ИЗМЕНЕНИЯ ПРОДУКЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В СЕМЕННИКАХ БЕЛЫХ КРЫС В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НИТРАТОМ НАТРИЯ

Украинская медицинская стоматологическая академия

Активация процессов свободно-радикального окисления считается важным механизмом, определяющим гонадотоксическое действие химических соединений [3, 4].

Спонтанная продукция активных форм кислорода тканями семенников и сперматозоидами поддерживается в норме на низком уровне антиоксидантной системой [5, 6]. При воздействии различных фармакологических и токсических агентов выработка кислородных радикалов может изменяться в широких пределах [4, 6]. В то же время источники продукции активных форм кислорода в семенниках млекопитающих при избыточном поступлении в организм нитратов изучены недостаточно.

Целью исследования было изучение продукции супероксидного анион-радикала микросомальной, митохондриальной и лейкоцитарной электронно-транспортными цепями в тканях семенников при хронической интоксикации нитратом натрия.

Материалы и методы исследования

Исследования были проведены на 25 белых крысах-самцах линии Вистар в 5 сериях опытов. В 1 серии необходимые показатели изучали у интактных животных (контроль); во 2, 3, 4 и 5 сериях — после введения нитрата натрия через специальный зонд интрагастрально в дозе 200 мг/кг в течение, соответственно, 2 недель, 1, 3 и 6 месяцев. Белых крыс декапитировали под эфирным наркозом.

Образование супероксидного анион-радикала оценивали при проведении теста с нитросиним тетразолием (НСТ) [5]. При этом спектрофотометрическим НСТ-тестом оценивается продукция супероксида в гомогенате тканях семенников с индукторами в виде НАДН, НАДФН и бактериальными липополисахаридами. Для этого 0,1 г ткани гомогенизировали в 0,9 мл изотонического (pH 7,4) фосфатного буфера. Отбирали по 0,05 мл гомогената в 4 пробирки (а, б, в, г). Добавляли в пробирки и перемешивали: а) 0,05 мл буферного раствора (для определения общей фоновой нестимулированной активности); б) 0,05 мл 3% раствора НАДФН (для оценки продукции супероксидного анион-радикала микросомальной электронно-транспортной цепью); в) 0,05 мл 3% раствора НАДН (для оценки продукции супероксидного анион-радикала митохондриальной электронно-транспортной цепью); г) 0,05 мл тритона Х-100 до конечной концентрации 0,1%, взбалтывали 2 мин. Перемешивали и преинкубировали при 37°С: 10 мин — пробирки б и в, 30 мин — пробирки а и г. В пробирку г добавляли 0,1 мл ампульного препарата бактериального липополисахарида (пирогенал) для оценки продукции супероксидного анион-радикала фагоцитами. Для этого добавляли по 0,05 мл НСТ на буфере, перемешивали. Инкубировали при 37°С: а и г — 30 мин, б и в — 5 мин. Добавляли 2,0 мл растворителя (хлороформ и диметилсульфоксид в соотношении 1:2 по объему) и взбалтывали 1 мин. Центрифугировали 5 мин при 1500 об./мин. Отбирали окрашенный надосадочный слой. Фотометрировали 1,0 мл верхнего слоя против соответствующего контроля при оптимальной длине волны 540 нм на микроФЭКе МКМФ-1 с ходом луча 0,5 см и объемом 1 мл. Контроль: набирали в 4 пробирки 0,05 мл буфера + 0,05 мл воды + 0,05 мл НСТ и добавляли в пробирки: а) 0,05 мл воды; б) 0,05 мл НАДФН; в) 0,05 мл НАДН; г) 0,05 мл тритона Х-10 + 0,1 мл пирогенала инкубировали 10 и 30 мин при 37°С и также элюировали окраску. Сами НАДФН, НАДН, пирогенал не восстанавливают НСТ. Поскольку по реакции 1 моль НСТ восстанавливается 2 молями супероксидного анион-радикала, то для расчета строили стандартный график по экстинции диформазана (0,01—0,2 мл 0,2% НСТ восстанавливали смесью 0,1 мл 0,1 н KOH и 0,1 мл раствора аскорбиновой кислоты — 18 мг/10 мл). Инкубировали, диформазан элюировали 2 мл растворителя и фотометрировали. Учитывая разведение, соотношение компонентов в реакции, экстинцию стандарта по графику проводили расчет:

для а и г: Е х 11,11 = нмоль/г х с

для б и в: Е х 66,67 = нмоль/г х с

Полученные данные обработаны вариационно-статистическим методом с использованием критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Через 2 недели после начала введения в организм белых крыс нитрата натрия отмечается достоверное возрастание общего фона продукции супероксидного анион-радикала (таблица) — на 36,1% (p<0,05) — и его выработки митохондриальной электронно-транспортной цепью (на 32,2%, p<0,02).

Возрастание продукции супероксидного анион-радикала митохондриальной электронно-транспортной цепью (на 23,2%, p<0,05) наблюдается и через 1 мес после начала введения в организм белых крыс нитрата натрия.

После 3-месячного введения нитрата натрия отмечается существенное повышение как общего фона продукции супероксидного анион-радикала (на 58,3%; p<0,001) и его выработки митохондриальной электронно-транспортной цепью (на 41,1%, p<0,01), так и возрастание продукции ^•О₂^- микросомальной электронно-транспортной цепью (на 33,7%, p<0,01). Выработка ^•О₂^- при использовании в качестве стимулятора пирогенала, позволяющая оценить вклад НАДФН-оксидазной системы лейкоцитов в процесс продукции АФК [5], при исследовании на 14, 30 и 90 сут интоксикации нитратом натрия достоверно не отличается от данных контрольной серии.

После 6-месячного введения нитрата натрия рост общего фона продукции супероксидного анион-радикала, его выработки митохондриальной и микросомальной электронно-транспортными цепями нарастает и достоверно превышает данные контрольной серии, соответственно, на 69,4; 44,6 и 47,6%. В отличие от более ранних сроков наблюдения, после 6-месячного введения нитрата натрия отмечается достоверное снижение (на 25,9%) выработки ^•О₂^- при использовании в качестве стимулятора пирогенала, что свидетельствует об ограничении в этот период функциональной активности НАДФН-оксидазы лейкоцитов.

Известно, что активация НАДФН-оксидазного комплекса в лейкоцитах требует ГТФ-связывающего белка Gox, причем для регенерации ГТФ необходим АТФ [1]. Ранее нами показано, что в динамике хронической интоксикации нитратом натрия в тканях семенников развивается тяжелая биоэнергетическая недостаточность [2], что может обусловливать ограничение функциональной активности электронно-транспортной цепи лейкоцитов.

Супероксидный анион-радикал, вырабатываемый митохондриальной и микросомальной электронно-транспортными цепями, а также другие образующиеся в динамике хронической нитратной интоксикации активные формы кислорода способны индуцировать и продолжать цепь свободно-радикального окисления [9, 10]. Следует отметить, что как супероксидный анион-радикал, так и гидроксильный и гидропероксильный радикалы могут образовываться в больших концентрациях в организме млекопитающих также при окислении нитратами и нитритами дезоксигемоглоглобина и миоглобина [7, 8].

Таким образом, в динамике хронической интоксикации нитратом натрия в тканях семенников белых крыс отмечается погрессирующее увеличение общего фона продукции супероксидного анион-радикала и его выработки митохондриальной и микросомальной электронно-транспортными цепями. После 6-месячного введения нитрата натрия продукция супероксидного анион-радикала НАДФН-оксидазой лейкоцитов существенно снижается.

Литература
1. Глоба А.Г., Демидова В.С., Темяков В.Г. Синтез плазмамембранного сигнального АТФ нейтрофилами, активированными формилпептидом, при клинической и экспериментальной инфекции; связь с продукцией супероксида // Биохимические проблемы хирургии. —М., 1991. —С. 222—232.
2. Денисенко С.В., Бондаренко В.В., Глебова Л.Ю. Влияние токсических доз нитратов на окислительные и энергетические процессы // Тези доп. І з'їзду токсикологів України. —К., 2001. —С. 94—95.
3. Мудрый И.В., Петрова Р.П., Раецкая Е.В., Рыбчинская И.Я. Изучение эмбриотоксического и тератогенного воздействия сульфонала, свинца и нитратов на организм белых крыс при их раздельном и комбинированном введении // Гигиена и санитария. —1993. —№4. —С. 51—72.
4. Почерняева В.Ф. Експериментальне обгрунтування застосування антиоксидантів як гонадопротекторів: Автореф. дис. …д-ра мед.наук. —К., 1997. —40 с.
5. Цебржинский О.И. Дифференцированное спектрофотометрическое определение продукции супероксида в тканях НСТ-тестом // Актуальні проблеми сучасної медицини: Вісн. Української мед. стоматол. академії. —2002. —Т. 2, №1. —C. 96—97.
6. Цебржинський О.І. Оксидативна активність у сперматозоїдах // Фізіол. журн. —2000. —Т. 46, №4. —C. 71—75.
7. Шугалей И.В., Целинский И.В., Малинина Т.В. О токсическом действии нитрита натрия // Гигиена и санитария. —1991. —№4. —С. 49—53.
8. Jung F., Lassmann G., Ebert B. Detection paramagnetic species in the autocatalytic reaction between hemoglobin and nitrite // Stud. biophysica. —1981. —V. 85, №2. —P. 139—142.
9. Sies H. Oxidative stress. —San Diego CA., 1985. —320 p.
10. Sies H., de Groot H. Role of reactive oxygen species in cell toxicity // Toxicol. Lett. —1992. —№64—65. —P. 547—551.

| Зміст |