УДК 615.9:632.95:612.6:591.16

Н.Р. Шепельская, д.м.н., С.Д. Сапожникова

ОЦЕНКА ОПАСНОСТИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ТОКСИЧНОСТИ ТЕТРАКОНАЗОЛА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА САМЦАХ И САМКАХ КРЫС WISTAR

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, г. Киев

Целью настоящих исследований являлась оценка опасности для репродуктивной системы фунгицида тетраконазола (активного ингредиента пестицидного препарата лоспела). Исследования были проведены по заказу японской фирмы Ариста Лайф Сайенс. Необходимость в проведении указанных исследований возникла в связи с предложением этого препарата на рынок Украины. При анализе токсикологических данных, представленных фирмой, было обнаружено отсутствие недействующей дозы тетраконазола в проведенном фирмой эксперименте по изучению репродуктивной токсичности. Поскольку одним из необходимых условий оценки риска и безопасного применения пестицидных препаратов является наличие экспериментально установленного безвредного дозового уровня для животных [1], фирма Ариста Лайф Сайенс для регистрации препарата в нашей стране была вынуждена провести дополнительные исследования по выявлению недействующего уровня тетраконазола на гонады и репродуктивную функцию.

Дозовые уровни и методические подходы были выбраны с учетом результатов изучения репродуктивной токсичности тетраконазола в тест-системе 2-х поколений животных, представленных фирмой Ариста Лайф Сайенс. В качестве критериев репродуктивной токсичности соединения в собственном эксперименте были выбраны показатели, изменявшиеся под воздействием минимальной испытанной дозы в проведенном ранее исследовании, а также показатели, не изучавшиеся в предыдущем эксперименте (циклические изменения функции яичников в процессе эстральных циклов, способность к зачатию и фертильность подопытных самок при спаривании с интактными самцами, абсолютная и относительная масса семенников и придатков у самцов, оплодотворяющая способность и фертильность самцов при спаривании с интактными самками, длительность прекоитального интервала).

Исследования выполнены на 400 крысах Wistar обоего пола. В экспериментах использованы методические подходы, отвечающие требованиям "Методических указаний по гигиенической оценке новых пестицидов" [2], а также современным международным требованиям, принятым в такого рода исследованиях [3].

Исследования проводились в секторе репродуктивной токсикологии отдела общей токсикологии Института экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя МЗ Украины.

Материалы и методы исследования

Тетраконазол является вновь синтезированным фунгицидом. Ранее в Украине зарегистрирован не был.

Тетраконазол 96% технический был предоставлен заказчиком однократно на весь курс исследований. Документация на методы синтеза изучаемого соединения и методы определения представленного образца, его состав, химическую идентичность, чистоту, стабильность и другие параметры, необходимые для его характеристики, принадлежит заказчику, который несет за нее полную ответственность.

Подопытные самцы крыс Вистар получали тетраконазол ежедневно, внутрижелудочно с помощью зонда в течение 13 недель. По окончании запланированного периода затравки часть животных спаривалась с интактными самками. На 20-й день беременности самок умерщвляли (путем помещения их в камеру с парами хлороформа), и у них определяли показатели, характеризующие репродуктивную функцию. Оставшихся подопытных самцов использовали для изучения морфологических показателей семенников и их придатков, определяли абсолютную массу и коэффициенты относительной массы этих органов. Контрольные самцы получали эквивалентное количество растворителя и по окончании запланированного периода введения их спаривали с интактными самками.

Подопытных самок подвергали воздействию тетраконазола в течение 11 недель. На протяжении последних 2-х недель периода затравки у самок изучали цикличность и продолжительность эстрального цикла. По окончании затравки подопытных самок спаривали с интактными самцами. Самок оставляли до естественных родов и регистрировали у них продолжительность беременности, а также число живых и мертвых новорожденных, их массу. После чего у самок вскрывали брюшную полость, извлекали матку и оценивали количество желтых тел, количество мест имплантации, внутриутробную гибель плодов и эмбрионов. Контрольные самки получали эквивалентное количество растворителя, по окончания периода введения их спаривали с интактными самцами.

Всех животных, вскрывавшихся в ходе эксперимента, подвергали тщательному макроскопическому исследованию.

Для изучения гонадо- и репродуктивной токсичности тетраконазола были получены партии животных из 200 самцов и 200 самок массой от 130 до 150 г для самцов и от 120 до 140 г для самок.

10 дней продолжался адаптационный период, в течение которого за животными осуществлялось ежедневное наблюдение. Перед началом воздействия масса тела самцов составляла 140—160 г, самок — 130—150 г.

Животные были размещены в специально оборудованном помещении, доступ в которое был ограничен. Комната была обеспечена принудительной вентиляцией (12 объемов в час), которая исключала рециркуляцию воздуха. Температуру и относительную влажность воздуха регистрировали ежедневно, колебания температуры составляли от 20 до 25°С, влажности — от 40 до 70%. Освещение было естественным.

Животные получали питьевую воду без ограничения из стеклянных бутылок объемом 0,5 литра через стеклянные наконечники.

На протяжении всего эксперимента крысы получали ad libitum сбалансированный корм, содержащий все необходимые компоненты и составленный в соответствии с нормами, установленными Приказом МЗ СССР №1179 от 10.10.1988 г.

Животные содержались в клетках типа Т4 в течение всего периода исследований. Корпус клетки (40х30х15 см) изготовлен из прочного пластмассового материала, сверху накрыт металлической съемной решеткой. Дно клетки покрывалось ежедневно сменяемой подстилкой из древесных опилок. Клетки мылись и стерилизовались в начале эксперимента и один раз в месяц в течение исследований.

В табл. 1 указано максимальное количество крыс в одной клетке в различные стадии эксперимента.

Полученные животные были распределены по клеткам и наблюдались в течение периода адаптации. При наличии признаков какой-либо патологии или значительном отклонении от средней массы животные выбраковывались. Каждому животному был присвоен индивидуальный номер, маркировка осуществлялась нанесением меток 1%-ным водно-спиртовым раствором метиленового синего и насыщенным водным раствором пикриновой кислоты. На клетку наклеивалась этикетка с указанием номера животных, пола, номера группы и величины дозы испытуемого соединения.

Изучаемое соединение вводили животным в виде свежеприготовленной водной суспензии ежедневно, кроме субботы и воскресенья, внутрижелудочно с помощью зонда в течение 13 недель самцам и 11 недель самкам.

5 групп животных, состоящих из 2-х контрольных групп и 3-х подопытных групп самцов и самок, получали соединение в различных дозах (табл. 2).

Параллельно с контрольными и подопытными животными содержались интактные самцы (100) и самки (100), предназначенные для спаривания. Интактные животные были также распределены по группам и промаркированы.

Раствор для введения максимальной дозы препарата приготовляли ежедневно ex temроrае из расчета 25 мг тетраконазола на 250 мл рабочей суспензии. Две других дозы приготовляли методом пассажа. По мере роста животных количество приготовляемой суспензии увеличивали. Контрольным животным вводили дистиллированную воду с эмульгатором в эквивалентных количествах.

Введение осуществляли с помощью зонда из нержавеющей стали с оливой на конце диаметром 1,6 мм и длиной 60 мм, насаженного на медицинский шприц объемом 2 или 5 мл. Для коррекции количества вводимого раствора в соответствии с увеличением массы тела животных еженедельно взвешивали.

Животных на протяжении всего периода исследования ежедневно обследовали с целью регистрации каких-либо видимых признаков реакции на воздействие изучаемого соединения. Подопытных самцов взвешивали еженедельно в течение всего периода затравки. Подопытных самок взвешивали еженедельно до периода спаривания и на 0, 6, 13 и 20 дни роst соitum.

В течение последних 2-х недель периода затравки у подопытных самок ежедневно делали вагинальные мазки и проводили цитологические исследования с целью определения продолжительности всего эстрального цикла, частоты и длительности его отдельных стадий.

Мазки также делали с первого дня подсаживания интактных самцов к подопытным самкам и подопытных самцов к интактным самкам для определения момента спаривания.

По окончании запланированного периода затравки из подопытных групп в произвольном порядке отбирали 10 самцов для исследования морфологического состояния гонад. Животных умерщвляли (путем помещения в камеру с парами хлороформа), вскрывали брюшную полость, извлекали оба семенника и придатка, подвергали их визуальному обследованию, отделяли придатки семенников, тщательно освобождая их от жировой ткани, и взвешивали органы.

Оставшихся 15 подопытных самцов спаривали с интактными самками, а 25 подопытных самок — с интактными самцами (в соотношении 2 самца к 3 самкам). Каждое утро на протяжении периода спаривания готовили вагинальные мазки для каждой самки, которые исследовали на наличие сперматозоидов. День обнаружения спермиев в вагинальном содержимом самки принимали за 0 день беременности. После установления факта спаривания самку отсаживали в отдельную клетку и прекращали взятие мазков. Продолжительность периода спаривания не превышала 3-х недель. Определяли время, прошедшее от момента подсаживания самцов к самкам до момента установления факта оплодотворения.

На 20-й день беременности интактных самок, спаренных с контрольными самцами, а также интактных самок, спаренных с подопытными самцами, умерщвляли (помещая в камеру с парами хлороформа), вскрывали брюшную полость, извлекали и вскрывали матку, затем подсчитывали и регистрировали для каждой самки общее количество желтых тел в яичниках, количество мест имплантации, количество резорбированных зародышей и плодов, количество мертвых плодов, количество живых плодов, наличие грубых аномалий развития у плодов, среднюю массу плодов, общую массу плодов в помете.

Подопытных и контрольных самок доводили до естественных родов, регистрировали продолжительность беременности и осуществляли контроль за процессом родов у каждой самки. Для этого, начиная с 20 дня беременности и до окончания родов, в 9.00, 13.00 и 17.00 часов ежедневно проводили наблюдение за состоянием беременной самки. Продолжительность беременности высчитывали как количество дней беременности со дня спаривания до дня родов включительно, день спаривания принимали за нулевой день беременности. Если роды регистрировали ночью, то этот промежуток времени засчитывался за 0,5 дня.

Контроль за состоянием потомства

Обследование в 1-й день после родов. Всех новорожденных обследовали не позже, чем через 12 ч после родов. Для каждого помета регистрировали количество рожденных крысят (живых и мертвых), среднюю массу плодов, наличие грубых аномалий развития.

Все подопытные самцы и самки, вскрывавшиеся в ходе эксперимента, подвергались макроскопическому обследованию. Умерщвление животных осуществляли путем помещения их в камеру с парами хлороформа. Процедура вскрытия включала в себя ознакомление с результатами наблюдения за животными в течение эксперимента и обследование внутренних органов грудной и брюшной полостей. Регистрировали обнаруженные изменения и отклонения.

Обработка данных. Данные были представлены в виде средних групповых значений (X) с средней квадратической ошибкой (±Sx) (там, где это было необходимо), вычисленной по следующей формуле:

где x' — индивидуальное значение показателя в вариационном ряду (помет рассматривали в качестве статистической единицы), x — cреднее групповое значение показателя, n — число измерений.

Статистическую значимость межгрупповых различий оценивали по критерию "t" Стьюдента.

Результаты исследования

Самцы. Ни в одной из подопытных групп самцов, получавших тетраконазол, не зафиксировано случаев гибели. В контроле случаев гибели также не наблюдалось.

Установлено, что тетраконазол в максимальной тестируемой дозе статистически значимо увеличивает массу тела с третьей недели от начала введения до окончания воздействия. Масса тела животных, подвергавшихся воздействию средней дозы препарата, увеличилась в период с 5-й по 8-ю недели введения (табл. 3).

Макроскопическое обследование семенников и придатков у животных всех групп не обнаружило видимой патологии. Во всех подопытных группах наблюдается тенденция к понижению коэффициентов относительной массы tеstеs и придатков семенников по отношению к контролю, хотя указанные изменения не достигают уровня достоверности (табл. 4).

У самцов, получавших тетраконазол в большей дозе, отмечалась статистически достоверная задержка способности к спариванию с интактными самками по сравнению с контролем. Тенденция к увеличению продолжительности прекоитального интервала сохранялась и в двух других подопытных группах (табл. 5).

Оплодотворяющая способность самцов и их плодовитость, о которых судили по индексам зачатия и фертильности интактных самок, оказались несколько ниже в подопытных группах по сравнению с контролем (табл. 5).

Тетраконазол не оказал отрицательного влияния на функцию воспроизведения потомства у самцов, о которой судили по показателям состояния репродуктивной функции забеременевших от них интактных самок. Более того, количество живых плодов в первой подопытной группе статистически достоверно превышает уровень контроля (табл. 5). Однако, это не связано с какими-либо репродуктивными эффектами у самцов, а является следствием более низкого биотического потенциала интактных самок, спаренных с контрольными самцами (количество желтых тел у них достоверно ниже, чем в 1-й и 3-й подопытных группах).

Число погибших до- и после имплантации зародышей и плодов, а также процент до- и постимплантационной гибели в подопытных группах статистически не отличаются от контроля. Вместе с тем, более низкое количество живых плодов в контрольной группе повлекло за собой достоверное увеличение их средней массы по сравнению с таковой у плодов подопытных групп, что, однако, не является проявлением повреждающего действия тестируемого препарата. Этот вывод подтверждает такой показатель, как средняя величина общей массы плодов в помете.

При макроскопическом обследовании внутренних органов самцов никаких изменений, связанных с воздействием, не выявлено.

Самки. Тетраконазол не оказал влияния на общее состояние самок, получавших препарат. Случаев смертности животных не зарегистрировано. Не обнаружено также отрицательного воздействия на массу тела. Вместе с тем, в течение 2-х недельного периода наблюдения отмечалось статистически значимое увеличение продолжительности эструсной стадии у самок, получавших максимальную дозу тетраконазола. У самок двух других подопытных групп наблюдалась тенденция к увеличению длительности стадии эструс (табл. 6).

Большинство подопытных самок спарилось с интактными самцами в первую же стадию эструса. Величина длительности прекоитального интервала в подопытных группах находилась в пределах физиологических колебаний и достоверно не отличалась от контроля.

Величины индексов спаривания и фертильности во всех группах животных, получавших тетраконазол, статистически не отличались от контроля. Способность к зачатию у самок подопытных групп практически была одинаковой с таковой у контрольных самок.

Ни в одной из групп подопытных самок не наблюдалось достоверных отличий количества желтых тел, показателей плодовитости и способности к зачатию, количества живых и мертвых новорожденных крысят в помете, внутриутробной гибели плодов и зародышей, средней массы тела новорожденных по сравнению с контролем. Продолжительность беременности у самок в подопытных группах статистически не отличались от таковой у контрольных крыс (табл. 7).

При макроскопическом обследовании подопытных родивших самок, умерщвленных после родов в конце эксперимента, никаких изменений, связанных с воздействием, не выявлено. У незабеременевших самок при макроскопическом обследовании также не обнаружено изменений внутренних органов. При макроскопическом обследовании новорожденного потомства видимых грубых аномалий развития не обнаружено.

Обсуждение результатов

Тетраконазол является классическим представителем триазоловых фунгицидов и, следовательно, существует большая доля вероятности обнаружения у него деструктивного действия на эндокринную систему. Анализируя токсикологическое досье препарата, представленное фирмой-изготовителем, мы учитывали это обстоятельство. И действительно, нами были обнаружены изменения одного из изучавшихся показателей (при воздействии на всех уровнях доз), достоверно свидетельствующие о нарушении функции половых гормонов, а именно: статистически значимое увеличение продолжительности беременности у подопытных самок по сравнению с контролем. Поскольку многие представители группы триазоловых фунгицидов обладают способностью ингибировать уровень выработки эстрогена у крыс, то становится очевидным, что обнаруженные изменения являются специфическими и обусловлены воздействием тестируемого препарата.

Принимая во внимание, что в экспериментах, проведенных фирмой, не изучалось влияние тетраконазола на состояние эстрального цикла и отдельных его стадий, при планировании исследований мы включили эти тесты в спектр изучаемых показателей, так как деструкторы половых гормонов практически в 100% случаев вызывают нарушение эстрального цикла у самок [4]. Учитывая тот факт, что изменения массы семенников и придатков у самцов также являются весьма чувствительным показателем нарушения баланса половых гормонов под влиянием эндокринных деструкторов [5], мы исследовали и эти показатели.

В группе самцов, получавших тетраконазол в дозе 1,0 мг/кг массы тела ежедневно, внутрижелудочно в течение 13 недель, обнаружено статистически достоверное увеличение массы тела животных и удлинение прекоитального периода. Несмотря на то, что изменения относительной массы семенников и придатков не достигают уровня статистической достоверности, однако наблюдается явно выраженная дозозависимая тенденция к понижению этих показателей у подопытных самцов, которая в контексте рассматриваемых нарушений становится биологически значимой. Все наблюдаемые изменения у самцов, подвергавшихся воздействию максимальной дозы препарата, можно охарактеризовать как минимальный антиандрогенный эффект.

Более низкое значение средней массы тела плодов в первой подопытной группе по отношению к этому параметру в контрольной группе не связано с воздействием изучаемого препарата, поскольку он обусловлен вариабельностью такого параметра, как количество желтых тел у интактных самок, которое в данном случае оказалось ниже в контрольной группе. У самок, получавших тетраконазол в дозе 1,0 мг/кг массы тела ежедневно, внутрижелудочно в течение 11 недель, зафиксировано статистически значимое увеличение продолжительности стадии эструс. Как видно из табл. 6, в этой группе прослеживается также тенденция к увеличению продолжительности всего эстрального цикла (преимущественно за счет эстрогензависимых стадий проэструса и эструса), что также характерно для эффектов эндокринных деструкторов с подобным механизмом действия [4].

Нормальная продолжительность беременности у крыс в наших экспериментах свидетельствует об обратимости выявленных нарушений у самок. Так как схема проведения нашего эксперимента, в отличие от схемы исследований в тест-системе 2-х поколений животных, не предусматривала воздействия препарата в течение эмбриогенеза, введение тетраконазола было прекращено перед спариванием животных, и в течение более чем трехнедельного периода беременности животные тестируемое соединение не получали. В течение этого времени восстановился баланс половых гормонов, и благодаря этому не зафиксировано отклонений в течении беременности, имевших место в предыдущем эксперименте.

В дозах 0,5 и 0,2 мг/кг массы тела в условиях проведенного эксперимента препарат не оказал влияния на репродуктивную функцию самок и самцов.

Анализ результатов проведенных исследований позволяет сделать следующее заключение. В группе животных, подвергавшихся воздействию тетраконазола в большей дозе (1 мг/кг массы тела), наблюдаются пороговые изменения ряда показателей, свидетельствующие о деструктивном действии препарата на нейро-эндокринную систему. Указанная доза эквивалентна наименьшей испытанной концентрации (10 ppm) в эксперименте по изучению репродуктивной токсичности, проведенном фирмой, которая также оказала влияние на состояние эндокринной системы подопытных животных.

В диапазоне изученных доз наблюдается зависимость "доза-эффект". Максимальным дозовым уровнем тетраконазола, не оказывающим повреждающего действия на гонады и репродуктивную функцию самок и самцов крыс Wistar (NOAEL) в нашем эксперименте, является доза 0,5 мг/кг массы тела. Эта величина оказалась лимитирующей при изучении токсикологических параметров тетраконазола.

Полученные результаты позволяют отнести тетраконазол ко 2-му классу опасности по репродуктивной токсичности [6]. Они приняты за основу при оценке риска тетраконазола для здоровья человека и разработке его токсикологических регламентов.

Литература
1. WHO. IPCS Environmental Health Criteria 170: Assessing Human Health Risks of Chemicals: Derivation of Guidance Values for Health-based Exposure limits. —Geneva: World Health Organization, 1994. —75 p.
2. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. —Киев, 1988. —С. 55—67.
3. Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment. U.S. EPA. —September 1996. —163 p.
4. U.S. EPA. The Grouping of a Series of Triazine Pesticides Based on a Common Mechanism of Toxicity. —Office of Pesticide Programs Health Effects Division. —March 2002. —46 p.
5. Пройнова В.А. Загрязнение окружающей среды "ксеноэстрогенами" как глобальная проблема // Токсикологический вестник. —1998. —№2. —С. 2—6.
6. Гігієнична класифікація пестицидів за ступенем небезпечності. —Дсанпін 8.8.1.002-98. —Київ: МОЗ України, 1998. —25 с.