УДК 612.35+591.132

Н.О. Карпезо, к.б.н, О.М. Гурняк, С.М. Цивінська, О.В. Линчак, В.К. Рибальченко, д.б.н.

ГЕПАТОПРОТЕКТОРНІ ВЛАСТИВОСТІ СУКЦИНАТУ НАТРІЮ ЗА УМОВ ОТРУЄННЯ ГЕРБІЦИДОМ 2,4-Д

НДІ фізіології Київського національного університету ім. Тараса Шевченка

Широке застосування у сільському господарстві різних за призначенням пестицидів спонукає не тільки вивчати їх токсичну дію на організм теплокровних, а й шукати шляхи запобігання шкідливих впливів.

Токсикологія гербіциду 2,4-Д досить добре вивчена. Встановлено, що 2,4-Д та її похідні можуть надходити в організм через шкіру, шлунково-кишковий тракт та при інгаляції [1]. У щурів, які отримували токсичні дози 2,4-Д, виявлено розвиток токсичного гепатиту, застій в кровоносних судинах печінки, місцевий некроз, дегенерацію або атрофію гепатоцитів [2]. При гострому отруєні щурів 2,4-Д, поряд з порушенням енергетичних процесів відбувається активна детоксикація пестициду [3]. Вплив пестицидів на двофазні водно-ліпідні системи свідчить про ймовірність їх небезпечної дії на біологічні мембрани [4]. Зокрема, встановлено, що стимулятор росту рослин івін модулює проникність гербіциду 2,4-Д через мембрани [5, 6].

Пошук засобів для лікування отруєнь 2,4-Д і досі залишається актуальною проблемою токсикології. В цьому плані певну увагу привертає сукцинат натрію. Сукцинат натрію застосовується в медичній практиці для усунення наслідків медикаментозної інтоксикації та корекції патологічних станів, пов'язаних з тканинною гіпоксією. Він є ключовим інтермедіатом циклу Кребса і бере участь у механізмах адаптації організму до дії несприятливих факторів [7—9].

Вміст сукцинату в тканинах організму людини і тварин складає 0,2—0,8 ммоль/кг, в плазмі крові — не перевищує 0,04 ммоль/л [7]. У високих дозах сукцинат активує коагуляційний потенціал крові, що призводить до швидкого виснаження і зриву антикоагуляційних механізмів. При гістологічному дослідженні виявлено численні прояви синдрому диссемінованого внутрішньосудинного згортання крові, коли одночасно утворюються мікротромби і прогресує кровоточивість. У печінці, крім набряку паренхіми, виявлено великі ділянки дистрофії та некроза гепатоцитів. Отже, особливостями токсичного впливу сукцинату натрію є швидкоплинність і тригерний механізм дії, а його характер зумовлений гіпер- та гіпокоагуляційними зсувами гемостазу з ознаками ішемічних (тромботичних) змін в органах і тканинах [10, 11].

Гепатотропна дія сукцинату пов'язана з підвищенням співвідношення НАДH+/НАД, стимуляцією синтезу сечовини і енергетичного обміну в гепатоцитах. При ураженні ксенобіотиками сукцинат стимулює функції печінки і підвищує стійкість мембран до вільнорадикального окиснення. Щодо лікування хвороб печінки, то вже ведуться доклінічні дослідження препаратів, до складу яких входить сукцинат [7].

Мета нашої роботи — визначити в експерименті гепатопротекторні властивості сукцинату натрію при дії 2,4-Д.

Матеріали і методи дослідження

Досліди проводили на нелінійних білих щурах-самцях масою 150—200 г. Щурів утримували на стандартному харчовому раціоні в умовах віварію. Досліджувані речовини вводили внутрішньошлунково щодня зранку до годування за допомогою зонду протягом 1 місяця. Гербіцид 2,4-Д вводили у дозі 10 мг/кг маси тіла, сукцинат натрію — 25 мг/кг у 1 мл дистильованої води. При вивченні сумісної дії препарати в тих же дозах вводили одночасно в 1 мл дистильованої води. Контрольна група тварин одержувала дистильовану воду (1 мл). В кінці дослідження тварин декапітували під ефірним наркозом.

Для гістологічного аналізу печінку фіксували у суміші Буена, після стандартної гістологічної обробки заливали у парафін. Зрізи товщиною 5—7 мкм забарвлювали гематоксиліном Бемера з дофарбуванням еозином та оранжем G.

Функціональний стан печінки визначали, базуючись на морфометричних показниках та за ферментативною активністю аланінамінотрансферази (АЛТ) і аспартатамінотрансферази (АСТ) у гомогенатах печінки та в сироватці крові.

Площі поперечного перетину гепатоцитів та їх ядер у центролобулярній та перипортальній зонах вимірювали за допомогою цитологічного аналізатору "Интеграл-2MT", діаметр синусоїдів та висоту ядер ендотеліальних клітин — за допомогою окуляр-мікрометру. Рахували також кількість двоядерних та поліплоїдних гепатоцитів у полі зору мікроскопу (ок. 15, об. 40) окремо у центролобулярній та перипортальній зонах. Відносну кількість двоядерних та поліплоїдних клітин виражали у відсотках.

Для визначення активності ферментів користувалися стандартними наборами для колориметричного визначання аланінамінотрансферази (АЛТ) і аспартатамінотрансферази (АСТ) фірми Human (Німеччина). Реакцію проводили кінетичним методом на напівавтоматичному аналізаторі "Мікролаб 200" (Нідерланди) при 340 нм. Одиницею активності (Е) ферменту вважали ту його кількість, яка каталізуює перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хв за даних умов. Ферментативну активність перераховували на мг білка в сироватці та гомогенаті (Е/мг білка).

Статистична обробка результатів була проведена за критерієм Ст'юдента. Для відповідних розрахунків використовували стандартний пакет програм статистичного аналізу Microsoft Excel 97.

Результати та їх обговорення

У контролі печінка щурів має типову будову. Гепатоцити мають округло-полігональну форму і містять округлі ядра з чітко окресленими ядерцями. Площі поперечного перетину гепатоцитів (надалі будемо обмежуватись терміном "площі") центролобулярної зони печінкової часточки становлять 269,3±13,4 мкм², а перипортальної — 38,5±1,3 мкм². Площі ядер гепатоцитів дорівнюють, відповідно, 38,5±1,3 мкм² та 36,5±1,2 мкм² (табл. 1). Відносна кількість поліплоїдних клітин у центролобулярній та перипортальній зонах становить 12,9±0,7% та 14,0±0,6%, кількість двоядерних клітин дорівнює відповідно 16,2±1,4% та 10,5±0,8%.

Гепатоцити утворюють тяжі, що галузяться і сходяться до центральної вени. Синусоїди, які впадають у центральні вени, добре виражені. Вони містять формені елементи крові. Діаметри їх дорівнюють 5,6±0,3 мкм. Висота ядер ендотеліальних клітин, що утворюють вистилку синусоїдів, становить 2,5±0,1 мкм (табл. 2).

Ферментативна активність аланінамінотрансферази і аспартатамінотрансферази у сироватці крові та у гомогенаті печінки становить відповідно 57,0±3,64 і 1,64±9,43 Е/мг білка та 0,76±0,03 і 0,56±0,02 Е/мг білка.

Після впливу гербіциду 2,4-Д протягом 1 міс у печінці розвиваються запальні процеси, особливо у периваскулярних ділянках, як у перипортальній, так і в центролобулярній зонах. Синусоїди також заповнені лейкоцитами. В окремих випадках у печінці є невеликі крововиливи, переважно в підкапсулярній зоні. Спостерігається тромбоз окремих невеликих судин. Гербіцид менше впливає на жовчні протоки, і їх запалення незначні.

Розміри гепатоцитів центролобулярної зони печінкової часточки збільшуються до 313,8±13,3 мкм². У перипортальній зоні вони залишаються без змін і становлять 264,3±21,4 мкм². Середні показники площ гепатоцитів при дії гербіциду 2,4-Д практично не змінюються відносно контролю і становлять у центролобулярній та перипортальній зонах відповідно 36,7±1,9 мкм² та 36,3±1,7 мкм². Проте детальний аналіз показав, що в ядерному апараті гепатоцитів відбуваються істотні зміни. Реакція гепатоцитів роздвоюється. У частини клітин розміри ядер значно зменшуються. Одночасно збільшується кількість клітин з великими ядрами. Поява двох піків на графіках варіабельності площ ядер гепатоцитів свідчить про наявність клітин з низькою та підвищеною функціональною активністю (табл. 1; рис. 1 А, Б). Останнє підтверджується збільшенням кількості поліплоїдних гепатоцитів до 29,9±1,6% у центролобулярній та 33,5±1,8% у перипортальній зонах. Кількість двоядерних клітин зростає відповідно до 17,1±0,6% та 18,7±1,8%. Просвіт синусоїдів помітно звужується і їх діаметр дорівнює лише 1,9±0,4 мкм. Висота ядер ендотеліальних клітин зменшується до 1,9±0,1 мкм (табл. 2).

При дії гербіциду 2,4-Д зростає активність АЛТ і АСТ у сироватці крові і активність АЛТ у гомогенаті печінки (рис. 2).

Отже гербіцид 2,4-Д призводить до значного пошкодження печінки. Найбільш типовими є поява підкапсульних крововиливів та розвиток гепатиту. При цьому запальні процеси розвиваються переважно в периваскулярних ділянках як навколо центральних вен, так і в перипортальних зонах біля портальних вен і печінкових артерій. Помітно відреагувало на гербіцид 2,4-Д і мікроциркуляторне русло печінки — майже в 3 рази зменшується просвіт синусоїдів, вдвічі — висота ядер ендотеліальних клітин, що є ознакою зниження обмінних процесів між кров'ю та гепатоцитами. У центролобулярній і перипортальній зонах печінкової часточки реакція гепатоцитв роздвоюється: одні клітини перебувають у помітно пригніченому стані, інші, навпаки, активовані. Останнє є ознакою зростання компенсаторних процесів у печінці.

Сукцинат натрію викликає помітні структурні зміни у печінці. Виявлено значні відмінності у реакції гепатоцитів центролобулярної та перипортальної зон печінкової часточки. У центролобулярній зоні гепатоцити округло-полігональної форми, більш округлі, ніж контрольні, містять світлу цитоплазму, більш-менш рівномірно забарвлену гематоксилін-еозином. Границі клітин, особливо базальні, чітко окреслені. Ядра гепатоцитів мають округлу форму, добре контуровані, містять велику кількість дрібних та середніх розмірів ядерець. Площі гепатоцитів та їх ядер зростають відповідно до 310,7±14,8 мкм² та 47,9±1,4 мкм². Графік варіабельності площ ядер гепатоцитів центролобулярної зони показує не тільки значне зростання розмірів ядер переважної більшості клітин, а також наявність нової популяції активних клітин — поява другого піку на графіку варіабельності (табл. 1, рис. 1 А). Кількість поліплоїдних клітин зростає до 37,6±2,8%, а двоядерних практично не змінюється і становить 14,1±2,0%.

У перипортальній зоні гепатоцити істотно змінені. Клітини мають чітко виражені границі. Вміст цитоплазми зміщено вакуолями до периферії клітин. Ядра великі, чітко окреслені, мають округлу або неправильну форму. Площі гепатоцитів та їх ядер зростають відповідно до 333,5±14,3 мкм² та 51,6±2,6 мкм². На графіку варіабельності площ ядер гепатоцитів, на відміну від центролобулярної зони, немає другого піку, проте видно появу певної кількості клітин, розміри ядер яких значно перевищують контроль (табл. 1, рис. 1 Б). Кількість поліплоїдних клітин зростає до 41,5±4,3%, а кількість двоядерних клітин має тенденцію до зменшення і становить 12,5±1,4%.

Діаметр синусоїдів трохи зменшується і дорівнює 5,0±0,4 мкм. Висота ядер ендотеліальних клітин не змінюється і становить 2,3±0,1 мкм (табл. 2).

При дії сукцинату натрію активність АЛТ у сироватці крові та в гомогенаті печінки не змінюється, а активність АСТ навіть зменшується (рис. 2).

Отже сукцинат натрію істотно впливає на морфо-функціональний стан печінки. Привертає особливу увагу відмінність у реакції гепатоцитів центролобулярної та перипортальної зон печінкової часточки, хоча гепатоцити в межах всієї печінки перебувають у стані підвищеної функціональної активності.

Сукцинат зменшує пошкоджуючий вплив 2,4-Д. Зокрема у печінці менше крововиливів і майже немає тромбозу судин, менші зони запалення, порівняно з дією одного гербіциду. Водночас гербіцид перешкоджає прояву чіткої зональної гетерогенності реакції гепатоцитів на сукцинат натрію.

При одночасній дії 2,4-Д та сукцинату натрію площі гепатоцитів та їх ядер у центролобулярній зоні печінкової часточки зростають більше, ніж під впливом кожного з них окремо, і становлять відповідно 360,8±12,7 мкм² та 52,5±2,2 мкм². Графік варіабельності площ гепатоцитів ілюструє вищу активність ядер гепатоцитів цієї серії досліду не тільки відносно контролю і дії 2,4-Д, а й відносно дії сукцинату натрію. Характерна поява другого піку на кривій варіабельності, як і при дії одного сукцинату, проте цей пік значно більше виражений (рис. 1 А).

У перипортальній зоні також відбувається зростання площ гепатоцитів та їх ядер, хоча відносно менше, ніж у центролобулярній зоні. Площі гепатоцитів та їх ядер становлять відповідно 324.2±8.4 мкм2 та 46.9±1.1 мкм2 (табл. 1, рис. 1 Б).

При одночасній дії гербіциду і сукцинату натрію кількість поліплоїдних клітин зростає у центролобулярній та перипортальній зонах печінкової часточки відповідно до 43.3±4.3% та 44.5±3.5%. Водночас кількість двоядерних клітин має тенденцію до зменшення, як при дії одного сукцинату, і дорівнює відповідно 13,5±1,9% та 12,8±1,5%. Синусоїди вірогідно звужені відносно контролю, проте менше, ніж під впливом одного 2,4-Д, і водночас більше, ніж при дії одного сукцинату натрію. Діаметр синусоїдів становить 4,0±0,3 мкм. Висота ядер ендотеліальних клітин дорівнює 2,2±0,1 мкм, що більше, ніж після впливу 2,4-Д, і наближається до показників при дії одного сукцинату натрію та контролю (табл. 2). Активність АЛТ та АСТ у сироватці крові та в гомогенаті печінки не змінюється.

Аналіз результатів проведених дослідів показав, що при одночасній дії 2,4-Д і сукцинату натрію токсична дія гербіциду менше виражена: зменшуються площі розповсюдження та кількість осередків запалення, майже немає тромбозу судин, менше крововиливів.

>При одночасній дії гербіциду і сукцинату натрію гетерогенність реакції гепатоцитів набуває особливого значення. У центролобулярній зоні печінкової часточки, де, як відомо, найбільш інтенсивно відбуваються процеси детоксикації ксенобіотиків, розміри гепатоцитів зростають більше, ніж при дії кожного з препаратів окремо. Площі ядер гепатоцитів більші, ніж при дії сукцинату натрію, а під впливом одного гербіциду вони зменшуються. У перипортальній зоні розміри гепатоцитів такі ж, як під впливом одного сукцинату, а розміри ядер гепатоцитів значно менші. Тобто у перипортальній зоні більше виражена пригнічуюча дія гербіциду. В центролобулярній зоні, навпаки, активність гепатоцитів при одночасному впливові досліджуваних препаратів зростає. Водночас кількість поліплоїдних клітин в обох зонах печінкової часточки зростає однаково, що є свідченням посилення компенсаторних процесів в межах усієї печінки. Сукцинат натрію перешкоджає різкому звуженню синусоїдів і зменшенню ядер ендотеліальних клітин, що притаманне дії гербіциду 2,4-Д.

Сукцинат натрію запобігає змінам у печінці, які призводять до підвищення ферментативної активності аланінамінотрансферази та аспартатамінотрансферази у сироватці крові при дії гербіциду 2,4-Д.

Література
1. Орел Л.В., Орел І.Л. Гербіциди —не панацея // Захист рослин. —2000. —№6. —С. 2—3.
2. 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) // Всемирная организация здравоохранения. —Женева, 1987. —132 с.
3. Sulik M., Kisielevski W., Szynaka B., Kemona A., Sulkowska M., Sulik A., Baltaziak M. Ultrastruktural changes in rat hepatocytes in acute intoxication with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) // Rocz. Akad. Med. Bialist. —1998. —V. 43. —P. 314—326.
4. Жминько П.Г., Войцицкий В.М., Дубовенко Е.А., Каган Ю.С. Влияние некоторых фосфорорганических пестицидов на характеристики двухфазной водно-липидной системы // Физиологически-активные вещества. —1992. —Вып. 24. —С. 19—22.
5. Бичко А.В., Рибальченко В.К. Модифікація рідинно-кристалічної структури бімолекулярних мембран N-оксид-2,6-лутидином (івіном) // Фізика живого. —2002. —Т. 10, №1. —С. 31—40.
6. Бичко А.В. Структурні перетворення ліпідного матриксу при дії 2,4-Д та івіну // Тези доповідей III з'їзду УБФТ. —Львів, 2002. —С. 77.
7. Коваленко А., Белякова Н., Романцов М., Алексеева Л., Шмарова Л., Петров А. Фармакологическая активность янтарной кислоты и ее лекарственные формы // Врач. —2000. —№4. —С. 26—27.
8. Алексеева Л., Петров А., Саватеева Т., Коваленко А., Голубев С., Романцов М. Янтарная кислота — основное действующее вещество новых метаболических препаратов // Врач. —2001. —№12. —С. 29.
9. Олійник С.А., До механізму мембранотропної, антиоксидантної та антитоксичної дії натрію сукцинату // Современные проблемы токсикологии. —2001. —№3. —С. 24—26.
10. Шалимов С.А., Борщевская М.И, Волченскова И.И., Галахин К.А., Корчевая Л.М., Майданевич Н.Н. Изучение острой и хронической токсичности сукцината натрия // Там же. —С. 72—76.
11. Шалимов С.А., Галахин К.А., Борщевская М.И., Волченскова И.И., Корчевая Л.М., Майданевич Н.Н. Особенности, характер и выраженность токсического действия высоких доз натрия сукцината на организм экспериментальных животных // Современные проблемы токсикологии. —2001. —№4. —С. 11—16.