ТОКСИНИ МІКРООРГАНІЗМІВ

УДК 579.841.11.114

Н.В. Винарская, к.б.н., Л.Б. Скоклюк, Л.Д. Варбанец, д.б.н.

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОТОКСИНОВ RAHNELLA AQUATILIS (ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ)

Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, г. Киев

Rahnella aquatilis является относительно новым видом Enterobacteriaceae, который был описан исследователями в 1976—1979 гг. [1, 2]. Кроме открытых водоемов, Rahnella aquatilis изолировали из почвы (чаще всего из ризосферы злаковых: пшеницы, кукурузы, риса), а также клинического материала. Они являются патогенными агентами, вызывающими заболевание мочеполовой системы, органов дыхания, сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта. Как и другие условно-патогенные бактерии, штамы Rahnella aquatilis характеризуются широким клиническим спектром заболеваний (рахнеллезов), который они вызывают. Известно, что ведущую роль в патогенезе заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями, играют эндотоксины (липополисахариды). Что касается Rahnella aquatilis, то, кроме одной нашей статьи [3], в литературе отсутствуют данные по изолированию и химической характеристике их липополисахаридов, что и явилось целью данной работы.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили 2 штамма Rahnella aquatilis ЛЭПМД 95U003 и 95U004, выделенных из испражнений больных диареей в лаборатории новых и малоизученных инфекционных заболеваний Института микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины (г. Харьков). Культуры Rahnella aquatilis были любезно предоставлены нам зав. лаболаторией, канд. мед. наук С.И. Похилом.

Культуры выращивали в матрацах с МПА в течение 24 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об 40 мин, высушивали обработкой ацетоном и эфиром.

Выделение и очистку липополисахаридов проводили по методу [4]. ЛПС экстрагировали из высушенных клеток 45%-ным водным фенолом при 65—68°С. Водный слой диализировали против водопроводной, затем дистиллированной воды, очищали от нуклеиновых кислот путем осаждения насыщенным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и трехкратного ценрифугирования при 144.000 g 40 мин, после чего лиофилизировали.

Фракции ЛПС анализировали на наличие белка по методу [5], углеводов — [6], нуклеиновых кислот — [7]. Гептозы определяли реакцией с цистеином и серной кислотой [8], содержание 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (КДО) — реакцией с тиобарбитуровой кислотой [9]. Фракцию липида А получали путем кислотного гидролиза в 4% уксусной кислоте (12—14 ч, 100°С). Фракции, соответствующие О-специфической полисахаридной цепи (О-ПС) и олигосахариду кора (ОГ-кор), выделяли гель-фильтрацией углеводной части деградированного ЛПС на колонке с сефадексом G-50, используя пиридин-ацетатный буфер (рН 5,0).

Для идентификации нейтральных моносахаридов препараты гидролизировали 2N HCl в течение 5 ч при 100°С, а затем анализировали методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) в виде ацетатов полиолов [10] на приборе марки "Chrom-5" с пламенно-ионизационным детектором на колонке (3,0 мм•1,2 м) с 3%-ным неопентилсукцинатом на хромосорбе W (80—100 меш) при режиме хроматографии 170—200°C (3°С/мин).

Содержание аминокислот и гексозаминов определяли после гидролиза 6N HCl в течение 20 ч при 100°С на анализаторе аминокислот KLA-5 ("Hitachi", Япония).

Электрофорез ЛПС проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) в системе додецилсульфата натрия согласно метода [11]. Препараты ЛПС после электрофоретического распределения окрашивали азотнокислым серебром согласно метода [12].

Антисыворотку к гретой (2,5 ч, 100°С) культуре типового штамм 33071 R. aquatilis получали в результате четырёх внутривенных иммунизаций кроликов возрастающими дозами суспензии микробных тел (от 2?106 до 5?107 клеток/мл) с интервалами между инъекциями 7 суток. Животных обескровливали на 7-е сут после последней инъекции.

Антигенную активность ЛПС изучали реакцией двойной иммунодиффузии в агаре по методу Оухтерлони [13]. Имуноэлектрофорез проводили с использованием двух модификаций: микроэлектрофореза [14] и ракетного электрофореза [15].

Результаты и их обсуждение

В современной литературе практически не встречаются работы, посвященные изучению ЛПС R. aquatilis. Поэтому нами были получены и химически охарактеризованы ЛПС R. aquatilis штаммов ЛЭПМД 95U003 и 95U004, выделенные из испражнений больных диареей.

Несмотря на то, что экстракция ЛПС проводилась в одинаковых условиях, их относительное содержание у штаммов 95U003 и 95U004 несколько отличалось: конечный выход препаратов по отношению к сухому весу клетки составлял 15,8 и 11,7%, соответственно.

Известно, что при выделении ЛПС в тех случаях, когда необходимо получить препараты, характеризующиеся высоким содержанием углеводов и минимальным количеством примесей белковой природы, особое предпочтение отдается методу водно-фенольной экстракции. Однако, наряду с преимуществами, этот метод обладает рядом недостатков. С одной стороны, при экстрагировании ЛПС горячим фенолом может происходить расщепление чувствительных к растворителю связей внутри молекулы липида А, что обусловливает частичную деградацию ЛПС. С другой стороны, водно-фенольный метод используется и для выделения нуклеиновых кислот, которые экстрагируются в фенольный слой смеси, в то время как ЛПС — в водный слой. Такой метод получения препаратов ЛПС может обусловливать повышенное содержание в нем нуклеиновых кислот в качестве примесей. Эта проблема эффективно решается при использовании нескольких циклов ультрацентрифугирования и/или осаждения насыщенным раствором ТХУ, образующей с нуклеиновыми кислотами нерастворимые комплексы. В очищенных препаратах ЛПС шт. 95U003 и 95U004 R. aquatilis содержалось углеводов 64 и 85,5%, белка 0,8 и 1,6%, нуклеиновых кислот — 0,4 и 0,6%, соответственно (табл. 1).

Изучение моносахаридного состава ЛПС исследуемых штаммов R. aquatilis (табл. 2) показало, что доминирующими моносахаридами являются галактоза, манноза и глюкоза. Содержание рамнозы в ЛПС шт. 95u004 приблизительно в 4 раза выше, а арабинозы — ниже, чем в ЛПС шт. 95u003. Из гексозаминов обнаружен глюкозамин 0,5 и 4,7% в шт. 95u003 и 95u004, соответственно, галактозамин присутствовал только в составе ЛПС шт 95u004 (0,7%).

В ЛПС исследуемых штаммов R. aquatilis были выявлены компоненты олигосахарида кора: L-глицеро-D-манногептоза и 2-кето-3-дезокси-D-маннооктоновая кислота (КДО), которые редко встречаются в других природных биополимерах (табл. 2). Содержание гептоз в ЛПС исследуемых штаммов R. aquatilis 95U003 и 95U004, составило 2,2 и 6,3%, соответственно. КДО в препаратах недеградированных ЛПС была выявлена в следовых количествах — 0,07 и 0,03%, соответственно. КДО является единственным структурным компонентом, который присутствует во всех ЛПС, независимо от их бактериального происхождения. Бактерии с дефектом в биосинтезе КДО не являются жизнеспособными. Это указывает на то, что КДО абсолютно необходима для структурной и функциональной целостности бактериальной клетки. Однако неспособность выявить КДО в недеградированном ЛПС обусловлена сложностью ее структуры. Она является полифункциональной сахарной кислотой с 8 атомами углерода, несущими карбоксильную, гидроксильную, кето- и дезоксигруппы. Этот факт объясняет чрезвычайную чувствительность КДО к действию кислот и других химических реактивов.

Анализ состава аминокислот ЛПС R. aquatilis (табл. 3) показал, что эти вещества присутствуют в незначительных количествах: от 0,10 до 1,32%. Преобладающими для ЛПС шт.95u003 r. aquatilis были глутаминовая кислота, гистидин, глицин и аланин, а для шт.95u004 — глутаминовая кислота, глицин, аспарагиновая кислота, гистидин и аланин.

ЛПС представляет собой комплексную молекулу, в которой углеводная часть присоединена к липиду А гликозидной связью остатка КДО. Эта связь отличается высокой кислотолабильностью, поэтому она может быть избирательно расщеплена в условиях мягкого кислотного гидролиза. Благодаря этому ЛПС можно легко разделить на нерастворимый в воде липид А и водорастворимый углеводный материал (так называемый деградированный липополисахарид). Характерным свойством ЛПС штаммов 95U003 и 95U004 R. aquatilis является то, что для расщепления связи между углеводной частью и липидом А необходимы более жесткие условия гидролиза (4% уксусная кислота, 12—14 ч, 100°С) по сравнению с ЛПС других грамотрицательных бактерий (1% уксусная кислота, 1,5—2 ч, 100°С). Это свидетельствует об устойчивости кетозидной связи в ЛПС исследованных штаммов R. aquatilis. Выход липида А в результате деградации незначительный (5,2 и 7,8%, соответственно для шт. 95U003 и 95U004). Другие структурные компоненты — О-специфический полисахарид (О-ПС) (фракция І) и олигосахарид кора (фракции ІІ и ІІІ) получали после гель-фильтрации на сефадексе G-50 углеводной части деградированных молекул ЛПС исследуемых штаммов R. aquatilis. Профили элюции углеводной части (рис. 1 и 2) указывают на то, что в исходных ЛПС, а следовательно, и в популяции бактерий исследуемых штаммов, содержится ЛПС в s- и r-формах: преобладающими являются высокомолекулярные фракции О-ПС, однако, присутствуют и низкомолекулярные фракции ОГ-кора. Такого рода гетерогенность может иметь биологическое значение, поскольку она способствует более плотной упаковке молекул ЛПС s- и r-форм на клеточной поверхности.

Изучение моносахаридного состава О-ПС и ОГ-кора исследуемых штаммов показало, что в качестве основных нейтральных моносахаридов присутствуют галактоза, глюкоза, манноза. Кроме того, в О-ПС и ОГ-кора шт. 95U004 присутствовала фукоза, а рамноза в незначительном количестве была выявлена в О-ПС шт. 95U004 и ОГ-кора шт. 95U003 (табл. 2).

Как и в исходных молекулах ЛПС исследуемых штаммов, так и в их О-ПС и ОГ-кора присутствовали аминокислоты: преобладающими являются глицин и глутаминовая кислота — R. aquatilis шт. 95U003; метионин, серин, глутаминовая кислота и изолейцин — R. aquatilis шт. 95U004 (табл. 3).

До недавнего времени считали, что аминокислоты, которые определяются в ЛПС, являются следствием загрязнения его белком при выделении. Однако в последние годы установлено, что аминокислоты могут входить в состав ЛПС. Так, установлено [16], что необычным свойством Proteus mirabilis О27 является присутствие в О-ПС неуглеводных заместителей: двух аминокислот — L-лизина и L-аланина, присоединенных через амидную группу к карбоксильным группам уроновых кислот, и этаноламина, присоединенного в положении 6-N-ацетилглюкозамина фосфодиэфирной связью. Авторы предположили, что аминосоединения играют определенную роль в проявлении биологической активности. В дальнейшем были обнаружены L-серин и L-лизин в структуре О-ПС P. mirabilis О28. Показано, что поликлональная антисыворотка узнает эпитоп, содержащий D-GalpA-лизин (а не D-GalpA-Ser), в котором остаток галактуроновой кислоты играет иммунодоминантную роль.

ДСН-ПААГ электрофорез ЛПС исследуемых штаммов показал типичное для ЛПС S-формы бимодальное распределение. ЛПС в клетках представлены гетерогенной популяцией, которая включает два основных типа молекул: высокомолекулярный S-ЛПС с О-цепями разной длины и низкомолекулярный R-ЛПС, который не содержит О-специфических полисахаридных звеньев. При электрофоретическом исследовании удалось выявить также менее выраженную фракцию SR-ЛПС с малым числом мономерных звеньев в О-цепи (рис. 3).

При исследовании антигенных свойств ЛПС шт. 95U003 и 95U004 R. aquatilis в качестве антител использовали поликлональную О-антисыворотку, полученную к убитой нагреванием культуре типового штамма 33071 R. aquatilis.

В реакциях двойной иммунодиффузии в агаре по Оухтерлони, иммуноэлектрофореза и ракетного иммуноэлектрофореза ЛПС R. aquatilis штаммов 95U003 95U004 перекрестно реагировали с антисывороткой к типовому штамму R. aquatilis ATCC 33071 (рис. 4, 5 и 6), что свидетельствует о наличии у них общих антигенных детерминант, то-есть о принадлежности исследуемых штаммов к одной и той же серогруппе, что и типовой штамм.

Таким образом, из двух штаммов R. aquatilis, выделенных из испражнений больных диареей, изолированы липополисахариды (эндотоксины), проведена их химическая идентификация, изучен мономерный состав. Показано, что R. aquatilis 95U003 и 95U004 проявляют перекрестные серологические реакции с типовым штаммом 33071. Эти данные дают основание предположить аналогию в структуре их О-специфических полисахаридных цепей, которые являются ответственными за О-антигенную специфичность липополисахаридов.

Литература
1. Gavini F., Ferragut C., Lefebre B., Leclerc H. Etude taxonomique d'enterobacteries appurtenant ou apparentees au genre Enreobacter // Ann. Microbiol. Inst. Pasteur. —1976. —127, B. —P. 317—335.
2. Izard D., Gavini F., Frinel P., Leclerk H. Rahnella aquatilis, nouveaumembre de la famille des Enterobacteriaceae // Ann. Microbiol. Inst. Pasteur. —1979. —130, A. —P. 163—167.
3. Варбанец Л.Д., Остапчук А.Н., Винарская Н.В. Выделение и характеристика липополисахаридов Rahnella aquatilis // Мікробіол. журн.-2004. —66, №2. —С. 25—34.
4. Westphal O. and Jann K. Bacterial lipopolysaccharides extraction with phenol-water and further application of the procedure. // In: Methods in Carbohydrate Chemistry (Whistler, R.L. and Wolfrom, M.L., Eds.) —Academic Press, New York. —1965. —5. —P. 83—91.
5. Lowry O., Rosenbrogh N., Farr A., Randall R. Protein measurement with the Folin reagent // J. Biol. Chem. —1951. —133, №1. —P. 265—275.
6. Dubois M., Gilles K., Hamilton J., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Annal. Chem. —1956. —28, №2. —P. 350—356.
7. Спирин А.С. Определение нуклеиновых кислот // Биохимия. —1958. —23, №5. —С. 656—662.
8. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. —Киев: Наук. думка, 1982. —189 с.
9. Droge W., Lehmann V., Luderitz T., Westphal O. Structural investigations on the 2-keto-3-deoxyoctonal region of lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. —1970. —114, №1. —P. 175—184.
10. Аlbershein P., Nevis D.J., English P.D., Karr A. A method for analysis of sugars in plant cell-wall polysaccharides by gas-liquid chromatography // Carbohydr. Res. —1976. —№3. —P. 340—345.
11. Laemmli U.K. Cleavage of proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. —227. —P. 680—685.
12. Tsai C.M., Frash C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrilamide gels // Anal. Biochem. —1982. —119. —P. 115—119.
13. Ouchterlony O. Diffusion —in —gel methods for immunological analysis // Prog. Allergy. —1962. —6. —P. 3—15.
14. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. —М: "Мир", 1982. —446 с.
15. Weeke B. Rocket immunoelectrophoresis // Scand. J. Immunol. —1973. —2. —P. 37—46.
16. Vinogradov E.V., Daeva E.D., Shashkov A.S. et al. Somatic antigens of pseudomonas: Structure of the O-specific polysaccharide chain of Pseudomonas gladioli pv. alliicola 8494 (serogroup X) lipopolysaccharide // Carboh. Res. —1991. —212. —P. 313—320.


| Зміст |