ПРОБЛЕМНІ СТАТТІ УДК 616-006.04-036.4 ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ЦИТОСТАТИКОВ — ПРОЛЕКАРСТВ, ПРОЯВЛЯЮЩИХ ИЗБИРАТЕЛЬНУЮ ТОКСИЧНОСТЬФизико-химический институт им. А.В. Богатского НАН Украины Идеальный противоопухолевый препарат должен быть тканеспецифичным (для органов или тканей, пораженных раком), специфичным для клеток (для малегнизированных клеток) и не токсичным, но идеал обычно далек от действительности. Несмотря на усилия химиков по синтезу противоопухолевых препаратов, которые предназначаются для тканей и клеток с неконтролируемым ростом, все противораковые препараты (цитостатики) в настоящее время являются очень ядовитыми молекулами, предназначенными специально для быстрообновляющихся клеток (например, желудочно-кишечный тракт, костный мозг и др.), в связи с чем химиотерапия сопровождается такими токсическими осложнениями, как тошнота, рвота, потеря волос, подавление костного мозга, геморрагический цистит, поражение миокарда и хроническая усталость [1]. Побочное действие цитостатиков является серьезным ограничением в достижении максимального лечебного эффекта. Именно развивающиеся осложнения служат показанием для снижения дозы лекарств, прерывания и даже прекращения лечения. Поэтому предупреждение и уменьшение токсичности противоопухолевой химиотерапии — это реальный путь к повышению эффективности широко применяемых в клинике цитостатиков. Существует несколько путей снижения токсичности цитостатиков: Как и все клетки, раковые клетки экспрессируют определенные белки на своей поверхности, которые могут действовать как антигены [2]. После парентерального введения антитела, специально предназначенные для этих поверхностных антигенов, целенаправленно прочно связывались бы с ними. Если бы антитело было также ковалентно связано с противоопухолевым препаратом или токсином (противоопухолевый иммуноконъюгат) это способствовало бы целенаправленной доставке химиотерапевтического агента непосредственно к месту действия. После связывания моноклонального антитела с антителом на поверхности мембраны и захватом раковой клеткой, внутренние механизмы высвобождают препарат или токсин от антитела-курьера, что дает возможность дальнейшего токсического воздействия этих агентов непосредственно на опухолевые клетки. Такой подход дает возможность более безопасной и селективной доставки токсичных препаратов конкретно в опухоль, что позволяет снизить дозы препаратов, а, следовательно, уменьшить побочное действие на нормальные клетки организма [1]. Моноклональные антитела Начало современного этапа использования моноклональных антител в клинической онкологии было положено работами D. Pressman, L. Korngol (1953). Широкое использование этого метода ограничивалось технологическими трудностями в получении моноклональных антител в достаточных количествах. Это стало возможным только после разработки рекомбинантной гибридомной технологии получения моноклональных антител в терапевтических количествах. В настоящее время известно 4 класса цитотоксических моноклональных антител [3]: Типичное антитело является иммуноглобулином и состоит из четырех цепей (двух легких и двух тяжелых), имеет постоянный и гипервариабельный домены. Постоянным доменом антитело фиксируется к Fc-рецептору цитотоксического лимфоцита, а гипервариабельным доменом — к соответствующему антигену. Несмотря на простоту концепции использования моноклональных антител при злокачественных опухолях, проблема пока далека от разрешения, принимая во внимание несколько факторов — иммуногенность мышиных моноклональных антител, гетерогенность опухоли и специфичность антител. Наиболее важными факторами, мешающими эффективному использованию моноклональных антител, являются гетерогенность опухолевой массы и иммуногенность антител. Гетерогенность опухоли означает, что опухолевые клетки могут содержать различные антигены, в то время, как антитела являются высокоспецифичными. Кроме того, вследствие генетической нестабильности в опухолевых клетках часто происходят мутации, в том числе связанные с поверхностными антигенами. В результате часть клеток не подвергается терапевтическому действию данного моноклонального антитела, что не позволяет обеспечивать 100% эффективность [3]. Другим недостатком моноклональных антител является иммуногенность, то есть образование в ответ на их введение нейтрализующих антител. Это происходит у 75% больных при введение чужеродного (чаще всего мышиного) белка. При последующих введениях препарата он немедленно нейтрализуется, что приводит к снижению его эффективности. Одним из направлений повышения эффективности моноклональных антител является снижение их иммуногенности. Для этого были получены химерные и гиперхимерные (очеловеченные) антитела с разным соотношением мышиного и человеческого белка. Химерное антитело содержит 30—35% мышиного и 65—70% человеческого белка, в гиперхимерном антителе содержание человеческого белка достигает 90%, а мышиного только 10%. В результате частота образования нейтрализующих антител в ответ на введение этих модернизированных антител уменьшается с 74% в случае мышиных до 46% — химерных и 4% — гиперхимерных антител [3]. Противоопухолевые иммуноконъюгаты Противоопухолевые иммуноконъюгаты получают путем ковалентного присоединения к моноклональному антителу (соответствующему антигену опухолевой клетки) противоопухолевого препарата или токсина, которые используются при лечении данной формы рака (рис. 1а). К таким агентам относят алкилирующие агенты, антрациклины, алкалоиды барвинка, антифолаты, 5-фторуридин и его производные, митомицин-C. Все они с успехом были присоединены к соответствующему антителу [4—14]. Некоторые опухоли, которые были невосприимчивыми к другой терапии, положительно отреагировали на терапию иммуноконъюгатами, например, рак молочной железы [15], злокачественная меланома [16], рак легкого [11, 17], лимфома [18] и лейкемия [15, 19]. К сожалению, при использовании этой терапии были отмечены опасные для жизни токсические проявления, которые ограничили их широкое клиническое использование. Важным условием является также выбор места связывания антитела и химиотерапевтического агента. Эти связи не должны затрагивать активных групп, отвечающих за связывание противоопухолевого вещества с ферментом, если местом приложения этого лекарства являются ферменты опухолевых клеток. Например, N1 и С2-, С4-аминогруппы метотрексата играют важную роль в связывании этого антиметаболита с опухолевой дигидрофолатредуктазой, поэтому важно избежать связывания этих групп [20, 21] (структурная формула 1).
Связь между антителом и противоопухолевым препаратом должна быть достаточно прочной чтобы не разрушиться во время переноса от места введения к месту действия (опухолевые клетки). Это, соответственно, означает стабильность в крови и других жидкостях тела. Но, поскольку после доставки иммуноконъюгата к месту действия химиотерапевтический агент должен быть свободным, химическая связь между этими двумя объектами должна подвергаться ферментативному расщеплению. В этом плане наиболее удачными будут амидная и сложноэфирная связи, однако последняя связь более уязвима для гидролиза ферментами крови, чем амидная. Если имуноконъюгат будет гидролизоваться преждевременно, то свободный препарат будет поражать как опухолевые, так и здоровые клетки, что приведет к восстановлению уровня токсичности. Использование амидной связи приводит к получению достаточно устойчивых иммуноконъюгатов, благодаря низкой активности амидазы в сыворотке крови, но высокой в лизосомах [1]. Противоопухолевый агент, присоединенный к антителу амидной связью, остается связанным пока иммуноконъюгат не присоединится к поверхностному антигену, и после проникновения комплекса в лизосомы не подвергнется в них действию амидаз или кислой среды (рH~5). После этого свободный препарат может действовать согласно своего механизма [22]. Другим важным моментом при получении иммуноконъюгатов является антигенная специфика. Антитела являются высокоспецифичными веществами и их связывание с антигеном будет происходить только в том случае, если их структура не окажется измененной в результате присоединения химического агента. Однако, белки антител могут подвергнуться существенному конформационному изменению в результате формирования новых ковалентных связей с молекулами препарата. Крупный белок антитела имеет большое число химически активных остатков аминокислот к каждому из которых, очевидно, можно было бы присоединить молекулу противоопухолевого вещества через сложноэфирную или амидную связь, но риск нарушения конформации белка антитела увеличивается с каждой присоединенной молекулой. Это проявляется особенно сильно, если молекулы препарата присоединяются к остаткам аминокислот, которые расположены близко к области связывания антигена. Некоторые антитела могут связывать до 30 молекул препарата [23—25], в то время как другие теряют специфичность при связывании более четырех молекул [26]. Остатки Lys (которые преобладают в катионоактивной форме при pH 7,4) — особенно важные участки для связывания, но если слишком многие из них участвуют в образовании ковалентных связей с химическим агентом, то такой иммуноконъюгат теряет растворимость и инактивируется в результате осаждения. Принимая во внимание эти причины, редко более десяти молекул препарата могут быть связанными с белком антитела [23]. Некоторые противоопухолевые препараты, например, вендесцин, могут снижать активность после присоединения к антителу [27], а другие, например, доксорубицин и даунорубицин, показали высокую активность в связанном состоянии [6, 14, 28]. Снижение активности не всегда является показанием для отказа от использования такого иммуноконъюгата, так как снижение активности можно компенсировать селективностью его действия. Еще одной серьезной проблемой использования иммуноконъюгатов является высокая иммуногенность моноклональных антител. Степень развития иммунного ответа у больных разная и может варьировать от умеренной аллергической реакции до анафилактического шока [29]. Химики и молекулярные биологи стараются преодолеть этот недостаток путем присоединения полиэтиленгликоля или низкомолекулярного декстрана к антителу при полученных методом генной инженерии химерных вариантов антител [30] и антител, полностью оптимизированных для применения у человека (humanized MAbs) [30]. Иммунолипосомы Одним из перспективных направлений в снижения токсичности противоопухолевых препаратов является использование липосом для их транспорта и целенаправленной доставки. Данные последних лет [31—36] подтверждают способность липосом транспортировать лекарственное средство, снижать его общетоксическое действие, увеличивать терапевтический эффект. Эти результаты позволяют надеяться на широкое использование липосом при химиотерапии онкологических больных. Одним из примеров снижения токсичности, в частности гемато- и кардиотоксичности, является включение в липосомы антибиотиков антрациклинового ряда. Кардиотоксичность этих препаратов — один из основных факторов, ограничивающих их применение в клинике, которое зависит от дозы и резко повышается при высоких кумулятивных дозах. В связи с этим включение антибиотиков в липосомы позволяет не только использовать их в полном объеме, но и повысить дозу препарата, уменьшить накопление в сердечной мышце. Кроме того, фосфатидилхолиновые липосомы, вероятно, могут снижать процессы перекисного окисления липидов и уменьшать их непосредственное влияние на митохондрии и ядро миокардиоцитов [37]. Использование липосомальных форм цитостатиков в клинике приводит к снижению побочного действия препаратов (нефро- и кардиотоксичности, уменьшение случаев рвоты, тошноты, алопеции, периферических нейропатий, угнетения иммунной системы [31, 32, 36]). Очевидно, что снижение токсичности инкапсулированных в липосомы цитостатиков определяется изменением их фармакокинетики, а именно взаимодействием двух факторов: скорости выведения из плазмы (клиренсом) липосомального препарата и стабильности соединения липосом с лекарством в кровяном русле. Данный процесс зависит от физико-химических свойств препарата и липосомального носителя, проницаемости отдельных тканей и природы связи между липосомой и лекарственным веществом. Для создания липосомальных форм цитостатиков необходимо использование липосом малой величины, что позволяет уменьшить захват препаратов клетками ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) и увеличить время их циркуляции в кровеносном русле [32, 34]. Недостатком липосомальных форм является их быстрая опсонизация при внутривенном введении и последующий захват клетками РЭС. Для снижения возможности захвата липосом мононуклеарами РЭС были разработаны так называемые липосомы-невидимки. С этой целью в липидный слой липосом встраивают полиэтиленгликоль (ПЭГ), что приводит к повышению осмотического давления вокруг липосом и препятствует их сближению с клеткой (рис. 1б). Эти везикулы называются пегилированными липосомами, они "невидимы" для клеток ретикулоэндотелиальной системы и долгое время циркулируют в крови, что, в свою очередь, приводит к увеличению продолжительности полупериода существования препарата в кровяном русле и медленному проникновению его в опухолевую ткань [38]. Однако пегилированные липосомы имеют существенный недостаток — плохо накапливаются в опухоли. Для улучшения направленной доставки противоопухолевых препаратов было разработано новое поколение лекарственных препаратов — иммунолипосомы. Иммунолипосомы представляют собой липосомы с прикрепленными моноклональными антителами. Моноклональные антитела обеспечивают специфическое связывание липосом с антигенами клеток, а липосомы несут соответствующий химиотерапевтический препарат (рис. 2а). В настоящее время различают три типа иммунолипосом: А, В и C [39]. Иммунолипосомы типа А — моноклональные антитела ковалентно связаны с обычными липосомами посредством короткого якоря; иммунолипосомы типа B — моноклональные антитела ковалентно связаны с пегилированными липосомами посредством короткого якоря; иммунолипососы типа С (Pendant-type PEG-immunoliposomes) — моноклональные антитела прикреплены к дистальному терминальному концу ПЭГ. На примере липосом типа А было показано, что иммунолипосомы более эффективно, чем обычные липосомы, доставляют лекарства в клетки-мишени как in vitro, так и in vivo [40]. Однако связывание иммунолипосом с клетками-мишенями in vivo было более сложным. Изучение in vivo показало, что прикрепление к липосомам антител усиливало их захват клетками РЭС, а эффективность их связывания с клетками-мишенями зависела от плотности антител на поверхности липосом. Явление захвата иммунолипосом клетками РЭС и функционирование эндотелиального барьера, разделяющего сосудистое русло от опухолевой ткани, позволило создать липосомы типа В, которые были стерически стабилизированы и имели удлиненные периоды циркуляции в крови. Прикрепление антител к модифицированным липосомам через короткий якорь не привело к желаемому результату, увеличив лишь только время циркуляции иммунолипосом в крови [41], а взаимодействие с клетками-мишенями было недостаточным [42]. Прикрепление моноклональных антител к дистальным концам цепей ПЭГ, связанным с липосомами (тип С), привело к сохранению способности стерически стабилизированных липосом специфически связываться с клеточной поверхностью клеток-мишеней и быть защищенными от захвата клетками РЭС [43]. Антитела, которые используются при получении иммунолипосом, должны обладать определенными свойствами, например, сохранять свою специфичность при конъюгации с липосомами и обладать низкой иммуногенностью. Для этого используют частично "очеловеченные" и полностью человеческие моноклональные антитела и фрагменты антител. Комплекс антиген-иммунолипосома должен пиницитироваться в опухолевую клетку. Исследованиями на различных опухолевых моделях было доказано, что липосомы диаметром 100—200 нм проходят через сосудистую стенку и накапливаются в опухолевой ткани [44, 45]. Специфическая доставка противоопухолевых препаратов с помощью иммунолипосом увеличивала терапевтический эффект и снижала токсичность по сравнению с обычными липосомами [46]. Это было убедительно продемонстрировано на моделях солидных опухолей у мышей, на ксенотрансплантатах человеческой B-клеточной лимфомы у безволосых мышей [47]. Описано несколько препаратов иммунолипосом, потенциально перспективных для применения в онкологической практике. Они направлены против клеток, экспрессирующих антигены CD71 (рецептор трансферрина), Her2/neu (рецептор эпидермального фактора роста) [48], HLA-DR (антигены гистосовместимости II класса) [49, 50], CD19 (обще-В-клеточный маркер) [47], LL2 (антиген В-клеточной лимфомы) [51] и др. Иммунолипосомы — очень сложная система доставки лекарственных препаратов, зависящая от многих составляющих ее компонентов. В настоящее время все препараты иммунолипосом находятся на стадии доклинического изучения, однако бурное развитие биотехнологии вселяет надежду на то, что они займут достойное место в клинике. ADEPT-терапия Новый метод лечения злокачественных опухолей, основанный на антитело-опосредованной терапии с использованием ферментов и пролекарств (ADEPT) [52, 53]. Сущность его заключается в улучшенной системе направленной терапии опухолей с использованием специфического фермента и пролекарства. В этом случае химиотерапия проводится в 2 этапа. На первом этапе в опухоль вводится комплекс антитело — фермент, который направленно локализуется в опухолевых клетках за счет образования комплекса антиген-антитело. На втором этапе вводится пролекарство (prodrug), являющееся пассивным до тех пор, пока не вступит во взаимодействие с комплексом антител-ферментов. С их помощью данное пролекарство превращается в цитотоксическую форму, которая разрушает опухолевые клетки, не повреждая нормальную ткань (рис. 2б). В ADEPT терапии возможно использование многих ферментов и пролекарств, например b-лактамазы (разрушает b-лактамное кольцо с образованием активных лекарств, таких как паклитаксел или доксорубицин), цитозиндеаминазы (превращает 5-фторцитозин в активный препарат 5-фторурацил) и карбоксипептидазы G2 (CPG2 отщепляет концевую глутаминовую кислоту амидов при образовании производных азотистого иприта). В 1-ой фазе клинических испытаний пациентам с колоректальным раком вводили CPG2, присоединенную к анти-СЕА F(ab')2 (A5B7). Затем пациентам была введена очищенная галактозилированная СPG2, которая увеличивала клиренс конъюгата антитело-фермент из крови. Концентрация фермента в опухоли составляла в среднем 0,47 ед/г, что было достаточным для индуцирования токсического уровня активного лекарства. Концентрация пролекарства для оптимального превращения (Km) должна была составлять 3 мкМ. Наконец, было введено само пролекарство, состоящее из трех синтонов (бензойной кислоты, иприта и глутамата). Превращение пролекарства было доказано путем выявления уровня материнского лекарственного вещества (активного соединения) в плазме крови. Использование пролекарства в клинике дало положительный ответ у одного пациента, а у 6 была отмечена стабилизация процесса, в среднем на протяжении 4 мес после предыдущего прогрессирования опухоли [54]. ADEPT подход селективного введения цитостатиков к опухолевым клеткам может быть использован с пролекарствами производных азотистого иприта [55—57], доксорубицина и даунорубицина [58—60], метотрексата и других ингибиторов тимидилатсинтазы [61—63] и амидалина [64]. Иммунополимеры Биоконъюгаты лекарственных препаратов с биодеградируемыми, растворимыми в воде полимерами, например, гидроксипропилметакриамином (ГПМА), начинают исследоваться в качестве переносчиков (рис. 1в). Как и иммунолипосомы, иммунополимеры могут изменять фармакокинетику и распределение связанных препаратов. Для их дальнейшего биологического действия необходимо высвобождение препаратов из комплеса с полимером, поэтому в качестве биодеградируемых связывающих мостиков между полимером и лекарственным препаратом используется, например, тетрапептид Gly-Phe-Leu-Gly, который разрушается катепсином В в лизосомах клетки после пиноцитического захвата иммунополимера [2]. Случайное связывание моноклональных антител с полимерами может привести к снижению активности антител, поэтому был предложен новый подход, в котором фрагменты метакриламид-Fab с полиэтиленгликолевым мостиком были сополимеризованы с ГПМА и лекарственным препаратом с деградируемым пептидным мостиком [65]. Были изучены различные варианты направленного введения, включающие использование Fab моноклонального антитела ОА-3 в отношения рака яичника и лектинов [65]. На 1 и 2 стадиях клинического изучения в настоящее время находится галактозомин-направленный ГПМА-полимерный доксурубицин, содержащий в своей структуре тетраид Gly — Phe — Ieu — Gly — в качестве связывающего мостика (структурная формула 2).
Это пока единственный полимерный конъюгат, который исследуется в клинике. Вводился он внутривенно каждые три недели. Максимально допустимая доза составляла 160 мг/м2. С помощью гамма-камеры было показано наличие в печени 15—20% введенной дозы через 24 ч после введения. Несмотря на то, что большинство конъюгированного препарата было локализовано в нормальных гепатоцитах, оценка показала, что концентрация доксорубицина в клетках гепатомы была в 12—50 раз выше, чем при введение свободного препарата [66—68]. Значительный интерес представляет использование полимерных конъюгатов паклитаксела и камптотецина, в свободном виде плохо растворимые и вызывающие значительные побочные эффекты. Для использования в клинике
Он содержал 37% по массе паклитаксела, связанного сложноэфирной связью с g-полиглутаминовой кислотой (40000 г/моль). Полиглутаминовая кислота — первый биодеградируемый полимер, использующийся для получения такого рода конъюгатов; он подвергается деградации катепсином В с высвобождением диглутамил-паклитаксела [70]. При внутривенном введении в течение 30 минут каждые три недели максимально допустимая доза составила 266 мг/м2. В этих исследованиях у значительной части больных произошло частичное улучшение или стабилизация болезни (мезотелиома, почечная карцинома). Недавно была предложена новая лекарственная терапия, сочетающая ADEPT и комплекс полимер-лекарственный препарат, и называемая PDEPT (полимернаправленная фермент-пролекарственная терапия) [71]. В качестве эксперимента ГПМА-сополимер-Gly-Phe-Leu-Gly-доксорубицин (пролекарство) был введен и локализован в меланоме мышей. Это явилось следствием введения ГПМА сополимера, связанного с ферментом — катепсином В, который был причиной быстрого увеличения скорости высвобождения доксорубицина в пределах опухоли. Возможно использование сочетанного введения ГПМА-сополимер-Gly-Gly-b-лактамаза и ГПМА-сополимер-Gly-Gly-цефалоспорин-доксорубицин [72]. PDEPT приводит к умеренному увеличению продолжительности жизни, что сравнимо с действием свободного пролекарства. Предварительное введение целевого фермента значительно увеличивает терапевтический эффект такой комбинации. Использование подобным же образом конъюгатов ГПМА-сополимер-фосфолипаза С приводит к быстрому высвобождению лекарств из липосом и носит название "полимер-фермент липосомная терапия", что создает новые перспективы для комбинированной химиотерапии [73]. Представленные результаты свидетельствуют о том, что с помощью химической (пролекарства) и физической (липосомы) доставки широко используемых цитостатиков в опухолевую ткань можно в значительной степени снизить их побочное (токсическое) действие. Литература |