|
ЛІКУВАННЯ ІНТОКСИКАЦІЙ УДК 616.45-001.1/3:599.323.4:577.156.5:546.49 Л.М. Cамохина, к.б.н. ВЛИЯНИЕ ПЕНТОКСИФИЛЛИНА НА АКТИВНОСТЬ ХИМАЗЫ, ТОНИНА И ЭЛАСТАЗЫ У КРЫС ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ ХЛОРИДОМ РТУТИИнститут терапии АМН Украины, г. Харьков Пентоксифиллин (ПФ) — 3,7-диметил-1-(5-оксогексил)-ксантин — имеет антиоксидантные, противовоспалительные, бронхолитические, сосудорасширяющие, антиагрегационные, антиаллергические, противоопухолевые свойства [1]. Его применяют при сердечно-сосудистых заболеваниях, хронических патологиях печени, вирусном гепатите и др. Многоплановость клинических эффектов обусловливает и разнообразие побочных реакций, механизмы которых остаются малоизученными [1, 2]. Известно, что іn vitro ПФ в дозе более 100 мкг/мл способствует увеличению высвобождения макрофагами провоспалительного цитокина интерлейкина-12 Исследования, проведенные нами ранее, позволили выявить, что введение хлорида ртути в организм активирует ферменты альтернативных путей образования вазоконстрикторного пептида ангиотензина II (АII), такие как химаза, тонин, и один из наиболее сильных деструктивных ферментов нейтрофилов — сериновую эластазу [4]. ПФ подавляет вазоконстрикцию, ингибирует активацию лейкоцитов [5]. Учитывая указанные свойства ПФ, целью настоящего исследования было определить его влияние на активность химазы, тонина и высвобождение сериновой эластазы в тканях жизненно важных органов крыс в условиях интоксикации, вызванной введением хлорида ртути. Материалы и методы исследования В экспериментах использовали крыс-самцов линии Вистар 3 мес. возраста, которым вводили хлорид ртути (HgCl2) в 0,9% растворе NaCl из расчета 0,7 мг на 100 г массы тела [4]. Отдельной группе животных за 2 ч до введения хлорида ртути вводили внутрибрюшинно раствор ПФ из расчета 15 мг на 100 г массы тела [3]. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор в соответствующем объеме. Крыс декапитировали (под рауш-наркозом) через 2 ч после инъекции хлорида ртути. Печень перфузировали охлажденным физиологическим раствором. Ткани легкого, сердца, печени и почек (300 мг) гомогенизировали в 3 мл Na-фосфатного буфера рН 7,4 при 4—6°С, затем центрифугировали 10 мин при 5000 g на центрифуге РС-6 при 4°С. Хранили при -20°С до анализа. Активность эластазы, тонина, химазы определяли с использованием высокочувствительных (10-9—10-10 г) ферментативных методов [4]. Принцип метода основан на использовании для проведения протеолитической реакции иммобилизованных на полистироле комплексов маркерного фермента (пероксидаза хрена) и субстратов белковой природы. Определяли остаточную активность маркерного фермента при 492 нм. Для оценки эластазы субстратом служил N-Succinyl-Ala-Ala-Val, в качестве контрольных образцов использовали эластазу активностью от 0,0005 до 0,5 Ед/мл. Для определения тонина предварительно ингибировали активность калликреин-подобных ферментов добавлением 1:1 по объему апротинина (20 мкг/мл) и инкубировали 5 мин при 37°С. Затем проводили реакцию расщепления иммобилизованного комплекса маркерного фермента и протаминсульфата. Для определения активности химазы проводили отдельно реакцию ингибирования ферментов, таких как трипсин, плазмин, сывороточный калликреин, а также тонина (имеет и трипсин-, и химотрипсинподобную активность) добавлением 1:1 по объему соевого ингибитора трипсина в концентрации 0,01 мкг/мл и инкубировали 5 мин при 37°С. Затем проводили реакцию расщепления иммобилизованного комплекса маркерного фермента и фрагмента 4-8 АII. В качестве контроля при исследовании активности химазы, тонина, использовали рабочий буферный раствор. Активность химазы, тонина выражали в Е (мкмоль субстрата в мин), эластазы — в Ед/г ткани. В исследованиях использовали пероксидазу хрена, протаминсульфат, эластазу (Россия), соевый ингибитор трипсина производства "Reanal" (Венгрия), фрагмент 4-8 АII, апротинин, N-Succinyl-Ala-Ala-Val фирмы ''ICN'' (США), полистироловые плашки фирмы "Linbro" (США) и многоканальный микроспектрофотометр фирмы "Flow" (Великобритания). Полученные данные обработаны cтатистически согласно метода Стьюдента-Фишера. Результаты и их обсуждение Показано, что интоксикация хлоридом ртути приводит к активации эластазы, тонина, химазы в тканях жизненно важных органов крыс, что согласуется с данными предыдущего исследования [4]. Сравнительный анализ результатов позволил отметить наиболее существенный характер изменений в печени, заключающийся в достоверном повышении активности всех исследуемых протеиназ, что может быть обусловлено участием печени в обезвреживании токсических веществ. Кроме того, выявлено значимое увеличение активности эластазы в сердце, указывающее на развитие деструктивных процессов. Отмечено повышение активности тонина во всех исследуемых органах, химазы — в легких. Указанные изменения в легких, печени и почках связывали с окислением a-2-макроглобулина (a-2-МГ), их существенного ингибитора. Активацией химазы, тонина (особенно в сердце) объясняли развитие вазоконстрикторных эффектов в условиях интоксикации хлоридом ртути. В результате предварительного введения ПФ крысам, которым затем вводили хлорид ртути, выявлено снижение активности эластазы и приближение ее к контрольному уровню во всех исследуемых органах (рис. 1). Активность тонина также снижалась во всех органах, при этом в сердце и почках она оставалась существенно выше нормы (рис. 2). Активность химазы снижалась в печени, а в других исследуемых тканях повышалась, особенно в сердце (рис. 3). Снижение активности эластазы вследствие предварительного введения ПФ в условиях интоксикации хлоридом ртути указывает на путь, обеспечивающий проявление способности ПФ ограничивать эффекты активации нейтрофилов, что было отмечено другими авторами [1, 5]. Нормализация активности эластазы подтверждает высказанное ранее предположение, что снижение уровня протеиназ под действием ПФ обусловлено повышением уровня цАМФ в нейтрофилах, подавлением хемотаксиса, секреторной дегрануляции и адгезии нейтрофилов [3]. ПФ дозозависимо увеличивает уровни цАМФ в нейтрофилах [6]. Следовательно, доза (15 мг на 100 г массы тела), примененная в данном исследовании, является оптимальной для предупреждения деструктивных эффектов, связанных с активацией эластазы нейтрофилов в условиях интоксикации. Способность ксантинов подавлять фосфодиэстеразу цАМФ считают основой их механизма действия, связанного с развитием бронходилатации, расширением сосудов [1]. Учитывая выявленное снижение активности тонина под действием ПФ в условиях интоксикации, можно утверждать, что в формировании бронхо- и вазодилататорного эффектов ПФ немаловажную роль играет снижение активности данного фермента. Выявленные нами изменения активности химазы под действием ПФ при интоксикации могут свидетельствовать о лимитировании ее синтеза тучными клетками в печени. Можно предположить, что предотвращение повышения активности химазы является одним из механизмов, обеспечивающих торможение развития токсических эффектов ртути в печени, возможность проявления которых отмечена другими авторами [7]. Эффективность ПФ при интоксикации оказалась недостаточной в отдельных тканях: высокие уровни тонина и химазы в сердце и почках могут способствовать повышению уровня АII, а значит — развитию вазоконстрикторных эффектов. Активация ферментов альтернативных путей образования АII приводит к реструктуризации этих органов-мишеней с последующей органной дисфункцией [8]. Ранее нами на фоне предварительного введения ПФ при окислительном стрессе, вызванном введением хлорида ртути, было отмечено повышение уровня a-2-МГ в сердце [3]. Учитывая существенную роль данного ингибитора в подавлении активности химазы и тонина [9], можно предполагать, что повышение уровня a-2-МГ обеспечивает локальную защиту от чрезмерной активации АII-образующих ферментов. Отсутствие увеличения уровня a-2-МГ в почках может быть непосредственно связано с развитием вазоконстрикторных эффектов. Как и некроз проксимальных канальцев, указанные эффекты могут быть обусловлены наличием метил-ртути в почках, где происходит ее детоксикация. Отмеченное повышение уровня химазы в легких при введении ПФ в условиях интоксикации может обусловливать развитие легочной гипертензии. Контрольное введение ПФ крысам, которым хлорид ртути не вводили, позволило обнаружить существенное повышение активности эластазы в сердце и снижение в печени и почках. Активность тонина при этом снижалась в легких и повышалась в сердце, печени и почках. Выявлено, что в почках уровень тонина достигает такового, наблюдаемого при введении хлорида ртути. Уровень химазы в сердце под действием ПФ увеличивался практически в 2 раза. Таким образом, ПФ при отсутствии интоксикации может вызывать развитие деструктивных процессов в сердце за счет активации эластазы. Кроме того, ПФ в указанных условиях может стимулировать синтез и высвобождение тонина в печени, в результате — способствовать увеличению его уровня в сердце и почках, активации образования АII. Снижение активности тонина в легких при этом может свидетельствовать о бронходилататорном эффекте ПФ, но в то же время не исключено и расходование тонина на образование АII и развитие легочной капиллярной гипертензии. В сердце под действием ПФ может наблюдаться усиленный вазоконстрикторный эффект за счет увеличения активности и тонина, и химазы. Следует также отметить, что ПФ в дозе 10 мг/кг увеличивает сердечный кровоток [10]. Доза, применяемая нами, существенно выше, что может обусловливать органоспецифическое повышение ферментативной активности и компенсаторное увеличение уровня ингибиторов протеиназ, отмеченное ранее [3]. Указанные эффекты согласуются с возможностью проявления аритмии в случаях передозировки при использовании ксантинов, наиболее опасными из которых являются тремор предсердий и фибрилляция желудочков [1]. Таким образом, применение ПФ в условиях интоксикации хлоридом ртути не предотвращает повышение активности отдельных ферментов альтернативных путей образования АII, таких как тонин, химаза. При отсутствии интоксикации ПФ провоцирует развитие не только вазоконстрикции, но и деструктивных процессов за счет активации эластазы. Литература |