ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ СТАНУ ГЕНЕРАТИВНОЇ ФУНКЦІЇ ЩУРІВ ПІД ВПЛИВОМ ЕСТРАЗИНУ

Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України, м. Харків

Створення нових вітчизняних препаратів для лікування раку передміхурової залози (РПЗ) є актуальною проблемою сучасної медицини, що обумовлено розповсюдженістю даного захворювання серед чоловіків. Частота РПЗ різко зростає в похилому віці — так, більше 50% хворих мають середній вік понад 65 років [1]. Для лікування РПЗ використовують хірургічний, гормональний, променевий та комбінований методи. Відомо, що РПЗ є гормонозалежною пухлиною і, як правило, діагностується в 60—70% випадків на третій стадії, в зв'язку з чим для лікування такого контингенту хворих застосовують гормонотерапію, яка основана на пригніченні андрогенної активності введенням в організм естрогенів або антиандрогенів.

В Інституті проблем ендокринної патології синтезовано нову оригінальну сполуку естрогенного ряду — естразин (3-окси-естра-1,3,5-трієн-17-гідразон), що призначена для лікування РПЗ. Естразин є похідним природного гормону естрона, модифікуючий фрагмент — гідразонове групування. Виявлено високий та тривалий протипухлинний ефект естразину в експериментах на тваринах із гормонально-залежними пухлинами: пухлини яєчників мишей, індуковані за методикою Біскінд, спонтанні андрогензалежні аденоми періанальних залоз собак [2], аденокарциноми передміхурової залози R3327-H у щурів [3]. Стероїдні естрогенні гормони, до яких належить естразин, мають надзвичайно високу біологічну активність. Вони чинять виражену гонадотропну дію за рахунок порушення гормонального гомеостазу як в жіночому, так і в чоловічому організмі. Для сполук даного ряду властива добра розчинність в ліпідах та органічних розчинниках, що визначає високу здатність естрогенів проникати через непошкоджені шкірні покриви [4].

В теперішній час естразин проходить ІІ фазу клінічних випробувань, планується налагодити його промисловий випуск в Україні.

В умовах виробництва гормональних протипухлинних засобів існує реальна загроза їх несприятливого впливу на організм працюючих. Причому шляхи надходження сполук до організму можуть бути різні: пероральний, інгаляційний та через шкіру.

Метою роботи стало вивчення стану генеративної функції щурів обох статей при різних шляхах надходження естразину до організму для його гігієнічного регламентування у повітрі робочої зони.

Матеріали та методи дослідження

Експерименти поставлені на статевозрілих самцях та самицях нелінійних білих щурів, які утримувались на стандартному харчовому раціоні [5].

Для вивчення здатності естразину впливати на генеративну функцію щурів-самиць тварин було поділено на 3 групи. І групі сполуку наносили на ділянку оголеної шкіри розміром 4х4 см² на протязі 20 діб в дозі 20 мг/кг, ІІ групі — в дозі 100 мг/кг, ІІІ група була контрольною. Показники оцінювали в динаміці: до експерименту, після 20 аплікацій та в період післядії (1 місяць після закінчення нанесення сполуки). Естральний цикл вивчали за змінами цитологічної картини вагінальних мазків. Вивчення стану гонадотропної функції гіпофізу проводили методом біологічного тестування на інфантільних щурах-самицях [6]. Концентрацію статевих гормонів (прогестерона та естрадіола) в периферійній крові визначали радіоімунологічним методом за допомогою відповідних комерційних наборів.

Для оцінки епікутанного впливу естразину на генеративну функцію щурів-самців сполуку наносили на шкіру в дозі 20 мг/кг на протязі 72 діб. Дослідження показників проводили в динаміці: через 48 діб, через 72 доби, а також в період післядії (72 доби після закінчення нанесення естразину).

Вивчення здатності естразину впливати на генеративну функцію при інгаляційному надходженні проводили на щурах-самцях в умовах чотирьохгодинної експозиції в камерах конструкції Боярчука за такими концентраціями — (11,9±1,8) мг/м³, (3,6±1,0) мг/м³ та (0,83±0,11) мг/м³.

У щурів-самців визначали коефіцієнти маси сім'яників, сім'яних міхурців, передміхурової залози та функціональний стан сперматозоїдів [6].

По закінченні експериментів тварин під наркозом декапітували, їхні внутрішні органи піддавали макроскопічному та гістологічному дослідженню.

Отримані дані піддані статистичній обробці параметричними методами (статистичні програми пакету Excel, версія 7.0) із застосуванням t критерію Стьюдента та визначенням вірогідності різниці (Р).

Результати та їх обговорення

В результаті експериментів встановлено, що кількість нормально циклюючих щурів-самиць зменшувалась із збільшенням тривалості експерименту у тварин всіх груп. Зокрема, після 20 аплікацій кількість циклюючих самиць в І групі була 50%, у ІІ групі — 45% при 87% в контролі. В період післядії в І групі лише 37% самиць мали естральний цикл, в ІІ групі — 67%, в контролі — 75%.

Вплив сполуки на генеративну функцію також проявився змінами тривалості та фазової структури естрального циклу. У тварин обох дослідних груп збільшувалась тривалість тічки (проеструс+еструс) та зменшувався час міжтічки (метаеструс+діеструс), при цьому тічка переважала над міжтічкою. Тривалість естрального циклу у щурів ІІ групи зменшувалась. В період післядії у цієї групи тварин не відбулось нормалізації даних показників (табл. 1).

Для з'ясування механізму реалізації дії естразину на репродуктивну функцію проводили гормональні дослідження. Визначали сумарну гонадотропну активність, котра, як відомо, за механізмом негативного зворотнього зв'язку реагує на рівень естрогену в організмі. В даній постановці експерименту естразин пригнічував гонадотропну функцію гіпофізу. Показником цього було вірогідне зниження коефіцієнту маси матково-яєчникового комплексу у інфантільних щурів-самиць, які отримували гіпофізарну емульсію від тварин обох дослідних груп (І група — 2,42±0,30, ІІ група — 3,17±0,45), у порівнянні з контролем (4,97±0,25), якому вводили гіпофізарну емульсію від контрольних тварин. В період післядії відбулось відновлення даного показника.

У тварин при нанесенні сполуки в обох дозах зафіксовано зниження рівня прогестерону. В період післядії цей показник нормалізувався. Рівень естрадіолу не змінювався на протязі всього експерименту, однак, співвідношення між прогестероном та естрадіолом було на користь останнього, чим, певно, пояснюються зміни в структурі естрального циклу.

Маса тіла щурів обох груп після 20 аплікацій була вірогідно нижча, ніж в контролі (І група — 155,8±4,0 г, ІІ група — 148,9±6,0 г, контроль — 174,4±7,0 г). В період післядії в ІІ групі не відбулось відновлення даного показника. Коефіцієнти маси матки після 20-разового нанесення сполуки вірогідно збільшувались.

Вивчення гістологічної будови матки показало, що у самиць І групи після 20 аплікацій естразину спостерігається виразне збудження секреторного епітелію та розростання секреторних залоз в товщу складчастого ендометрію; секреторна активність залоз була дуже виразна. Ще більші ознаки естрогензалежного збудження зафіксовано у тварин ІІ групи, у яких розростаючись залози досягали міометрію, вони розгалужені, заповнені великою кількістю секрета. У деяких тварин цієї групи секреторна активність ендометрію настільки велика, що секрет переповнював роги та тіло матки, розгладжуючи складки ендометрію та здавлюючи його.

В період післядії у тварин обох груп мала місце регресія збудження секреторної активності епітеліальних клітин: товщина епітеліального шару та ендометрію взагалі зменшувалась, епітелій ставав одношаровим, ворсинчасті клітини превалювали над слизовими, сполучна тканина в глибоких прошарках ендометрію ставала більш щільною. В цілому матка дослідних тварин набувала стану, притаманного для контрольних.

Гістологічне дослідження яєчників щурів І групи після впливу естразину показало наявність ознак активного перебігу росту великої кількості овоцитів: у корковому шарі знаходились всі форми стадії росту овоциту; в деяких місцях спостерігався вихід овоцитів із міхурця; жовтих тіл у цих тварин небагато, медулярна частина органу без особливостей. У ІІ групі відмічали як зростання кількості овоцитів, які вступають у стадію росту, так і їх атрезію.

В період післядії в яєчниках самиць обох дослідних груп спостерігали зниження активності процесів дозрівання нової генерації фолікулів.

Таким чином, дослідження гістоструктури яєчників та матки щурів після нашкірних аплікацій естразину свідчать про виразний естрогенізуючий ефект сполуки на органи жіночої репродуктивної системи.

У щурів-самців після 48 аплікацій естразину зафіксовані зміни функціонального стану сперматозоїдів, а саме, вірогідне зменшення кількості сперматозоїдів, часу рухомості та збільшення мертвих форм (табл. 2). Коефіцієнти маси сім'яників, сім'яних міхурців та передміхурової залози були вірогідно зменшені (табл. 3). У 67% тварин спостерігали азооспермію. Гістологічні дослідження сім'яників дослідних щурів показали, що діаметри поперечних зрізів сім'яних канальців значно менші, ніж в контролі, клітинний склад канальців дуже збіднений — спостерігалась незначна кількість сперматогоній та клітин Сертолі, подекуди в канальцях мав місце клітинний детрит. Таким чином, у цих тварин під впливом естразину відбувалось сильне пригнічення сперматогенезу. Ендокринна функція сім'яників теж була знижена, оскільки клітини Лейдіга спостерігались рідко, а форма у них була неправильна, ядра деформовані.

Після 72 аплікацій зміни даних показників мали більш виражений характер. Азооспермію спостерігали у 78% щурів. Гістологічні дослідження сім'яників свідчили, що діаметри перетинів сім'яних канальців дуже малі, а в самих канальцях знаходиться мало клітин. Це поодинокі сперматогонії та клітини Сертолі. Сполучнотканинні прошарки між канальцями потовщені, склеротично ущільнені, часто спостерігався амілоїд. Клітин Лейдіга мало, їх ядра сильно забарвлені гематоксиліном, що свідчить про зниження функції клітин. Описані вище особливості гістоструктури сім'яників у тварин, котрі отримували естразин, свідчать про наявність у сполуки виразних антиандрогенних властивостей.

В період післядії відбулась нормалізація тільки коефіцієнту маси сім'яників. Їх мікробудова теж практично не відрізнялась від структури контрольних. Мало місце потовщення зовнішньої оболонки сім'яників та прошарки амілоїду в інтерстиції. Але зміни функціонального стану сперматозоїдів збереглись — час рухомості сперматозоїдів був вірогідно нижче, ніж у контрольних тварин, кількість сперматозоїдів мала тенденцію до зменшення, кількість мертвих та патологічних форм — до збільшення (табл. 2).

При одноразовому інгаляційному надходженні до організму естразин також впливав на генеративну функцію щурів-самців. Так, при надходженні в концентрації 11,9 мг/м³ у тварин зафіксовано вірогідне зменшення коефіцієнту маси сім'яних міхурців до 1,13±0,14 при 1,55±0,13 в контролі. Також відмічено дозозалежне зниження часу рухомості сперматозоїдів при концентрації естразину 11,9 мг/м³ даний показник дорівнював 137,6±11,3 хв при 191,8±17,4 хв в контролі (p<0,05). При концентрації 3,6 мг/м³ час рухомості складав 218,0±11,1 хв, а в контролі — 254,4±7,3 хв (p<0,05). При найменшій з випробуваних концентрацій естразину (0,83 мг/м³) зафіксована тенденція до зменшення часу рухомості сперматозоїдів.

Таким чином, встановлено негативний вплив естразину на генеративну функцію щурів обох статей при епікутанному та інгаляційному шляхах надходження, які найбільш можливі у виробництві. Це дозволяє прогнозувати його несприятливу дію на працюючих. Дані досліджень дозволили провести гігієнічне регламентування у повітрі робочої зони за принципом повного виключення контакту працюючих із естразином.

Висновки

1. За умов епікутанного надходження вплив естразину на генеративну функцію щурів-самиць проявився змінами тривалості та фазової структури естрального циклу, пригніченням гонадотропної функції гіпофізу, зниженням рівня прогестерону, зміною морфоструктури матки та яєчників.

2. При нанесенні на шкіру естразину у щурів-самців спостерігались негативні зміни функціонального стану сперматозоїдів, зменшення коефіцієнтів маси сім'яників, сім'яних міхурців та передміхурової залози, порушення гістоструктури сім'яників.

3. Одноразове інгаляційне надходження естразину у щурів-самців знижує час рухомості сперматозоїдів та зменшує коефіцієнт маси сім'яних міхурців.

4. Враховуючи здатність естразину впливати на генеративну функцію при різних шляхах надходження до організму, контакт працюючих із сполукою в умовах виробництва забороняється.

Література
1. Портной А.С., Гродзовская Ф.Л. Рак и аденома предстательной железы. —Л.: Медицина, 1984. —272 с.
2. Эстразин —новый противоопухолевый препарат адресованного действия / З.С. Смирнова, Н.Д. Лагова, В.Н. Киселев и др. // Вестник ОНЦ АМН России. —1996. —№3. —С. 24—27.
3. Оценка противоопухолевой эффективности эстразина на модели аденокарциномы предстательной железы крыс / З.С. Смирнова, Т.Ф. Кулагина, И.П. Осетрова и др. // Экспериментальная онкология. —2000. —Т. 22, №4. —С. 222—224.
4. Буров Ю.В. Проблемы экологической безопасности человека в химико-фармацевтической промышленности. —М., 1995. —366 с.

| Зміст |