбувається метаболізм цього гербіциду [9]. Адже найбільш ранні та виражені зміни визначались в печінці щурів, яка є основним місцем метаболізму та детоксикації ксенобіотиків. Разом з тим, низькі рівні дослідженого препарату не призводили до порушення про-антиоксидантного співвідношення, що забезпечує адаптацію організму та захист його від шкідливої дії метсульфурон-метилу. Імовірно, тільки при найбільшій дослідженій дозі (7 мг/кг) в подальшому можливе поступове накопичення пошкоджуючого ефекту. Адже в умовах даного експерименту визначалась активація антиоксидантної системи за вмістом сульфгідрильних груп та церулоплазміну. Останній є одним з основних антиоксидантів плазми крові, що проявляє як специфічну, пов'язану зі зниженням рівня активності метаболітів кисню за рахунок окислення заліза двовалентного, дисмутації супероксидного аніонрадикалу та інактивації інших активних форм кисню, так і неспецифічну, обумовлену утворенням комплексних сполук з міддю, антиоксидантну активність [3].

Введення метсульфурон-метилу протягом 30 діб призводило також до збільшення ОМБ (рис. 3). Інтенсифікація ОМБ була більш виражена за альдегідо- та кетонопохідними основного, ніж нейтрального характеру.

Так, статистично значимі зміни ОМБ430 відмічені на 7 добу експерименту при дії середньої та максимальної досліджених доз метсульфурон-метилу (відповідно, на 28 та 22% відносно контролю). В подальшому, на 14 добу експерименту, зміни інтенсивності ОМБ430 були статистично значимі при дії метсульфурон-метилу в дозах 1,11 мг/кг та 7,0 мг/кг.

Достовірна (р<0,05) інтенсифікація ОМБ370 в умовах даного експерименту реєструвалась тільки на 7 добу при дії середньої дози (3,5 мг/кг) — на 24%. На 14 добу експерименту при дії мінімальної, а на 30 добу і при дії середньої дози гербіциду відмічалось суттєве зниження ОМБ370.

У відновний період окисна модифікація білків плазми крові щурів мала тенденцію до нормалізації при дії метсульфурон-метилу в дозах (1,11 та 7 мг/кг) маси тіла. При дії середньої дози спостерігалась навіть незначна тенденція до збільшення у порівнянні з 30 добою експерименту.

Зміни ОМБ370 при дії двох менших доз метсульфурон-метилу (1,11 та 3,5 мг/кг) на протязі всього терміну експерименту мали S-образний характер потрійної залежності "доза-час-ефект". Тобто, спостерігалась стадія фізіологічної адаптації — зниження ефекту після його первинного підвищення. Це можна пояснити тим, що на початку свого впливу токсична речовина збуджує біологічну систему, яке призводить до розвитку захисних адаптаційних реакцій [10].

Дія найбільшої дози метсульфурон-метилу (7 мг/кг) характеризується лінійною залежністю за окислювальною модифікацією білків за альдегідо- та кетонопохідними нейтрального характеру, хоча зміни й не були статистично значимі, але на протязі всього терміну експерименту спостерігалося поступове підвищення значення Е370.

Зміни окислювальної модифікації білків за альдегідо- та кетонопохідними основного характеру в умовах даного експерименту не мали таких чітких закономірностей, але також з часом на протязі всього терміну дослідження первинне підвищення показників (стадія первинних реакцій) на 7 та 14 добу експерименту нормалізувалось на 30 добу експерименту. Тобто, можна сказати, що відхилення від контрольних параметрів окислювальної модифікації білків плазми крові не залишається постійно вираженим, а з часом наближається до вихідного рівня внаслідок розвитку в організмі адаптаційних процесів [10].

Отже, при дії гербіциду на основі метсульфурон-метилу відмічалась активація процесів перекисного окислення ліпідів та окисної модифікації білків. Рівень ОМБ відображає баланс між швидкістю оксидації протеїнів та деградації окислених форм. У зв'язку з цим, збільшення їх кількості, ймовірно, є результатом порушення рівноваги між процесами, що регулюють синтез та розпад протеїнів, і зменшення активності протеаз, які активно розщеплюють оксидовані форми. При цьому було відзначено активацію антиоксидантного захисту організму щурів, що забезпечувало майже у всіх біосубстратах нормалізацію окисних процесів у відновний період.

Зміни окисної модифікації білків за альдегідо- та кетонопохідними основного характеру були більш вираженими за абсолютними величинами у порівнянні з альдегідо- та кетонопохідними нейтрального характеру і проявлялися збільшенням на 7 та 14 добу, в той же час як останні мали суттєве збільшення тільки на 7 добу експерименту. Вірогідно, збільшення кількості ЦП в плазмі крові на 14 добу експерименту запобігало ОМБ переважно нейтрального характеру та забезпечувало зменшення ОМБ альдегідо- та кетонопохідних основного характеру на 30 добу. Зміни ж у відновний період мали різнонаправлений характер, але суттєвої значимості не досягли.

Зміни показників ПОЛ, ОМБ, антиоксидантної активності при дії максимальної дослідженої дози метсульфурон-метилу (7 мг/кг) мали дещо іншу динаміку. Так, збільшення вмісту ТБК-активних продуктів в еритроцитах, ОМБ нейтрального характеру було лінійним в часі, що може свідчити про поступове накопичення пошкоджуючого ефекту і навіть при відсутності статистично значимих змін ПОЛ та ОМБ антиоксидантний захист не був реалізований, що дозволяє розцінити цю дозу як мінімальний рівень виявлених шкідливих ефектів чи межу напруження захисних реакцій [11].

Висновки

1. Вплив гербіциду на основі метсульфурон-метилу в малих дозах в субхронічному експерименті викликає активацію ПОЛ та окислювальної модифікації білків в перші терміни дослідження. У відновний період відбувається нормалізація цих показників.

2. Черговість активації з нормалізацією чи зниженням інтенсивності ПОЛ та ОМБ свідчить про розвиток захисних адаптаційних реакцій, а лінійне накопичення ефекту є ознакою пошкоджуючого впливу метсульфурон-метилу.

3. Інформативну значимість в розмежуванні недіючих, неефективних рівнів метсульфурон-метилу за інтенсивністю ПОЛ, ОМБ та антиоксидантною активністю мають абсолютні величини ефектів, динаміка змін та співвідношення змін вільнорадикальних процесів з антиоксидантним захистом.

Література
1. Губський Ю.І., Бєленічев І.Ф., Коваленко С.І. та ін. Основні шляхи утворення активних форм кисню в нормі та при ішемічних патологіях (Огляд літератури) // Современные проблемы токсикологии. —2004. —№2. —С. 8—15.
2. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Сер.: Биофизика. —М., 1991. —Т. 29. —250 с.
3. Дубініна О.Ю. Окислювальний стрес і окислювальна модифікація білків // Медична хімія. —2001. —Т. 3, №2. —С. 5—12.
4. Мещишен І.Ф., Польовий В.П. Механізм окислюівaльної модифікації білків // Буковинський медичний вісник. —1999. —Т. 3, №1. —С. 196—205.
5. Мещишен І.Ф. Метод визначення окиснювальної модифікації білків плазми (сироватки) крові // Буковинський медичний вісник. —1998. —Т. 2, №1. —С. 156—158.
6. Гацко Г.Г., Мажуль Л.М., Позднякова Е.А. Перекисное окисление липидов в тканях крыс разного возраста в норме и при голодании // Бюл. эксперим. биол. и медицины. —1982. —№4. —С. 30—32.
7. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. —Минск: Беларусь, 2000. —Т. 2. —495 с.
8. Чорновіл А.В. Перeкисне окислення ліпідів та його патогенетична корекція при інфекційній патології (Огляд літератури) // Acta Medica Leopoliensia. —2000. —№2. —С. 17—22.
9. The Pesticide Manual /9th ed./ British Crop Protection Council. —1991. —1141 p.
10. Пазынич В.М., Подлозный А.В., Нестеренко Н.В. и др. Построение математической модели для прогнозирования безопасных уровней воздействия потенциально токсических веществ // Современные проблемы токсикологии. —2001. —№4. —С. 53—58.
11. Трахтенберг И.М. Проблема токсических воздействий малой интенсивности — дань творческому романтизму прошлого или необходимость, диктуемая реалиями настоящего? Полемические заметки // Токсикологический вестник. —1997. —№1. —С. 6—11.

| Зміст |