УДК 615.9: 615.281

Л.Г. Бережна, В.М. Коваленко, д.б.н., Г.М. Шаяхметова к.б.н., А.К. Вороніна, к.б.н., О.С. Волошина, к.б.н.

ГЕПАТОПРОТЕКТОРНИЙ ЕФЕКТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПОЛІВІТАМІННОЇ КОМПОЗИЦІЇ ЗА УМОВ ІНДУКЦІЇ ЦИТОХРОМУ Р450 2Е1 ІЗОНІАЗИДОМ І РИФАМПІЦИНОМ

Інститут фармакології та токсикології АМН України, м. Київ

Ізоніазид та рифампіцин на сьогоднішній день є препаратами, які широко застосовуються у комплексній терапії туберкульозу, захворювання, яке, починаючи з 1995 р., набуло в Україні розмірів епідемії [1]. Нажаль, ці препарати мають велику кількість побічних ефектів, серед яких не останнє місце займає токсична дія на печінку. Вважається, що гепатотоксичність ізоніазиду обумовлена впливом на печінку його метаболітів, які утворюються в результаті мікросомного шляху перетворень препарату за участю цитохрому Р-450 2Е1 [2]. Рифампіцин, що є потужним індуктором цитохромів, може значно посилювати токсичний вплив ізоніазиду на печінку, і це часто призводить до порушення її структурно-функціональних властивостей та, як наслідок, до виникнення некрозів, стеатозу та гепатиту [3]. Ризик розвитку цих станів зростає у осіб із захворюваннями печінки, хворих на алкоголізм та літніх людей [4, 5]. Тому актуальною є проблема дослідження механізмів токсичного впливу протитуберкульозних препаратів на печінку та пошук засобів, здатних зменшити їх гепатотоксичну дію.

Метою роботи було дослідити вплив експериментальної полівітамінної композиції метаболічної дії (МВ) на деякі біохімічні показники печінки та сироватки крові щурів за умов сумісного введення ізоніазиду та рифампіцину. МВ, за результатами наших попередніх досліджень [6], здатна значною мірою знижувати активність залежних від цитохрому Р-450 2Е1 мікросомальних ферментів.

Матеріали і методи дослідження

Дослідження проведені на білих щурах-самцях лінії Вістар масою тіла 160—200 г, розведених у віварії Інституту фармакології та токсикології АМН України. Тварин утримували в стандартних умовах харчового та водного режимів.

Щурів було розподілено на три групи, по 6 тварин у кожній: перша — інтактна; щурам другої (контроль) та третьої груп протягом 28 діб внутрішньошлунково за допомогою металевого зонду вводили ізоніазид та рифампіцин відповідно у дозах 50 мг/кг і 86 мг/кг маси тіла. Вказані дози протитуберкульозних препаратів були розраховані, виходячи з даних про їх застосування в клініці з урахуванням коефіцієнту видової чутливості [7, 8]. Тваринам третьої групи протягом 28 діб за годину до введення туберкулостатиків внутрішньошлунково вводили МВ у дозі 50 мг/кг. Через 24 год після останнього введення препаратів тварин знеживлювали методом цервікальної дислокації. Перед цим відбирали кров зі стегнової вени під легким ефірним наркозом. Печінку відмивали через воротну вену охолодженим 0,15 М розчином КСl та гомогенізували в 0,05 М трис-НСl буфері (рН 7,4), який містив 0,025 М сахарози, 0,005 М MgCl₂, 0,008 М CaCl₂, та 0,025 М KCl. Отримували мікросомну фракцію за методом [9] і досліджували вміст цитохромів P-450 [10], n-нітрофенолгідроксилазну активність [11], швидкість НАДФН-залежного накопичення продуктів реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) [12] та білок у мікросомній фракції печінки [13]. Усі процедури виконували з дотриманням холодового режиму (+4°С). У сироватці крові визначали концентрацію білірубіну і аланін- та аспартатамінотрансферазну активність, використовуючи біотести НПП "Филисит-Диагностика" (Україна).

Одержані дані обробляли згідно загальноприйнятим методам варіаційної статистики. Розрахунки проводили за програмами Microsoft Excel, вірогідність змін оцінювали за t-критерієм Стьюдента, вважаючи їх вірогідними при р<0,05.

Результати та їх обговорення

Згідно з даними табл. 1, внутрішньошлункове введення ізоніазиду та рифампіцину щурам у дозах відповідно 50 мг/кг та 86 мг/кг протягом 28 діб призводило до підвищення загального вмісту цитохромів Р-450 у 1,3 рази та значного, майже у 2,5 рази, підвищення активності маркерного ферменту цитохрому Р-450 2Е1 n-нітрофенолгідроксилази, порівняно з інтактними тваринами. Це свідчить про індукцію цитохромів Р-450, в першу чергу ізоформи 2Е1, ізоніазидом і рифампіцином [14], що збільшує ризик пошкодження гепатоцитів токсичними метаболітами туберкулостатиків. Зокрема, відомо, що мікросомне гідроксилювання за участю цитохрому Р-450 2Е1 одного з інтермедіатів біотрансформації ізоніазиду — ацетилгідразину, веде до утворення ацетил-радикалу та ацетил-карбонієвого іону, здатних ковалентно зв'язуватися з білками клітин печінки, викликаючи їхній некроз [15].

Уведення одночасно з ізоніазидом та рифампіцином МВ у дозі 50 мг/кг сприяло зниженню вмісту цитохрому Р-450 до рівня інтактних тварин, а активність n-нітрофенолгідроксилази зменшувалась майже у 1,5 рази порівняно з контролем (табл. 1). Тобто, композиція здатна значною мірою запобігати індукції цитохрому p-450 2Е1, а отже і обмеженню утворення реактивних продуктів мікросомного гідроксилювання.

Вивчення стану процесів ПОЛ в мікросомній фракції печінки щурів показало, що сумісне застосування ізоніазиду та рифампіцину викликало зростання швидкості НАДФН-залежного утворення ТБК-реактантів (на 66%) порівняно з інтактною групою (табл. 1). Це може бути результатом активації цитохром Р-450 2Е1-залежного гідроксилювання, що, як відомо, супроводжується значним утворенням активних форм кисню — промоторів ПОЛ [16].

Уведення щурам на фоні протитуберкульозних препаратів дослідної полівітамінної композиції знижувало швидкість НАДФН-залежного ПОЛ на 45% порівняно з контрольною групою (табл. 1), що може свідчити про антиоксидантну активність МВ.

Результати вивчення впливу ізоніазиду та рифампіцину на амінотрансферазну активність та рівень білірубіну в сироватці крові щурів представлено в табл. 2.

Згідно з наведеними даними, активність аланін- та аспартатамінотрансферази в сироватці крові щурів контрольної групи зменшувалась порівняно з інтактними тваринами відповідно на 22% та 15%. Таке зниження активності амінотрансфераз можна пояснити здатністю ізоніазиду за умов тривалого введення призводити до вичерпання депо піридоксальфосфату (коферменту амінотрансфераз) в результаті утворення неактивного гідразонового комплексу [17]. При цьому концентрація білірубіну в сироватці крові тварин, які отримували ізоніазид і рифампіцин, зростала майже в 6,5 раз порівняно з інтактними, що узгоджується з даними літератури про здатність цих туберкулостатиків викликати білірубінемію [18]. Введення композиції МВ на фоні туберкулостатиків сприяло нормалізації активності амінотрансфераз та значно зменшувало вміст білірубіну в сироватці крові щурів.

Висновок

Застосування експериментальної полівітамінної композиції на фоні сумісного введення ізоніазиду та рифампіцину справляє коригуючий вплив на показники, які характеризують стан монооксигеназної системи та процесів ПОЛ у печінці, нормалізує активність трансаміназ в сироватці крові дослідних тварин. Це свідчить про гепатопротекторну дію МВ, яка, імовірно, реалізується за рахунок здатності композиції обмежувати індукцію цитохрому Р-450 2Е1 зі зменшенням інтенсивності утворення високореактивних інтермедіатів та процесів вільнорадикального окислення.

Література
1. Фещенко Ю. Ситуация с туберкульозом в Украине // Doctor. —2002. —№4. —С. 11—13.
2. Кукес В.Г., Фисенко В.П. Метаболизм лекарственных препаратов. —Москва: ПАЛЕЯ-М, 1997. —С. 131.
3. Скакун Н.П., Табачук О.Е. Сравнительное действие изониазида, рифампицина и этамбутола на функциональное состояние печени. // Эксперим. и клин. фармакол. —1992. —Т. 55, №2. —С. 45—47.
4. Лоуренс Д.Р., Бенитт П.Н. Клиническая фармакология: Пер. с англ. в 2 томах. —М.: Медицина, 1993. —Т. 1. —639 с.
5. Альберт А. Избирательная токсичность. Физико-химические основы терапии: Пер. с англ. в 2 томах. —М.: Медицина, 1989. —Т. 2. —427 с.
6. Коваленко В.М., Вороніна А.К., Шаяхметова Г.М. та ін. Вплив експериментальної полівітамінної композиції на процеси детоксикації ізоніазиду в печінці щурів за умов його тривалої дії // Експериментальна і клінічна медицина —2004. —№1. —С. 20—24.
7. Петренко В.М. Лечение больных туберкулезом // Doctor. —2002. —№4. —С. 25—28.
8. Рыболовлев Ю.Р., Рыболовлев Р.С. Дозирование веществ для млекопитающих по константам биологической активности // Доклады АН СССР. —1979. —№6. —С. 1513—1516.
9. Kamath S.A., Kummerow F.A., Ananth K. A simple procedure for the isolation of rat liver microsomes // F. Letters. —1971. —V. 17, №1. —P. 90—92.
10. Omura T., Sato R. The carbon monooxidate-binding pigment of liver microsomes // J. Biol. Chem. —1964. —V. 239. —P. 2379—2385.
11. Koop D. R. Inhibition of ethanol-inducible cуtochrome P450IIE1 by 3- amino-1,2,4-triasole // Chem. Res. Toxicol. —1990. —№3. —P. 377—383.
12. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты. Современные методы в биологии / под ред. В.Н. Ореховича. —Москва, 1977. —С. 66—68.
13. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Raudall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. —1951. —V. 193. —P. 265—275.
14. Wolf C. R. The Gerhard Zbinden memorial lecture "Application of biochemical and genetic approaches to understanding pathways of chemical toxicity" // Tox. Let. —2002. —V. 127. —P. 3—17.
15. Timbrel J.A. Principles of Biochemical Toxicology. —London: Taylor&Francis, 1991. —415 p.
16. Nelson S. D. Role of metabolic activation in chemical -induced tissue injury / Symposium Drug Metabolism Concepts, American Chemical Society. —Washington, 1977. —P. 155.
17. Губський Ю.І., Гайова Л.В., Бобкова Л.С. Молекулярне моделювання впливу ізоніазиду на біохімічну дію вітаміну В₆ в організмі // Мед. хім. —2004. —Т. 6, №3. —С. 8—13.
18. Dollery C. Therapeutic Drug. —Edinburgh, Churchill Livingstone, 1999. —2670 p.