УДК 001.18+615.015.35:547.584:616-08:616.43

Ф.А. Колодуб, д.б.н., М.Я. Кудря, к.б.н., С.В. Іванов, І.А. Палагіна, к.б.н., Н.В. Устенко, Н.В. Мельниківська, Л.В. Могилат, В.Б. Лоцкіна

БІОХІМІЧНІ АСПЕКТИ ПОШКОДЖУЮЧОЇ ДІЇ АНТИДІАБЕТИЧНОГО ЛІКАРСЬКОГО ЗАСОБУ — ПОХІДНОГО ЯНТАРНОЇ КИСЛОТИ

Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України, м. Харків

На теперішній час доведено, що загальним механізмом токсичної дії хімічних речовин є активація вільнорадикальних процесів та пов'язана з нєю інтенсифікація перекисного окислення ліпідних компонентів мембран [1, 2]. Надмірне утворення вільних радикалів відіграє основну роль у пошкодженні клітин, спричиняючи зміни в мембранах, ядрі клітин, що лежить в основі багатьох токсичних ефектів [3—5]. Провідна роль у знешкодженні ксенобіотиків належить мікросомальним ферментам печінки, характерною особливістю яких є неспецифічність і висока спорідненість до різноманітних хімічних структур. Вони здатні підвищувати або знижувати свою активність під впливом сполук, в метаболізмі яких приймають участь. Встановлено, що ранні прояви токсичної дії екзогенних хімічних сполук пов'язані саме з порушенням діяльності мікросомальної монооксигеназної системи (МОС) печінки [6, 7].

За структурою і механізмом дії похідні янтарної кислоти здатні впливати на процеси вільнорадикального перекисного окислення ліпідів. Ці сполуки становлять особливий інтерес, оскільки вони є аналогами природних метаболітів, яким належить центральне місце у клітинному метаболізмі. Цілком припустимо, що під впливом похідних янтарної кислоти, залежно від інтенсивності їх дії та шляхів надходження до організму, в МОС можуть виникати зрушення, що характеризують різні стадії пристосувальних або пошкоджуючих реакцій.

Одним з похідних янтарної кислоти є фенсукцинал — b-фенілетиламід-2-оксисукцинанілової кислоти, який синтезовано в Інституті проблем ендокриної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України. Це оригінальний антидіабетичний засіб, призначений для первинної, вторинної і третинної профілактики цукрового діабету І та ІІ типів, здатний забезпечити нормалізацію метаболічних порушень на стадії маніфестації цукрового діабету, послабити діабетичні ускладнення [8]. В теперішній час проходить ІІ фаза клінічних випробувань фенсукциналу, заплановано його промисловий випуск.

Метою роботи було визначення основних ланок механізму пошкоджуючої дії фенсукциналу за умов гострої та субхронічної експозиції при пероральному та інгаляційному надходженні.

Матеріали та методи дослідження

Об'єктами дослідження були 200 щурів лінії Вістар масою тіла 180—200 г. Фенсукцинал уводили перорально на соняшниковій олії в дозах 5000, 500 та 100 мг/кг маси тіла. Інгаляційну токсичність досліджували в умовах одноразового надходження сполуки в концентраціях 53,4±10,9; 27,9±11,2; 12,6±6,9 мг/м³ та 30-ти разового надходження в концентраціях 20,2±1,4 та 1,91±0,15 мг/м³ в спеціальних затравочних камерах системи Боярчука.

Тварин досліджували одразу після отруєння за умов гострого введення сполуки і в динаміці субхронічного затравлення з використанням загальнотоксичних показників, стану МОС та ліпопероксидації.

Функціональний стан ЦНС оцінювали за даними СПП (сумаційно-пороговий показник) [9] та "норкового рефлексу" [10]. Показники периферійної крові, білкового, вуглеводного та ліпідного обміну досліджували загальноприйнятими методами. Інтенсивність вільнорадикальних процесів та перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) в мікросомах печінки визначали хемілюмінесцентним методом на хемілюмінометрі АК-01 [11]. Крім того визначали рівень глютатіону алоксановим методом [12] та продуктів пероксидації: малоновий діальдегід (МДА) з використанням тіобарбітурової кислоти [13] та дієнові кон'югати (ДК) за методом [14].

Фракцію ендоплазматичного ретикулуму (мікросом) печінки контрольних і піддослідних щурів одержували методом диференційного ультрацентрифугування в градієнті щільності 0,25 М розчину сахарози з доданням CaCl₂ у кінцевій концентрації 9 мМ [15]. Отриманий осад мікросом суспендували в 1 мл середовища, яке містить 125 мМ KCl і 20 мМ трис-HCL (pH=7,2). В суспензії мікросом визначали вміст цитохромів В₅ і Р450 спектрофотометричним методом [15], інтенсивність спонтанної хемілюмінесценції (ХЛ) і кінетичні параметри ХЛ, індукованої Fe²⁺ або H₂O₂. Вміст мікросомального білка в пробах визначали за методом Лоурі в модифікації Міллера [17].

Результати та їх обговорення

За нашими попередніми даними [18, 19] встановлено, що фенсукцинал за критерієм гострої токсичності є нетоксичною сполукою, не здатною до кумуляції.

Аналіз комплексу загальнотоксичних показників, отриманих в умовах субхронічного перорального введення фенсукциналу в дозі 5000 мг/кг, свідчить про деякі зміни функціонального стану печінки — підвищення рівня загального білка; нирок — підвищення рівня сечовини та креатиніну сечі; загальної трофіки — збільшення відносної маси печінки, наднирок та передміхурової залози. Пока-зники поведінкових реакцій та СПП змін не зазнали.

Субхронічне введення фенсукциналу в дозах, які у 10 та 50 разів нижче зазначених (500 і 100 мг/кг), не призводило до будь-яких змін з боку вивчаємих показників.

Результати визначення хемілюмінесцентних показників, що інтегрально відтворюють інтенсивність рекомбінації радикальних форм активованого кисню, пероксидації ліпідів та антирадикальної здатності мікросом печінки щурів за умов субхронічного перорального введення досліджуваної сполуки в дозах 5000, 500 та 100 мг/кг, наведені на рисунку та у табл. 1.

Як видно з рисунку, фенсукцинал у дозі 5000 мг/кг після 30 введень активує електронтранспортний ланцюг ендоплазматичного ретикулуму (ЕПР) печінки, на що вказує інтенсифікація спонтанної ХЛ, посилення пероксидації ліпідів — вірогідне підвищення амплітуди "швидкого" спалаху ХЛ, індукованої fe²⁺, при одночасному сповільненні окислення гідроперекисів ліпідів, наслідком чого є збільшення світлосуми ХЛ, індукованої fe²⁺. При цьому фенсукцинал в зазначеній дозі знижує антирадикальну здатність мікросом, на що вказує збільшення світлосуми ХЛ, індукованої Н₂О₂, яке можна оцінити як додатковий фактор підсилення ПОЛ.

Пероральне введення фенсукциналу в дозі 500 мг/кг (табл. 1) призводить до вірогідного підвищення інтенсивності спонтанної ХЛ вже після п'яти введень. При цьому зареєстровано лише підвищення світлосуми Fe²⁺ — індукованої ХЛ (p<0,05), яке свідчить про уповільнення швидкості окислення гідроперекисів ліпідів. Проте сам вміст гідроперекисів ліпідів, виходячи з відсутності змін амплітуди "швидкого" спалаху Fe²⁺ — індукованої ХЛ, не відрізняється від його значень у контрольній групі. Після 15 та 30 введень фенсукциналу вірогідне підвищення спонтанної ХЛ супроводжується значним збільшенням амплітуди "швидкого" спалаху та світлосуми ХЛ, індукованої Fe²⁺. Ці зрушення є результатом накопичення гідроперекисів ліпідів, яке обумовлено, з одного боку, інтенсифікацією ПОЛ активними формами кисню, надлишок яких, ймовірно, утворюється внаслідок активації МОС, а з другого, — уповільненням їх окислення.

Після 5 введень фенсукциналу в дозі 100 мг/кг вірогідних змін з боку досліджуваних показників ХЛ не виникає. Після 15 та 30 введень сполуки зареєстровано вірогідне підвищення спонтанної ХЛ на тлі відсутності змін кінетичних параметрів (амплітуда спалаху та світлосума) Fe²⁺ та Н₂О₂ — індукованої ХЛ. Зміни такої спрямованості, ймовірно, свідчать про те, що внаслідок активації функціонування МОС в мікросомах печінки підвищується вміст активованих форм кисню, рекомбінація яких призводить до підвищення спонтанної ХЛ.

Дослідження вмісту основних компонентів МОС в умовах субхронічного перорального введення фенсукциналу в дозі 500 мг/кг дозволило встановити відсутність змін у вмісті цитохрому В₅. Проте після 5 введень сполуки зафіксовано вірогідне підвищення рівня цитохрому Р450 майже у три рази порівняно з контролем. Такий напрямок змін характеризує інтенсивність синтезу мікросомальних білків-ферментів de novo та активність ферментів, пов'язаних з метаболізмом ксенобіотиків. Активація МОС може сприяти, по-перше, прискоренню детоксикації та виведенню сполук, а по-друге, — посиленню вільнорадикальних процесів ПОЛ.

При введенні сполуки у дозі 100 мг/кг простежена тенденція до підвищення вмісту цитохрому В₅ в мікросомах печінки після 5 і 30 затравлень на 32,6% і 38,2% відповідно. Рівень цитохрому Р450 підвищувався на 46,8% після 5 введень фенсукциналу. Після 15 введень вміст цитохрому Р450 вірогідно знижувався, що може бути результатом деякого пригнічення мікросомальних оксигеназ і, відповідно, зниження швидкості біотрансформації як дослідженої сполуки, так і ендогенних субстратів. Такого роду вплив фенсукциналу на МОС може сприяти прояву його токсичних ефектів.

Під впливом одноразового інгаляційного надходження фенсукциналу в концентраціях 53,4±10,9 та 27,9±11,2 мг/м³ у сироватці крові щурів суттєво підвищується вміст атерогенних b-ліпопротеідів та дієнових кон'югатів, знижується рівень відновленого глютатіона, тобто простежуються ознаки негативного впливу сполуки, що проявляється інтенсифікацією ліпопероксидації, змінами компонентів антиоксидантного захисту та накопиченням атерогенних фракцій ліпопротеїнів. На фоні затравлення фенсукциналом в концентрації 12,6±6,9 мг/м³ не зареєстровано будь-яких змін у зазначених показниках.

При субхронічному інгаляційному надходженні фенсукциналу в концентрації 20,2±1,4 мг/м³ спрямованість змін хемілюмінесцентних показників загалом співпадає з такою, що реєструвалась при пероральному його введенні у дозі 500 мг/кг маси тіла (табл. 2). Зокрема, вже після 5 інгаляцій виявлено вірогідне підсилення спонтанної ХЛ та амплітуди "швидкого"спалаху fe²⁺-індукованої ХЛ на тлі відсутності зрушень інших досліджених показників. Можна припустити, що накопичення гідроперекисів ліпідів обумовлено насамперед інтенсифікацією утворення активованих форм кисню за рахунок активації МОС, оскільки уповільнення окислення гідроперекисів ліпідів після 5 та 15 інгаляцій фенсукциналом не реєструється. Однак, після 30 інгаляцій уповільнення окислення гідроперекисів ліпідів мало місце.

В умовах субхронічної інгаляції фенсукциналом в концентрації 1,91±0,15 мг/м³ вірогідних змін показників інтенсивності ХЛ не зафіксовано.

Вміст таких компонентів монооксигеназної системи, як цитохроми В₅ та Р450 в умовах інгаляційного надходження фенсукциналу протягом 30 днів в концентраціях 20,2 та 1,91 мг/м³ в порівнянні з контролем змін не зазнав.

Одже, при надходженні фенсукциналу через респіраторний тракт в концентрації 20,2±1,4 мг/м³ реєструються зміни показників стану вільнорадикальних процесів та ПОЛ при відсутності значущих зрушень вмісту цитохромів В₅ та Р450. Напрямок зазначених змін співпадає із такими, що зафіксовані на фоні перорального введення сполуки у дозі 500 мг/кг, проте їх вираженість при інгаляції майже в два рази менша, що обумовлено і значно меншою експозиційною дозою сполуки.

Після 5 інгаляцій фенсукциналом в обох піддослідних групах тварин мало місце достовірне зниження рівня глюкози в середньому на 20-29%. В цей період в групі тварин, що піддавалась впливу сполукою в концентрації 20,2 мг/м³, рівень МДА у крові мав тенденцію до зниження у порівнянні з контрольною групою. Після 15 інгаляцій в цій же піддослідній групі тварин рівень МДА в печінці був на 45,8% нижче, ніж в контролі, вміст ДК та b-ліпопротеїдів у сироватці теж був знижений, але ці зміни мали характер тенденції. При впливі меншої концентрації фенсукциналу (1,91 мг/м³) зафіксовано лише зниження рівня глюкози на 28,6% при відсутності зрушень з боку інших показників.

30 інгаляцій фенсукциналом призвело до підвищення вмісту продуктів пероксидації у тварин обох піддослідних груп та незначного підвищення рівня холестерину у тварин, які отримували фенсукцинал в концентрації 20,2 мг/м³.

На протязі всього періоду субхронічного інгаляційного затравлення щурів фенсукциналом в концентраціях 20,2 та 1,91 мг/м³ з боку показників функціонального стану ЦНС, печінки, нирок статистично значущих змін не відмічено.

Висновки

1. Фенсукцинал є біологічно активною сполукою, яка в певних дозах і концентраціях здатна чинити несприятливий вплив на організм піддослідних тварин.

2. Виявлена висока чутливість МОС та ПОЛ мікросомальної фракції печінки до введення фенсукциналу порівняно із змінами показників загальної токсичності.

3. При субхронічному пероральному та інгаляційному надходженні фенсукциналу спостерігаються зміни основного компоненту МОС — цитохрому Р450, інтесифікація вільнорадикальних процесів та ліпопероксидації у мікросомах печінки щурів з одночасними змінами вмісту первинних та кінцевих продуктів ПОЛ.

4. Одним з провідних механізмів пошкоджуючої дії фенсукциналу можна вважати інтенсифікацію процесів ліпопероксидації мікросомальних мембран за рахунок активації електронтранспортного ланцюга МОС.

Література
1. Тиунов Л.А. Механизмы естественной детоксикации и антиоксидантной за-щиты // Вестник РАМН. —1995. —№3. —С. 9—13.
2. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. —Л.: Медицина, 1986. —280 с.
3. Губский Ю.И. Коррекция химического поражения печени. —К.: Здоров'я, 1989. —168 с.
4. Левицкий Е.Л., Губский Ю.И. Свободнорадикальное повреждение ядерного генетического аппарата клетки // Укр. биохим. журнал. —1994. —Т. 66, №4. —С. 18—30.
5. Калянова Н.А. Особенности нарушения процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях психотропными, снотворными препаратами // Токсикологический вестник. —2002. —№6. —С. 18—22.
6. Арчаков А.И., Карузина И.И. Цитохром Р450: окисление чужеродных соединений и проблемы экотоксикологии // Тез. докл. 1-го съезда токсикологов России. —Москва, 1999. —С. 15.
7. Стежка В.А. Функциональное состояние системы свободнорадикального окисления как патогенетически обоснованный критерий гигиенической оценки воздействия на организм факторов производственной и окружающей среды // Довкілля та здоров'я. —1999. —№1(8). —С. 2—9.
8. Фенсукцинал — перспективный препарат для профилактики и лечения сахарного диабета и его сосудистых осложнений / В.В. Полторак, Н.И. Горбенко, Л.П. Пивоваревич, Ю.И. Караченцев // Провизор. —2000. —№17. —С. 43—44.
9. Определение суммационно-порогового показателя (СПП) при различных формах токсикологического эксперимента: Метод. рекомендации / Сост. С.В. Сперанский. —Новосибирск, 1975. —27 с.
10. Методические рекомендации по использованию поведенческих реакций животных в токсикологических исследованиях для целей гигиенического нормирования / Сост.: Е.Н. Буркацкая и др. —Киев, 1980. —47 с.
11. Колодуб Ф.А. Мінімізація кількості біосубстратів для визначення стану вільнорадикальних процесів, пероксидації ліпідів та антиоксидантного захисту // Інформ. бюл. Додаток до Журн. АМН України. —2001. —Вип. 13. —С. 46.
12. Мишенева В.С., Горюхина Т.А. Наличие глютатиона в нормальных и опухолевых тканях человека и животных // Вопр. онкологии. —1968. —Т. 14, №10. —С. 46—49.
13. Стальная И.Д., Гаришвили Г.Т. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты. Современные методы в биохимии. —Москва, 1977. —С. 73—78.
14. Владимиров В.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. —М.: Наука, 1972. —252 с.
15. Лемешко В.В. Система микросомального окисления при развитии и старении организма // Биохимия. —1980. —Т. 45, вып. 11. —С. 1964—1969.
16. Карузина И.И., Арчаков А.И. Метод измерения содержания и скорости окисления-восстановления цитохромов В₅ и Р450 в микросомальной фракции. Современные методы в биохимии. —Москва, 1977. —С. 49—50.
17. Miller G.L. Protein determination for Iarge numbers of samples // Analyt. Chem. —1959. —V. 31, №5. —P. 964—966.
18. Критерії інгаляційної токсичності нових антидіабетичних сполук / С.В. Іванов, М.Я. Кудря, І.А. Палагіна та ін. // Ендокринологія. —2001. —Т. 6, додаток. —С. 112.
19. Деякі аспекти токсичної дії похідних янтарної кислоти з антидіабетичною активністю / М.Я. Кудря, С.В. Іванов, С.Ю. Хіпко та ін. // Актуальні проблеми гігієни праці і профпатології в машинобудуванні та хім. промисловості: Зб. наук. праць. —Харків, 1998. —С. 138.