ПРОБЛЕМНІ СТАТТІ

УДК 577.2:616-032.22

В.Н. Залесский, к.м.н., О.Б. Дынник, к.м.н., А.А. Фильченков, к.б.н., Л.Н. Гуслицер, д.м.н.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ: ПРИЧИННАЯ СВЯЗЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ, ГЕНОТОКСИЧЕСКИХ ВЛИЯНИЙ ЭКОТОКСИКАНТОВ (ПРОДУКТОВ ТАБАКОКУРЕНИЯ) С ПОВЫШЕННЫМ РИСКОМ ВОЗНИКНОВЕНИЯ РАКА ЛЕГКОГО

Институт кардиологии им. Н.Д. Стражеско АМН Украины, г. Киев
Медицинское научно-практическое объединение "Медстрой", г. Киев Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, г. Киев

Табакокурение и сопровождающая его хроническая табачная интоксикация являются причиной широкого спектра заболеваний у человека: это злокачественные опухоли, сердечно-сосудистые заболевания, болезни респираторных органов и многие другие патологические состояния [5]. Универсальность табачной интоксикации обусловлена тем, что табачный дым содержит более 100 токсических для человека соединений, имеющих различную тропность к разным органам и тканям и вызывающих разнообразные токсические и патологические последствия в организме [6]. Ряд из этих соединений могут оказывать канцерогенное воздействие на клетки и ткани животных и человека.

Табачный канцерогенез в легких обусловлен, прежде всего, воздействием полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) и нитросоединений, содержащихся в табачном дыме. Установлено, что ПАУ вызывают мутации в гене р53, играющем решающую роль в клеточном цикле и канцерогенезе. В частности, показано, что ПАУ-аддукты ДНК присутствуют в клетках респираторных органов человека, экспонированных к табачному дыму [4]. ПАУ-аддукты ДНК обнаружены у курильщиков в клетках мочевого пузыря и слизистой оболочки шейки матки у курящих женщин [14, 43]. Табачный дым и его соединения могут выполнять роль ко-канцерогена или модифицировать по принципу синергии действие других канцерогенов: асбеста, радона, мышьяка, ионизирующего излучения и др. [15]. 80% табачной смолы из табачного дыма остается в респираторном тракте курильщика [34]. Поэтому наиболее выраженная изначальная связь наблюдается между табакокурением и риском развития рака легкого. Так 85—95% всех случаев рака легкого у мужчин этиологически связаны с табакокурением [5]. По расчетам американских исследователей, в США до 3000 случаев рака легкого в год может быть связано с пассивным курением [39]. Рабочая группа Международного агентства по исследованию рака (МАИР), оценке кацерогенности химических веществ, сложных смесей и других факторов, заседание которой проходило в Лионе в июле 2002 года, пришла к заключению, что пассивное курение является канцерогенным для человека и может быть причиной возникновения рака легкого у некурящих, которые подвергаются воздействию табачного дыма в воздухе помещений. По данным китайских ученых, 36% всех раковых заболеваний связывается с табакокурением [68], а в Японии — 25% всех случаев смерти от онкологических заболеваний [27]. В России 52% всех случаев смерти от раковых заболеваний у мужчин и 5% — у женщин относят за счет табакокурения [5].

Вследствие достижения определенных успехов в понимании полиэтиологической природы рака и уточнения географических различий риска его возникновения, а также установления особенностей латентного периода канцерогенного эффекта, проведенные современные молекулярно-эпидемиологические исследования позволили оптимизировать процесс углубленного исследования механизмов инициации опухолевого процесса на межвидовом уровне и в пределах групп риска [48]. Другими словами, молекулярная эпидемиология рака является областью знаний, интегрирующей современные достижения молекулярной биологии, биохимии и эпидемиологии в области межвидового (а не популяционного) канцерогенного риска, а также включает исследования с привлечением лабораторных моделей канцерогенеза (in vitro и in vivo) [48]. Целью молекулярно-эпидемиологических исследований является определение индивидуальных различий высоких уровней канцерогенного риска в общей популяции, что является существенным шагом вперед в решении проблем предупреждения рака (онкопрофилактики).

Широкомасштабные исследования, проводимые в последние годы [47, 48, 54], посвященные изучению хронической нестабильности специфических генов, начальных стадий химического канцерогенеза и существенной роли при этом метаболизма ксенобиотиков, открывают новые возможности формирования современных представлений о механизмах индивидуальной онко-предрасположенности.

В работе проведен анализ данных литературы, включающих применение молекулярных технологий (геномных, протеомных), оценку уровней генотоксических реакций, обусловленных экогеномным взаимодействием; р53-ассоциированного молекулярного маркирования, р53-зависимого мутагенеза, а также особенностей молекулярной гетерогенности и индукции апоптоза в пределах опухолевых подтипов при возникновении табак-зависимого рака легкого. Также приведены данные о молекулярных механизмах взаимодействия между мутацией р53 гена и активным/пассивным табакокурением.

Современные технологии молекулярно-генетических исследований

На протяжении последних десятилетий использование лабораторных тестов (молекулярных технологий) в онкологической практике экспоненциально увеличивалось, и этот рост продолжается в настоящее время. По общему признанию, этот период ознаменовался прорывом в молекулярно-генетических исследованиях, что привело к внедрению в практику клинико-дигностических лабораторий методов ДНК-диагностики, среди которых лидируют полимеразная цепная реакция (ПЦР) и гибридизация ДНК [36]. Отмечается стремительный прогресс внедрения новых систем ДНК-диагностики, биочипов [39], а также протеомных технологий анализа белковых продуктов экспрессии генов и биосенсорных анализаторов [31].

Геномные технологии. ПЦР-метод анализа метилирования ДНК в геноме, основан на использовании рестрикционных эндонуклеаз (Hha 1, Hpa 2, Eag 1, Not 1, Sac 2 и др.), чувствительных к метилированию остатков цитозина в промоторных районах CpG-островков, имеющих множество сайтов их узнавания, что практически устраняет возможность неполного гидролиза ДНК. Если фрагмент ДНК не содержит модифицированных оснований, то гидролиз проходит полностью, ПЦР не идет, и, соответственно, ее продукт не определяется. Недостатком метода является то, что могут быть проанализированы только CpG-динуклеотиды, попадающие в сайт узнавания. Его достоинством является высокая чувствительность, позволяющая анализировать метилированные аллели в присутствии большого избытка аллелей "дикого" типа [3].

МС-ПЦР (метилспецифическая ПЦР) — метод, позволяющий оценить статус метилирования индивидуальных CpG-островков. Процедура состоит в предварительном дезаминировании цитозина в тестируемых образцах ДНК с образованием урацила, тогда как метилированные остатки цитозина остаются неизменными. При последующей ПЦР урацил заменяется на тимин. Таким образом, достигается возможность конструировать праймеры, избирательно амплифицирующие последовательности, содержащие метилированные остатки цитозина в CpG-островках [36].

Метод картирования всех метилированных цитозиновых остатков в известной последовательности ДНК [30]. Метод, как и предыдущий, основан на превращении всех неметилированных остатков цитозина в урацил в результате обработки ДНК бисульфатом натрия. В результате модификации ДНК оказываются некомплементарными друг другу. Амплификация исследуемой последовательности с помощью ПЦР и последующее прямое секвенирование выявляют только те цитозиновые остатки, которые в исходной цели были метилированы. Метод позволяет выявить только те динуклеотиды CpG в составе островков, метилирование которых необходимо и достаточно для подавления транскрипции соответствующего гена.

Метод амплификации метилированных CpG-островков [3], основанный на ПЦР анализе, позволяет избирательно амплифицировать CpG-островки, дифференциально метилированные в нормальных и опухолевых клетках. Этот подход позволяет селективно амплифицировать CpG-островки, аномально метилированные в предопухолевых и опухолевых клетках. Метод может быть использован для поиска новых генов, подвергающихся метилированию при малигнизации.

Метод рестрикционно-ориентированного сканирования генома позволяет одновременно анализировать статус метилирования в геноме нескольких тысяч CpG-островков [30]. Суть его заключается в разделении двумерным электрофорезом рестрикционных фрагментов, полученных обработкой геномной ДНК несколькими рестриктазами. Метод трудоемок и может быть использован для поиска новых CpG-островков генов, метилированных в определенном типе опухоли.

Еще одним многообещающим подходом, разрабатываемым в последнее время, является метил-специфический фингерпринтинг. Этот метод направлен на выявление аномального метилирования новых генов, вовлеченных в канцерогенез, в различных формах опухолей или на разных стадиях процесса малигнизации [63]. В результате такого подхода уже определено несколько новых генов, вовлеченных в инициацию опухолевого процесса.

В лабораторной диагностике, хотя и значительно реже, используется метод лигазной цепной реакции (ЛЦР), в основе которой лежит способность специфического фермента ДНК-зависимой ДНК-лигазы сшивать ("лигировать") цепь ДНК в присутствии АТФ и ионов Mg2+, при наличии разрыва фосфодиэфирной связи. Применяются другие модификации, такие как амплификация с вытеснением цепи (SDA), реакция транскрипционно опосредованной амплификации (ОТ—ПЦР), гнездовая ПЦР и некоторые другие [63].

ДНК-биочиповые технологии. Одна из проблем традиционного подхода путем анализа экспрессии одиночного гена заключается в том, что для каждой опухоли необходимо определить соответствующий ген, вовлеченный в процесс канцерогенеза. Использование биопанелей (или микрочипов) ДНК (DNA microarrays), а также микроматричной технологии может дать решение этой проблемы. В гелевых биочипах ДНК иммобилизируется в слое полиакриламидного геля, толщиной 1—2 мкм, нанесенным на специально обработанную поверхность стекла [23]. Гибридизируемая ДНК обычно нарабатывается с помощью полимеразной цепной реакции, которая в продвинутых технологиях осуществляется непосредственно на чипе [62]. Детекция сигнала на ДНК-чипах осуществляется с помощью флюоресценции, масс-спектрометрии, атомной силовой ("force") микроскопии и др. [58, 61]. Кроме матричной архитектуры, развиваются также технологии на основе микрофлюидных (или капиллярных) биочипов, а также биочипов с применением микросфер с цветовой кодировкой [2]. Можно предвидеть в ближайшем будущем, при стремительном развитии ДНК-биочиповой технологии, возможность закрепления всего генома на одном микрочипе [63]. Сравнивая экспрессию генов в нормальных и раковых клетках человека с помощью экспрессионных чипов, можно проводить раннее тестирование раковых заболеваний различных органов [62].

Протеомные технологии. В результате выполнения международного проэкта "Геном человека" картированы все двадцать три гена хромосомы человека, стали известны десятки генов, регулирующих опухолевый рост, открылись возможности для поиска новых высокоспецифичных биомаркеров рака, а также сформировалось новое направление функциональной генетики — протеомика [19, 50]. Протеомика занимается сравнительным изучением клеточных протеомов, т.е. наборов белков в клетке — продуктов экспрессии одиночных генов. Таким образом, определяемый белок (биомаркер) помогает зарегестрировать изменения во время трансформации здоровой клетки в опухолевую, включая измененную экспрессию, дифференцированную модификацию белка, изменения специфической активности. Распознавание и понимание этих процессов и составляет суть протеомики рака [2, 50].

В протеомном анализе применяется комбинация двух методов: двумерный электрофорез и масс-спектрометрия разделенных электрофорезом белков биологического материала с последующей обработкой результатов методом биоинформатики [1]. Сопоставляя создаваемые таким путем протеомные карты нормальных и альтеративно измененных тканей, можно установить, какие белки важны для развития того или иного патологического процесса и выбрать их в качестве мишеней для молекулярной диагностики и терапии. Одним из наиболее перспективных модификаций протеомной технологии является комбинация методов MALDI-tof (Matrix Assistant Laser Desorb Ionization time-of-flight) [59]. Принцип этого подхода заключается в том, что белки из неокрашенного LD-геля электроблоттингом переносятся на мембрану с иммобилизированным трипсином, где они расщепляются до пептидов. Полученные пептиды улавливаются второй мембраной, которая считывается в MALDI-for — масс-спектрометре и позволяет прочитать последовательность этих пептидов со скоростью сотни образцов в час. Используется обратная фаза (LC) для разделения пептидов из чрезвычайно сложных смесей с целью определения аминокислотных остатков в белках [59].

Белок-микрочиповые технологии. Перспективным с точки зрения ранней диагностики раковых заболеваний являются белковые чипы, создаваемые на основе технологии SELDI (Surface-Enhanced Desorption/Ionization Protein Chip) [44]. Этот метод имеет преимущество перед другими технологиями (такими как LS-MS, 2D-электрофорез в геле, ELISA) из-за его высокой чувствительности (фемтомолярный диапазон) и легкой адаптации к диагностическому формату [58].

Важным продвижением вперед в подготовке образцов для протеомных исследований стало изобретение лазерного микроиссечения тканей (LCM) [9]. Этот метод позволяет выделить здоровые эпителиальные, стромальные, доброкачественные и опухолевые клетки из одного и того же образца, что создает возможность для открытия новых биомаркеров рака. Сравнение опухолевых и нормальных клеток по их белковым профилям с применением методов биоинформатики открывает новые перспективы для молекулярной медицины будущего. Информацию, полученную методами протеомного анализа, можно рассматривать как дополнение к анализу генной структуры и экспрессии. Можно надеяться, что дальнейшее развитие новых протеомных технологий позволит, наряду с геномными и микрочиповыми технологиями, приблизить диагностическую процедуру к ориентации на конкретный вид опухоли (в том числе, легочной ткани) у конкретного больного.

Роль генотоксических влияний табак-ассоциированных экотоксикантов в повышении риска возникновения рака легкого

В возникновении рака легкого существенная роль отведена факторам окружающей среды, в том числе продуктам табакокурения. Генотоксические факторы, которые определяют многоэтапный процесс инициации роста новообразований легких, являются канцерогенами, активирующимися при участии цитохром Р450 (CYP) — зависимых каталитических реакций. Их энзим-зависимые генетические различия обусловлены отчасти степенью метаболической активации экзотоксинов и, следовательно, сводятся в дальнейшем к процессам ДНК — связывания и инициации мутагенеза в органах мишенях [46].

На первом этапе генотоксических влияний большое внимание уделяют идентификации генов, мутации которых приводят к малигнизации, т.е. генов предрасположенности к возникновению злокачественных новообразований. Известно, что такие гены как CYP 1A1, MEH ("microsomal epoxid hydrolase") и GSTM 1 контролируют процесс метаболизма ксенобиотика — бензпирена, участвующего в первой фазе никотин-зависимого канцерогенеза [65]. При этом происходит энзим-зависимая (CYP 1A1 и MEH) каталитическая активация бензпирена до бензпирен-диолепоксида (BPDE), а также GSTM 1-контролируемая деактивация эпоксидов, образующихся в активационных каскадах каталитических реакций. Подтверждением достоверности (in vivo) этих метаболических превращений послужили исследования, показавшие повышенную активность CYP 1A1 гена, сочетающуюся с отсутствием таковой у гена GSTM 1, а также появление высоких уровней BPDE-аддуктов ДНК в плазме крови [51]. Как отмечено в этих исследованиях, низкие уровни BPDE-аддуктов ДНК были обнаружены у больных с двумя полиморфными укороченными аллелями MEH. В дальнейшем оказалось, что некурящие гомозиготные по GSTM 1 индивиды с "нулевым" генотипом отличались повышенным риском возникновения никотин-обусловленной транскрипции в эпителии бронхов, по сравнению с людьми, имеющими другой генотип [12].

Вторым уровнем генотоксических реакций, обусловленных эко-геномным взаимодействием, являются процессы индукции экспрессии генов, контролирующих метаболизм ксенобиотиков и активирующих химический канцерогенез. CYP гены регулируют деятельность лиганд-активирующих ядерных рецепторов. В частности, индукция экспрессии CYP 1A1 гена осуществляется путем присоединения полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) к AhR-рецептору [32]. AhR-рецептор — ПАУ комплекс после присоединения AhR — ядерного транслокатора (Arnt) транслоцируется в ядро и, соединяясь с молекулами ксенобиотика, запускает кодируемый CYP геном процесс транскрипции. В то же время, отсутствие полиморфизма Ah-рецептора или — соединение его с Arnt-белком может обусловливать появление вариантов CYP 1A1-индуцибельности генов в процессе трансформации клеток эпителия бронхов [8].

Процесс ошибочной репарации повреждений ДНК (ДНК-аддукты), возникновение которых обусловлено активацией канцерогенов, рассматривается в качестве третьего уровня генотоксических реакций, обусловленных эко-геномным взаимодействием [66]. В эпителиоцитах трахеольвеолярной системы легких и мононуклеарах периферической крови обнаружены междувидовые различия энзимов, репарирующих повреждения ДНК у курящих и не курящих табак [66], а также у пациентов с и без наследственной предрасположенности к раку легкого. Появление различных вариантов нуклеотидных последовательностей в ДНК-репарирующих генах и новых данных об активации опухолево-супрессорных (XPD, XRCC 1) генов способствовало подтверждению клинической значимости этих результатов в возникновении риска опухолевой трансформации в легочной ткани. Известно, что мутации ДНК-репарирующих генов увеличивают риск возникновения опухолевой трансформации. Оказалось, что XPD-полиморфизм модулирует ДНК репарирующую способность [57] и формирует повышенный риск возникновения рака легкого [66]. XRCC 1-полиморфизм аналогичным образом влиял на риск возникновения рака легкого [16], в том числе — аденокарцином респираторного тракта.

Четвертый уровень эко-геномных влияний при возникновении опухолей легких включает прямое действие активированных канцерогенов на гены мишени. При этом канцерогениндуцированное образование продуктов ДНК может способствовать появлению мутантных генов. Мутационная инактивация р53 опухолево-супрессорного гена формирует различную степень злокачественности клеток опухолей легких и склонность к появлению миссенс ("missence") мутаций по сравнению с другими опухолево-супрессорными генами [48].

Понимание роли генетических повреждений и их репарации в механизме возникновения рака легкого сегодня является основной предпосылкой для разработки новых терапевтических технологий и диагностических критериев в оценке функционирования молекулярных звеньев этиологической цепочки процесса инициации данного заболевания [28]. Современными исследованиями подтверждена молекулярная гетерогенность опухолей и отдельных опухолевых клеток. Показано, что мутации многих генов сопровождают возникновение рака легкого. Так, мутации гена р53-супрессора опухолевого роста встречаются значительно чаще, чем мутации других опухолево-супрессорных генов, отличающихся ограниченным спектром миссенс-мутаций [22, 24]. Оказалось, что белок р53 и все члены его семейства играют ключевую роль в механизмах канцерогенеза в легочной ткани, инициируемого факторами окружающей среды и в особенности — продуктами табакокурения [25]. В последние годы наметился "всплеск" исследований, посвященных молекулярно-эпидемиологической оценке геномной нестабильности у людей в "здоровой" популяции [25, 64].

Результаты многочисленных молекулярно — генетических исследований позволяют признать, что рак — это болезнь генома. Опухоль возникает в результате последовательных изменений и накопления структурных и функциональных эффектов в генах, которые играют ключевую роль в функционировании и дифференцировке нормальной клетки и называются протоонкогенами (онкогенами). Второй группой генов, задействованных в бластомогенез, являются антионкогены (гены супрессоры), оказывающие супрессорное влияние на функцию протоонкогенов и угнетающие клеточный рост. Как оказалось, инициация множественных генетических повреждений в опухолевых клетках свойственна онкогенам и генам супрессорам. При раке легкого частота возникновения генетических повреждений (точечная мутация, амплификация, микросателлитная нестабильность, гиперметилирование ДНК, делеция и транслокация хромосомы) с высокой достоверностью встречаются в участках хромосом: 3p (FHIT); 5q, 8p, 9p (p16ICDK 2); 9q, 11p, 13q (Rb); 17p, 17q (p53), известных или предполагаемых в качестве генов супрессоров опухолевого роста [38].

Благодаря окружению в опухолях множественности генетических дефектов, была выдвинута гипотеза мутационного фенотипа ("mutator phenotype"), которая допускает наличие процесса накопления мутаций [41]. Изучено более 100 онкогенов с большой частотой появления хромосомных аберраций в клетках опухолей легких (например, ген K-ras — более 30% случаев экспрессии или амплификации) [53]. На первом месте по частоте мутаций стоит ген р53-супрессор опухолевого роста [24]. Важнейшими процессами, сопровождающими дисфункцию генов и применяемыми для ранней ("досимптомной") диагностики рака легкого, являются — инактивация Rb-каскада (Rb и p16INK 4 мутаций), а также повреждение FHIT ("ломкая гистидиновая триада" — fragile histidine triade) — последовательностей [53].

Согласно данным [20], p14ARF — альтернативный продукт сплайсинга специфических генов, кодируемый p16INK 4 геном, оказался фактором риска появления высокой частоты мутаций при инициации опухолевого процесса в легких. Сравнительно недавно промоторное гиперметилирование в генах, как возможный эпигенетический механизм блокады функций генов — супрессоров опухолевого роста, стало вызывать повышенный интерес исследователей [69]. Аберрантное промоторное гиперметилирование в группах различных генов, включающих p16INK 4, было обнаружено в связи с инициацией роста немелкоклеточного рака легкого, причем как в опухолевой, так и в "здоровой" тканях у курящих табак [37]. Промоторное гиперметилирование в p16INK 4 гене было связано прямопропорциональной зависимостью с частотой возникновения злокачественной трансформации клеток эпителия бронхов [11], а факт его обнаружения был подтвержден другими исследованиями [10], в которых процесс метилирования был использован в качестве маркера начальных изменений эпителиоцитов при проведении ранней ("досимптомной") диагностики бронхогенного рака. Эти результаты нашли подтверждение в работе [45], в которой авторами обнаружено гиперметилирование в p16INK 4 генах во всех 11 исследуемых образцах мокроты, взятых за 35 мес до установления диагноза — рак легкого.

Проведенные "молекулярные" параллели между мелко — и немелкоклеточной формами рака легкого обнаружили различную частоту событий на геномном и протеомном уровнях [53]. Высокие уровни С-мус амплификаций (до 30%) и Bcl-2 эспрессий (до 95%) оказались характерными для мелкоклеточного рака легкого, в то время как эти изменения были крайне незначительными (5 и 15%, соответственно) в случаях немелкоклеточной формы рака легкого. Наряду с этим, при развитии "мелкоклеточного" опухолевого процесса в легких отмечена высокая мутационная инактивация р53- и Rb-генов, что почти полностью не регистрировали в случаях немелкоклеточного рака респираторных органов.

В апоптозе клеток, представляющих эти два типа опухолей, обнаружены существенные различия. Клетки эпителия бронхов при мелкоклеточной форме рака легкого оказались более склонными к проапоптическому сценарию гибели [55]. Используя клеточные линии мелко — и немелкоклеточного рака легкого, Joseph и соавторы [35] обнаружили, что не зависимо от их сравнительно одинаковой склонности к спонтанному апоптозу, эпителиоциты мелкоклеточного рака отмечены дефицитом функционирования ряда каспазных каскадов и (по сравнению с немелкоклеточным типом опухолей) имели высокий уровень активности антиапоптических Bcl-2 белков, наряду с низким содержанием проапоптических Вах протеинов в цитозоле. Оказалось, что каждый из двух гистологических подтипов отличался молекулярной гетерогенностью. Так, в работе [52] установлено представительство аденокарцином легких у человека к молекулярно-гетерогенным группам опухолей, что, по мнению авторов, могло свидетельствовать о возможном существовании, по крайней мере, двух различных путей мутагенеза.

Взаимоотношение между курением и мутацией р53 гена — молекулярного маркера опухолевой трансформации

Потеря контроля клетки над генетической стабильностью играет главную роль в возникновении и развитии злокачественных новообразований. Результаты исследований, выполненных в последнем десятилетии прошлого века, позволили предположить, что продукты экспрессии генов р53, Rb и E2F являются ключевыми компонентами в цепи биохимических событий, контролирующих стабильность генома.

Ген р53 локализован в 17р 13.1 хромосоме и кодирует основные функции ядерного фосфопротеина [28]. Белок р53 человека состоит из 399 аминокислотных остатков (а.о.), которые объединены в несколько структурно-функциональных доменов. Функциональный домен белка р53 необходим для ингибирования роста опухолевых клеток, а в некоторых случаях для р53-опосредованного апоптоза. Центральный (или коровый) участок молекулы р53 (а.о. 102-292) обеспечивает его взаимодействие со специфической последовательностью ДНК и отвечает за многие белок-белковые реакции р53. Обнаружено, что в ответ на повреждение структуры ДНК и другие формы генотоксического стресса продукция р53 и его биологическая активность быстро повышаются, что приводит к блоку клеточного цикла, либо к апоптической гибели клетки [22, 24]. Однако до настоящего времени остается невыясненным вопрос: почему в одних случаях р53 вызывает апоптоз, тогда, как в других происходит только блок клеточного цикла, что имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение.

Сравнительно недавно проведена оценка роли р53 в качестве маркера опухолевой трансформации, ранней диагностики, эффективности проводимых фармакотерапевтических мероприятий и прогноза заболевания [13, 26, 40, 60], а также — значения р53 антител плазмы крови в качестве маркера процесса выживаемости онкологических больных(таблица) [56]. Редукция мутационной инактивации гена р53 зависела от степени репарации ДНК и делала клетку более устойчивой к последующим повреждениям ДНК. Так, "восстановление" bpde-аддуктов ДНК замедлялось в клеточной линии человеческих фибробластов с дефектным р53 геном, по сравнению с р53 "дикого типа". Табак-зависимые повреждения генома связаны с укорочением аллелей в пределах определенных локусов fhit гена и значительным уровнем хромосомных повреждений, обусловленных мутациями гена р53 [21].

Альтерация р53 гена, наряду с мутациями опухолево-ассоциированных генов, обусловливают сочетание процессов: взаимодействия канцерогенов с ДНК; недостаточности функционирования механизмов ДНК-репарации и селекции мутаций, которые обеспечивают злокачественную трансформацию эпителия бронхов [28]. Поэтому частота, время и спектр мутаций р53 имеет существенное значение в молекулярном патогенезе рака легкого [22]. В созданной при содействии МАИР компьютерной базы данных (http:/www.IARC.fr/p53/homeopage-html) пополнены архивы о более чем 2000 никотин-ассоциированных мутациях, обнаруженных в мутационном спектре р53 гена при раке легкого [25].

В эксперименте на животных установлено, что канцерогены табачного дыма вызывают появление до 90% мутаций, нарушающих функции р53 гена, и влияют на структуру центрального (корового) домена мутационного спектра р53 при раке легкого. Бензпирен индуцировал различные варианты (G: C-T: A) трансверсий в генах [53]. Появление этих видов трансверсий, ассоциированных с курением у больных раком легкого, оказалось дозо-зависимым процессом [53]. Pfeifer и соавторы [49] выяснили, что кодоны: 157, 248 и 273 в структуре мутационного спектра р53 гена (рисунок) ответственны за возникновение повторных мутаций при раке легкого, а также служат мишенью образования ДНК-аддуктов при бензпирен-индуцированном р53 мутагенезе.

Замедленная репарация этих аддукт-ассоциированных повреждений ДНК, а также преимущественное образование бензпирен-диолепоксид-аддуктов в CpG-островках метилирования ДНК модифицировало структуру мутационного спектра гена р53 у курящих табак больных раком легкого [25]. В тоже время G-T мутации в CpG-островках метилирования ДНК чаще регистрировались при табакокурении как единичные [41]. Авторы [29], основываясь на расчетных данных сравнения с МАИР—2000 компьютерной базой данных р53-мутаций при раке легкого, установили статистически достоверные различия между G-T трансверсиями у курящих и не курящих табак.

Многоцентровые рандомизированные эпидемиологические исследования пассивного курения показали, что у не курящих табак пациентов, болеющих раком легкого, в эпителии бронхов имелись достоверные признаки повышенного риска возникновения мутаций гена р53 [33], а участки мутационной инактивации генов значительно отличались от таковых у курящих онкобольных, имеющих высокую частоту мутаций р53 и никотиновую зависимость в анамнезе [33]. Проведение расширенных сравнительных молекулярно-эпидемиологических исследований на досимптомном этапе возникновения рака легкого у курящих, некурящих, пассивных табакокурильщиков и лиц в "здоровой" популяции может позволить в будущем подтвердить выдвинутую ранее гипотезу о канцероген-зависимой активации индукции повторных мутаций путем образования аддуктов ДНК в специфических участках опухолево-супрессорных генов р53 с последующим накоплением в них альтернативных изменений, характерных для процесса малигнизации.

Заключение

Табак является одним из основных доказанных и наиболее распространенных в современной человеческой популяции источников канцерогенов. Причинная связь воздействия табачных канцерогенов с развитием целого ряда форм злокачественных новообразований убедительно подтверждена в многочисленных исследованиях с применением различных подходов и методов, как на молекулярном, так и на эпидемиологическом уровнях.

Методы молекулярной эпидемиологии позволяют визуализировать оценку риска возникновения мутационных табак-ассоциированных повреждений белковых молекул на уровне клеточного генома у отдельно взятого индивида, что помогает выявить признаки начальной малигнизации в клетке, а также — осуществить раннюю диагностику опухолевого процесса на этапе его доклинических проявлений. Открытие р53-ассоциированных маркеров раннего выявления, прогноза и чувствительности к химиотерапевтическим препаратам, а также — FHIT гена супрессора, ассоциированного с возникновением рака легкого, способствовали становлению нового направления научных исследований в онкопульмонологии — "досимптомной" молекулярной диагностики признаков начальной малигнизации клеток респираторной системы.

Проведение мониторинга молекулярных маркеров, которые обнаруживаются задолго до появления клинических признаков заболевания, позволит своевременно начать более тщательную диагностику и превентивную терапию возникновения опухолей легких. Анализ аномального метилирования промоторных участков опухолево-супрессорных генов в рамках проводимых ежегодных диспансеризаций (при доступности стандартных наборов ДНК-маркеров) позволит эффективно осуществлять скрининг и бороться с онкопатологией легких на ранних этапах ее возникновения.

Литература
1. Арчаков А.И. Биоинформатика, геномика и протеомика // Вопр. мед. химии. —2000. —Т. 46, №1. —С. 3—7.
2. Беленький Б.Г. Новые возможности лабораторной аналитики: микрофлюидные чип —анализаторы // Клин. лаб. диагност. —2001. —№4. —С. 25—32.
3. Колупаев В.Е. Преимущества методов ПЦР в реальном времени // Лабор. мед. —2002. —№5. —С. 110Ч112.
4. Курение и здоровье. Материалы МАИР / Под ред. Д.Г. Заридзе и Р. Пето. —М.: Медицина, 1989.
5. Левшин В.Ф., Заридзе Д.Г. Табак и злокачественные новообразования // Вопр. онкол. —2003. —Т. 49, №4. —С. 391—399.
6. Левшин В.Ф., Федичкина Т.П. Закономерности развития и распространения табакокурения // Врач. —2001. —№7. —С. 26—28.
7. Ahrendt S.A., Chow J.T. et al. Molecular election of tumor cells in bronchoalveolar lavage fluid from patients with early stage lung cancer // J. Natl. Cancer Inst. —1999. —V. 91. —P. 332—339.
8. Anttila S., Lei X.D., Elovaara E. et al. An uncommon phenotype of poor inducibility of CYP 1A1 in human lyng is not ascribable to polymorphisms in the AHR, ARNT or CYP 1A1 genes // Pharmacogenetics. —2000. —V. 10. —P. 741—751.
9. Banks R. E. , Dunn M. J. , Forbes M. A. et al. The potential use of laser capture microdissections to selectively obtain distinct population of cells for proteomic analysis preliminary findings // Electrophoresis. —1999. —V. 20. —P. 689—700.
10. Baylin S.B., Herman J.G. Promoter hypermethylation: can these changes alone ever designature true tumor suppressor gene function? // J. Natl. Cancer Inst. —2001. —V. 93. —P. 664—665.
11. Belinsky S.A., Nikula K.J., Palmisano W.A. et al. Abberant methylation of p16 INK4a is an early diagnosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —1998. —V. 95. —P. 11891—11896.
12. Bennett W.P., Alavanja M.C., Blomeke B. et al. Environmental tobacco smoke, genetic suspectibility and risk of lung cancer in never smoking women // J. Natl. Cancer Inst. —1999. —V. 91. —P. 2009—2014.
13. Biros E., Kalina I., Kohnt A. Germ line polymorphism of the tumor suppressor gene p53 and lung cancer // Lung Cancer. —2001. —V. 31. —P. 157—162.
14. Brennan P., Bogiollot O., Cordier S et al. Cigarette smoking and bladder cancer in men // Int. J. Cancer. —2000. —V. 86, N2. —P. 289—294.
15. Burkart W. Cambined effect of radiation and other agent: is there a synergism trap? // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. —2001. —V. 20. —P. 53—58.
16. Butkiewicz D., Rusin M., Enevold L. et al Genetic polymorphisms in DNA repair genes and risk of lung cancer // Carcinogenesis. —2001. —V. 22. —P. 593—597.
17. California environmental protection agency. Health effects of exposure to environmental tobacco smoke // Tobacco Control. —1997. —V. 6, N4. —P. 281—288.
18. Chen J.T., Ho W.L., Chen Y.M. et al. Detection of p53 mutations in sputum smears precedes diagnosis of non —small cell lung carcinoma // Anticancer Res. —2000. —V. 20. —P. 2687—2690.
19. Diamandis E.P., Bruns D.E. Cancer diagnotics: discovery and clinical applications // Clin. Chem. —2002. —V. 48. —P. 1145—1146.
20. Gao M., Hu Y.D., Cao X.Y. et al. The exogenous wild — type p14 ARF gene induced growth arrest and promotes radiosensivity in human lung cancer cell lines // J. Cancer Res. Clin. Oncol. —2001. —V. 127. —P. 359—367.
21. Garinis G.A., Gorgonlis V.G., Mariatos G. et al. Association of allelic less at the FHIT locus and p53 alterations with tumours kinetics and chromosomal instability in non-small cell lung carcinomas (NSCLCs) // J. Pathol. —2001. —V. 193. —P. 55—56.
22. Greenblatt M.S., Benneth W.P., Hollstein M. Mutation in the p53 tumour suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis // Cancer Res. —1994. —V. 54. —P. 4855—4878.
23. Guschin D., Yerchov G., Zaslavsky A. et al Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA and protein microchips // Anal. Biochem. —1997. —V. 250. —P. 203—211.
24. Hainant P. p53 and human cancer: the first ten thousand mutations //Adv. Cancer Res. —2000. —V. 77. —P. 81—137.
25. Hainant P., Pfeifer G.T. Patterns of p53 G>T-transversions in lung cancer reflect the primary mutagenetic signature of DNA-damage by tobacco-smoke // Carcinogenesis. —2001. —V. 22. —P. 367—374.
26. Hanaka T., Nakayama J., Mukai J. et al. Association of smoking with apoptosis of regulated proteins (Bcl-2, Bax and p53) in resection non-small cell lung cancer // Int. J. Cancer. —2001. —V. 91. —P. 267—269.
27. Hara M., Smoking and risk of premature death among middle-aged Japanese // Jpn. J. Cancer Res. —2002. —V. 93, N1. —P. 6—14.
28. Harris C.C. Structure and function of the p53 tumour suppressor gene: clues for rational cancer therapenbic strategies // J. Natl. Cancer Inst. —1996. —V. 88. —P. 1442—1455.
29. Hernandes-Bonssard T.M., Hainant P. A specific spectrum of p53 mutation is lung cancer from smokers: review of mutations compiled in the IARC p53 database // Environ. Health Persp. —1998. —V. 100. —P. 385—391.
30. Hignchi R. Kinetic PCR analysis: Real time monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology. —1993. —V. 11. —P. 1026—1030.
31. Hill H.A.O., Davis J.J. Biosensor: past, present and future // Biochem. Soc. Trans. —1999. —V. 27. —P. 331—335.
32. Honkakovski P., Negishi M. Regulation of Cytochrome P 450 (CYP) genes by nuclear receptor // Biochem J. —2000. —V. 347. —P. 321—337.
33. Husgafvel P.K., Boffetta P. p53 mutations and exposure to environmental tobbacco smoke in a multicentral randomized study of lung cancer // Cancer Res. —2000. —V. 60. —P. 2906—2911.
34. International Agency for Research on Cancer. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans. Tobacco Smoking. —V. 38, IARC —Lyon, France, 1986. —P.
421.
35. Joseph B., Ekedahl J., Snrzen F., et al. Differences in expression of pro-caspases in small cell and non-small cell lung carcinoma // Biochem. Biophis. Res. Commun. —1999. —V. 262(2). —P. 381—387.
36. Khoury M., Beaty T.H., Cohen B. Fundamentals of genetic epidemology. Oxford University Press, 1993. —P.283.
37. Kim D.-H., Nelson H.H., Wiencke J.K. et al. p16 INK4a and histology — specific methylation of CpG islands by exposure to tobacco smoke in non-small cell lung cancer // Cancer Res. —2001. —V. 61. —P. 3419—3424.
38. Kohno T., Yokota J. How many tumour suppressor genes and involved in human lung carcinogenesis? // Carcinogenesis. —1999. —V. 20. —P. 1403—1410.
39. Lakhani S.R., Ashworth A. Microarray and histopathological analysis of tumours: the future and the past? // Nat. Rev. Cancer. —2001. —V. 1. —P. 151—157.
40. Lang S.M., Stratakis D.E., Frendling A. Detection of K-ras and p53 mutations in bronchoscopically obtained malighnant and non-malignant tissue from patients with non-small cell lung cancer // Eur. J. Med. Res. —2000. —V. 5. —P. 341—346.
41. Locb L.A. A mutator phenotype in cancer // Cancer Res. —2001. —V. 61. —P. 1403—1410.
42. Mao L., Hruban R.H., Boyle J.O. et al. Detection of oncogene mutation in sputum precedes diagnosis of lung cancer // Cancer Res. —1994. —V. 54. —P. 1634—1637.
43. Melikian A.A., Suw P., Prokopcruk P. et al. Identification of benzo[a]pyrene metabolities in cervical mucus and DNA adducts in cervical tissue in humans // Cancer Lett. —1999. —V. 146. —N2. —P. 127—134.
44. Merchant M., Weinberger S.R. Recent advancements in surface enhanced in SELDI — time of flight mass spectrometry // Electrophoresis. —2000. —V. 21. —P. 164—177.
45. Palmisano W.A., Davine K.V., Saccomanno G. et al. Predicting lung cancer by detecting abberant promoter methylation in sputum // Cancer Res. —2000. —V. 60. —P. 5954—5958. 46. Pelkonen O., Rannio H., Metabolic activation of toxins: tissue — specific expression and metabolism in target organs // Environ. Health Perspect. —1997. —V. 105 (Suppl. 4). —P. 767—774.
47. Pelkonen O., Rannio H., Rantio A. et al. Xenobiotic — metabolizing enrymes and cancer risk: correspondence between genotype and phenotype // IARC Sci Publ. —1999. —V. 148. —P. 77—88.
48. Perera F.P. Molecular epidemiology: Insights into cancer susceptibility, risk assessment, and prevention // J. Natl. Cancer Inst. —1996. —V. 88. —P. 496—509.
49. Pfeifer G.P., Denissenko M.F., Pao A. Preferential formation of penzo(a) pyren adducts at lung cancer mutational hotspots in p53 // Science—1996. —V. 274. —P. 430—432.
50. Poon T.C., Johnson P.J. Proteome analysis and its impact on the discovery of serological tumor markers // Clin. Chim. Acta. —2001. —V. 313. —P. 231—239.
51. Rojas M., Cascorbi L., Alexandrov K. et al. Modulation of benzopyrene diolepoxide — DNA adduct levels in human with blood cells by CYP 1A1, GSTM 1 and GSTT 1 polymorphism // Carcinogenesis—2000. —V. 21. —P. 35—41.
52. Sanches-Cespedes M., Ahrendt S.A., Piantadosi. et al. Chromosomal alterations in lung adenocarcinoma from smokers and nonsmokers // Cancer Res. —2001. —V. 61. —P. 1309—1313.
53. Sekido Y., Fong K.M., Minna J.D. Progress in understanding the molecular pathogenesis of human lung cancer // Biochem. Biophys. Acta. —1998. —V. 1378. —P. 21—25.
54. Shields P. G. , Harris C. C. Cancer risk and low —penetrance susceptibility genes in gene-environment interactions // J. Clin. Oncol. —2000. —V. 18. —P. 2309—2315.
55. Sizzen F., Zhivotovsky B., Nilsson A. Higher sponfaneous apoptotic index in small cell compared with non-small cell lung carcinoma cell lines lack of correlation with Bcl-2 / Bax. // Lung Cancer. —1998. —V. 22(1). —P. 1—13.
56. Sonssi T. p53 antibodies in the sera of patients with various types of cancer // Cancer Res. —2000. —V. 60(7). —P. 1777—1787.
57. Spitz M.E., Wu X., Wang Y. et al. Modulation of nucleotide excision repair capacity by XPD polymorphism in lung cancer patients // Cancer Res. —2001. —V. 61. —P. 1354—1357.
58. Stoeckli M., Chanrand P., Hallahan D.E. et al. Imaging mass spectrometry: a new technology for the analysis of protein expression // Nat. Med. —2001. —V. 7. —P. 493—496.
59. Stomakhin A.A., Vasiliskov V.A., Timofeel E. et al. DNA sequence analysis by hibridization with oligonucleotide microchips: MALDI masspectrometry identification of 5-mers Contignously stacked to microchip oligonucleotide // Nucl. Acids Res. —2000. —V. 28. —P. 1193—1198.
60. Tanaka F., Otake Y., Yanagihava K. et al. Apoptosis and p53 status predict the efficacy of postoperative administration of UFT in non-small cell lung cancer // Br. J. Cancer. —2001. —V. 84. —P. 263—269.
61. Tanigava M., Gotoh M., Machida M. et al. Detection and mapping of mismatched base pair in DNA moleculs by atomic force microcopy. // Nucl. Acids Res. —2000. —V. 28. —P. 38—47.
62. Tilib S.V., Mirrabekov A.D. Advances in analysis of DNA sequence variations using oligonucleotide microchip technology // Curr. Opin. Biothechnol. —2001. —V. 12. —P. 53—58.
63. Tycrs M., Mann M. From genomics to proteomics // Nature. —2003. —V. 13. —P. 193—197.
64. Vahakangas K. Ethical of genomic analysis of individual susceptibility to diseases // Mutat Res. —2001. —V. 482. —P. 105—110.
65. Vahakangas K., Pelkonen O. Host variations in carcinogen metabolism and DNA repair. In: Genetic Epidemiology of Cancer (Eds: H.T. Lynch, T. Hirayama) CRC Press, Boca Raton. —P. 35—54.
66. Wei Q., Cheng L., Amos C.I., et al. Repair of tobacco carcinogen — induced DNA adducts and lung cancer risk: a molecular epidemiologic study // J. Natl. Cancer Inst. —2000. —V. 92. —P. 1764—1772.
67. Woodson K., Mason J., Choi S.W. et al. Hypomethylation of p53 in peripheral blood DNA is associated with the development of lung cancer // Cancer Epidemiol. —Biomarkers Prev. —2001. —V. 10. —P. 69—74.
68. Yuan J.M., Ross R.K., Wang X.E. et al. Morbidity and mortality in relation to cigarette smoking in Shanghai China // JAMA. —1996. —V. 275. —N21. —P. 1646—1650.
69. Zochbauer-Muller S., Fong K.M., Virmany N. et al. Abberant promotor methylation of multiple genes in non-small cell lung cancer // Cancer Res. —2001. —V. 61. —P. 249—255.


| Зміст |