УДК 615.9:615.099

Е.А. Баглей, д.м.н., П.Г. Жминько, к.б.н., Н.Н. Недопитанская, к.б.н., Н.А. Корнута, к.б.н., Е.В. Решавская, В.С. Лисовская

ЗАВИСИМОСТЬ ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА КРОТОНОВОГО АЛЬДЕГИДА ОТ ПУТЕЙ ЕГО ПОСТУПЛЕНИЯ В ОРГАНИЗМ

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, г. Киев, Украина

Кротоновый альдегид (2-бутеналь, b-метилакролеин, метилпропеналь) широко распространен в окружающей среде. Биогенная эмиcсия этого соединения в лесах может достигать до 0,49 мкг/м³, а при гниении листвы может значительно увеличиваться. Особенно высока его концентрация (до 2,6 мг/м³) возле компостных ям и свалок. Кротоновый альдегид может поступать в организм с продуктами питания и водой, где встречается в концентрациях до 0,7 мг/кг, с воздухом при использовании в химической (изготовление резины, н-бутанола, сорбитовой и кротоновой кислот) и деревообрабатывающей промышленности, в качестве одоранта газа, а также в составе отработанных газов автомобильных двигателей [1—3]. Таким образом, основные пути поступления кротонового альдегида в организм человека — ингаляционный и в меньшей степени пероральный.

Кротоновый альдегид (КА) способен прямо взаимодействовать с ДНК, образуя ДНК-белковые сшивки, а также опосредовано, с образованием циклических аддуктов 1-N²-пропанодезоксигуанозина. Образование таких аддуктов показано как в условиях in vitro (у прокариот, на культурах клеток китайского хомячка и фибробластов ксеродермы человека [4—5]), так и in vivo (при накожном нанесении мышам линии SENCAR и при пероральном введении крысам линии Фишер [6]). Выявление аддуктов у контрольных крыс связано с наличием этого соединения в окружающей среде. Однако экспериментального изучения генотоксического эффекта ингаляционного поступления кротонового альдегида в организм не проводилось.

Кротоновый альдегид является средовым мутагеном и, возможно, канцерогеном [7—8]. На основании данных, полученных при пероральном поступлении КА в организм крыс [9], эксперты агенства по защите окружающей cреды США класcифицировали кротоновый альдегид как канцероген группы С: "возможный канцероген для человека", и рассчитали фактор канцерогенного потенциала CPS_n равный 1,9 (мг/(кг•сут))^-1. Онкогенный риск при ингаляционном поступлении в организм кротонового альдегида рекомендуется определять рассчетным методом [10]. Корректность такого подхода можно оценить только на основании экспериментальных данных.

Целью настоящей работы является изучение генотоксического эффекта кротонового альдегида при ингаляционном и внутрижелудочном путях поступления в организм.

Генотоксический эффект оценивали по наличию повреждений ДНК в клетках различных органов крыс, а также по появлению трансформированных клеток.

Одной из наиболее широко используемых моделей изучения повреждений ДНК в результате воздействия химических веществ является метод щелочной элюции ДНК [11, 12]. Анализ результатов элюции ДНК в клетках различных органов млекопитающих, получавших исследуемое соединение, позволяет прогнозировать потенциальную органотропность его мутагенного и бластомогенного действия. Однонитчатые разрывы являются одним из наиболее ранних показателей повреждений ДНК.

Методом щелочной элюции ДНК изучено образование однонитчатых разрывов ДНК в клетках различных органов крыс при внутрижелудочном и ингаляционном поступлении в организм одинакового количества КА.

Эксперимент по изучению органотропности генотоксического действия КА выполнен на крысах Вистар, самцах разводки питомника НАН Украины "Глеваха", 2—3 месячного возраста, массой 150—200 г. В экспериментах использовали 95% КА (транс-изоформа), который вводили животным одноразово внутрижелудочно или путем ингаляции. Животные были разделены на 5 групп по 6 крыс в каждой. Условия эксперимента представлены в табл. 1. Уровни доз были выбраны, исходя из того, что по данным литературы [9] пероральное введение 8,4 мг/кг м.т. КА вызывало увеличение частоты доброкачественных опухолей и предопухолевых состояний в печени крыс, доза 0,01 мг/м³ была подпороговой по токсикологическим критериям и близкой к реально существующей в окружающей среде концентрацией.

Ингаляция парами КА проводилась в газопаровых камерах Б.А. Курляндского, температура воздуха в камерах колебалась в пределах от 18 до 22°С, относительная влажность воздуха — от 64 до 72%. Время воздействия 4 часа.

Декапитацию крыс проводили под эфирным наркозом через 24 часа после воздействия КА. Органотропный генотоксический эффект КА оценивали по количеству выявленных однонитчатых разрывов в молекуле ДНК (ОНР), которые определяли методом щелочной элюции по K.W. Kohn и соавт. с небольшими модификациями [11, 12]. Генотоксический эффект был изучен в клетках органов потенциальных мишеней канцерогенного действия КА — легких, печени, почках, желудке, костном мозге (табл. 2).

При внутрижелудочном введении КА увеличение количества ОНР ДНК по сравнению с контролем было обнаружено в клетках печени на 68%, почек на 42%, костного мозга на 48%. В клетках легких и желудка увеличения количества ОНР ДНК не установлено.

При ингаляционном введении такого же количества КА увеличение количества ОНР ДНК было обнаружено во всех исследованных органах. По сравнению с контролем в легких ОНР ДНК было больше на 12%, в печени — на 245%, в почках — на 120%, в желудке — на 38%, в костном мозге — на 133%.

Исследование генотоксического эффекта КА при ингаляционном введении было продолжено при воздействии уровней доз, сниженных в 5 и 500 раз. На уровне самой низкой дозы эффект не обнаружен. При воздействии средней дозы отмечено статистически достоверное увеличение количества ОНР ДНК по сравнению с контролем в клетках печени на 33% и в костном мозге на 26%. Таким образом в тканях которые сначала непосредственно контактировали с кротоновым альдегидом — легкие, желудок, несмотря на выраженные воспалительные явления и деструктивные процессы, генотоксический эффект был выражен в меньшей степени по сравнению с органами в которые кротоновый альдегид был доставлен с током крови.

Обобщенных данных о токсикокинетике и токсикодинамике КА в доступной нам литературе не обнаружено. Имеются одиночные исследования, посвященные метаболизму КА [1]. По аналогии с акрилальдегидом [13], метаболизм КА может быть представлен следующим образом (рис.). На рисунке представлена предполагаемая схема метаболизма кротонового альдегида. Основной путь метаболизма кротонового альдегида проходит через взаимодействие с восстановленным глутатионом. Скорость этих реакций выше по сравнению с другими реакциями превращения альдегидов [13]. В результате такого рода реакций в клетках значительно снижается уровень глутатиона, что в дальнейшем способствует увеличению генотоксического эффекта. Образовавшиеся метаболиты не являются генотоксикантами [14, 15]. Взаимодействие КА с sh-группами белков и ферментов может приводить к образованию различных сшивок белок—белок и повреждению клеточных мембран, а также инактивации ферментов, участвующих в синтезе нуклеиновых кислот, хотя инактивации ферментов, связанных с сестринским хроматидным обменом и репаративным синтезом ДНК, при этом не происходит [14]. Альдегиды также легко взаимодействуют с аминами белков и нуклеиновых кислот, образуя Шиффовы основания, а затем белковые сшивки и аддукты ДНК. По такому хорошо описанному механизму КА образует циклические аддукты 1-n²-пропанодезоксигуанозина в ДНК [1, 16, 17]. Не только пропаноаддукты могут получаться при взимодействии КА с тканями организма. Показана также возможность образования других аддуктов — 1-n²-(3-гидроксибут-1-илидиен) дезоксигуанозин и n²-паральдолдезоксигуанозин [16], этено-аддуктов [1]. Следует отметить, что модификация клеточных мембран альдегидами может приводить к затруднениям проникновения их в ядро клетки. Этим можно объяснить наблюдаемое снижение генотоксического эффекта при прямом действии КА на ткани и более высокий эффект в тканях других органов.

Согласно представленной схеме, существуют еще два пути метаболизма кротонового альдегида в тканях. С помощью альдегиддегидрогеназы в печени образуется кротоновая кислота, которая впоследствии вступает в реакции межуточного обмена. Другой путь превращения КА происходит в тканях печени и легких с участием цитохрома Р-450 и эпоксидазы с образованием 1-метил-глицидальдегида, который гидролизуется с помощью эпокигидролазы до метил-глицеральдегида. Рассматривая возможное участие этих метаболитов в генотоксическом эффекте следует отдать предпочтение 1-метил-глицидальдегиду, который имеет группу эпоксиэтилена, алкилирующая активность которой общеизвестна. Наиболее высокая активность ферментных систем, осуществляющих такие превращения КА, локализуется в печени и легких. Поэтому при поступлении КА в организм ингаляционным путем образование генотоксикантов будет происходить в легких и печени, тогда как при поступлении вещества внутрижелудочно — преимущественно в печени. Этим и объясняются различия в генотоксическом эффекте при поступлении КА в организм ингаляционным и пероральным путем.

Увеличение генотоксического эффекта при поступлении КА в организм ингаляционным путем нашло свое подтверждение в экспериментах по изучению возможности накопления генетических повреждений в процессе хронического воздействия КА [18].

Учитывая, что печень является наиболее чувствительным органом к генотоксическому действию КА, было изучено накопление генетических повреждений в гепатоцитах при пероральном и ингаляционном путях поступления в организм.

Генотоксический эффект оценивали по появлению трансформированых клеток в тканях печени крыс, экспонированных к КА после воздействии промотора. Введение КА осуществляли на протяжении 105 сут ингаляционным путем в течении 4 ч, или внутрижелудочно. После этого крысам была сделана гепатэктомия (под наркозом) и в течении 6 нед с питьевой водой вводили фенобарбитал. Ингаляцию проводили при максимально переносимой в субхроническом эксперименте концентрации КА. Количество поступающего в организм КА при этом было в 10 раз меньше, чем при внутрижелудочном введении. Внутрижелудочно вводили дозу, при которой в хроническом эксперименте был установлен наибольший онкогенный эффект [9]. Трансформированные гепатоциты, экспрессирующие гаммаглу-тамилтранспептидазу (ГТП), идентифицировали по наличию и размерам гиперпластических узелков.

Количество животных с выявленными узелками в контрольной и подопытных группах практически не различалось. Анализ данных, представленных в работе [18] показал, что выявленные узелки гетерогенны по отклику на воздействие промотора. Под влиянием промотора усиливалась пролиферативная активность трансформи-рованнных клеток и, соответственно, увеличивалась площадь сответствующего узелка.

Средняя площадь гиперпластических узелков, экспресирующих гаммаглутамилтрансферазу (ГТП), в печени крыс при ингаляционном поступлении КА была значительно больше, чем при пероральном. У всех животных, получавших КА в концентрации 5,23 мг/м³, были обнаружены гиперпластические узелки средней площадью 0,51 мм²/см². Вероятно, именно узелки больших размеров и являются показателем трансформации клеток при воздействии КА. Действительно, в контрольной группе не было обнаружено животных, в печени которых выявлялись бы узелки средней площадью более 0,51 мм²/см². При этом у подопытных животных, получавших КА ингаляционным путем, их было в шесть раз больше, чем при пероральном.

Выявленные различия генотоксического действия КА при различных путях поступления в организм свидетельствуют, что при оценке онкогенного риска КА, поступающего в организм ингаляционным путем, необходимо использовать соответствующий фактор канцерогенного потенциала — CPSi, полученный не рассчетным, а экспериментальным путем.

Выводы

1. КА при ингаляционном пути поступления в организм крыс вызывает увеличение количества ОНР ДНК в печени, почках, легких, желудке и костном мозге, тогда как при внутрижелудочном — только в печени, почках и костном мозге.

2. Наиболее выраженный генотоксический эффект КА при обоих путях поступления в организм выявлен в печени.

3. В результате генотоксического действия КА появляются повреждения структуры ДНК, которые накапливаются в геноме клеток печени крыс и приводят к их трасформации.

4. Образование повреждений структуры ДНК при хроническом ингаляционном воздействии КА на организм выражено в значительно большей степени, чем при внутрижелудочном.

Литература
1. Crotonaldegyde. IARС Monographs of the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans. Dry cleaning, some chlorinated solvents chlorinated solvents and other industrial chemicals // Lyon. —1995. —V. 63. —P. 373—391.
2. Enviromental Chemicals Data and Information Network. —Ispra, JRC-CEC, last update: 02.09.93.
3. Feron, V.J.,Til, H.P.,de Vrijer, F., Woutersen, R.A., Cassee, F.R.& van Bladeren, P.J. Aldehydes: occurrence, carcinogenic potential, mechanism of action and risk assessment // Mutat.Res. —1991. —259. —Р. 363—385.
4. Foiles P.G., Akerkar S.A., Miglietta L.M., Chung F.-L. Formation of cyclic deoxyguanosine adducts in Chinese hamster ovary cells by acrolein and crotonaldehyde // Carcinogenesis. —1990. —11. —P. 2059—2061.
5. Curren R.D., Yang L.L., Conklin P.M., Grafstrom R.C., Harris C.C. Mutagenesis of xeroderma pigmentosum fibroblasts by acrolein // Mutat. Res. —1988. —209. —Р. 17—22.
6. Chung F.-L., Yang R., and Hecht S.S. Detection of 1,N²-propanodeoxyguanosine adducts in DNA of rats treated with N-nitrosopyrrolidine and mice treated with crotonaldehyde. // Carcinogenesis. —1989. —10. —Р. 1291—1297.
7. Eder E., Schuler B. D. Acrolein and crotonaldehyd are carcinogenic and mutagenic air, water and food polutans. EUROTOX`95. Abstracts of Satelit symposium. —Pragua, 1995.
8. Eder E. Cancer risk assessment for the environmental mutagen and carcinogen crotonaldehyde on the basis of TD(50) and comparison with 1,N(2)-propanodeoxyguanosine adduct levels // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. —2001. —10, 8. —Р. 883—888.
9. Chung F.-L., Tanaka T. and Hecht S.S. Induction of liver tumors in F344 rats by crotonaldehyde // Cancer Res. —1986. —46. —Р. 1285—1289.
10. US EPA. Integrated Risk Information System (IRIS). —Cincinnati, 1997.
11. Parodi S., Taningher M., Boero P., Santi L. Quantitative correlations amongst alkaline DNA fragmentation, DNA covalent binding, mutagenicity in the Ames test and carcinogenicity for 21 compounds. // Mutat. Res. —1982. —V. 93. —P. 1—24.
12. Kornuta N., Bagley E., Nedopitanskaya N. Genotoxic effects of pesticides.//J. Environmental Patology, Toxicology and Oncology. —1996. —15. —P. 75—78.
13. Acrolein. IARС Monographs of the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans. Dry cleaning, some chlorinated solvents chlo-rinated solvents and other indastrial chemicals // Lyon. —1995. —V. 63. —P. 337—372.
14. Wilmer J.L., Erexson G.L., Kligerman A.D. Attenuation of cytogenic damage by 2-mercaptoetanesulphonate in cultured human lymphocytes exposed to cyclophosphamide and its reactive metabolites // Cancer Res. —1986. —46, 1. —P. 203—210.
15. Demkowicz-Dobrzanski K, Castonguay A. Modulation by glutathione of DNA strand breaks induced by 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone and its aldehyde metabolites in rat hepatocytes // Carcinogenesis. —1992. —13 (8). —Р. 1447—54.
16. Hecht SS, McIntee EJ, Wang M. New DNA adducts of crotonaldehyde and acetaldehyde // Toxicology. —2001. —166 (1-2). —Р. 31—366.
17. Sako M, Inagaki S, Esaka Y, Deyashiki Y. Histones accelerate the cyclic 1,N²-propanoguanine adduct-formation of DNA by the primary metabolite of alcohol and carcinogenic crotonaldehyde // Bioorg. Med. Chem. Lett. —2003. —13, 20. —P. 3497—3498.
18. Баглій Є.А., Жмінько П.Г., Недопитаньська Н.М., Решавська О.В., Лісовська В.С. Індукція передпухлинних станів печінки щурів кротоновим альдегідом // Современные проблемы токсикологии. —2001. —№1. —С. 23—26.