ТОКСИНИ МІКРООРГАНІЗМІВ УДК 579.841.11.114 Н.В. Винарская, к.б.н., Л.Б. Скоклюк, Л.Д. Варбанец, д.б.н. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОТОКСИНОВ RAHNELLA AQUATILIS (ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ)Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, г. Киев Rahnella aquatilis является относительно новым видом Enterobacteriaceae, который был описан исследователями в 1976—1979 гг. [1, 2]. Кроме открытых водоемов, Rahnella aquatilis изолировали из почвы (чаще всего из ризосферы злаковых: пшеницы, кукурузы, риса), а также клинического материала. Они являются патогенными агентами, вызывающими заболевание мочеполовой системы, органов дыхания, сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта. Как и другие условно-патогенные бактерии, штамы Rahnella aquatilis характеризуются широким клиническим спектром заболеваний (рахнеллезов), который они вызывают. Известно, что ведущую роль в патогенезе заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями, играют эндотоксины (липополисахариды). Что касается Rahnella aquatilis, то, кроме одной нашей статьи [3], в литературе отсутствуют данные по изолированию и химической характеристике их липополисахаридов, что и явилось целью данной работы. Материалы и методы исследования Объектами исследования служили 2 штамма Rahnella aquatilis ЛЭПМД 95U003 и 95U004, выделенных из испражнений больных диареей в лаборатории новых и малоизученных инфекционных заболеваний Института микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины (г. Харьков). Культуры Rahnella aquatilis были любезно предоставлены нам зав. лаболаторией, канд. мед. наук С.И. Похилом. Культуры выращивали в матрацах с МПА в течение 24 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об 40 мин, высушивали обработкой ацетоном и эфиром. Выделение и очистку липополисахаридов проводили по методу [4]. ЛПС экстрагировали из высушенных клеток Фракции ЛПС анализировали на наличие белка по методу [5], углеводов — [6], нуклеиновых кислот — [7]. Гептозы определяли реакцией с цистеином и серной кислотой [8], содержание 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (КДО) — реакцией с тиобарбитуровой кислотой [9].
Фракцию липида А получали путем кислотного гидролиза в 4% уксусной кислоте (12—14 ч, 100°С). Фракции, соответствующие О-специфической полисахаридной цепи Для идентификации нейтральных моносахаридов препараты гидролизировали 2N HCl в течение 5 ч при 100°С, а затем анализировали методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) в виде ацетатов полиолов [10] на приборе марки "Chrom-5" с пламенно-ионизационным детектором на колонке (3,0 мм1,2 м) с Содержание аминокислот и гексозаминов определяли после гидролиза 6N HCl в течение 20 ч при 100°С на анализаторе аминокислот KLA-5 ("Hitachi", Япония). Электрофорез ЛПС проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) в системе додецилсульфата натрия согласно метода [11]. Препараты ЛПС после электрофоретического распределения окрашивали азотнокислым серебром согласно метода [12]. Антисыворотку к гретой (2,5 ч, 100°С) культуре типового штамм 33071 R. aquatilis получали в результате четырёх внутривенных иммунизаций кроликов возрастающими дозами суспензии микробных тел (от 2?106 до 5?107 клеток/мл) с интервалами между инъекциями 7 суток. Животных обескровливали на Антигенную активность ЛПС изучали реакцией двойной иммунодиффузии в агаре по методу Оухтерлони [13]. Имуноэлектрофорез проводили с использованием двух модификаций: микроэлектрофореза [14] и ракетного электрофореза [15]. Результаты и их обсуждение В современной литературе практически не встречаются работы, посвященные изучению ЛПС R. aquatilis. Поэтому нами были получены и химически охарактеризованы ЛПС R. aquatilis штаммов ЛЭПМД 95U003 и 95U004, выделенные из испражнений больных диареей. Несмотря на то, что экстракция ЛПС проводилась в одинаковых условиях, их относительное содержание у штаммов 95U003 и 95U004 несколько отличалось: конечный выход препаратов по отношению к сухому весу клетки составлял 15,8 и 11,7%, соответственно. Известно, что при выделении ЛПС в тех случаях, когда необходимо получить препараты, характеризующиеся высоким содержанием углеводов и минимальным количеством примесей белковой природы, особое предпочтение отдается методу водно-фенольной экстракции. Однако, наряду с преимуществами, этот метод обладает рядом недостатков. С одной стороны, при экстрагировании ЛПС горячим фенолом может происходить расщепление чувствительных к растворителю связей внутри молекулы липида А, что обусловливает частичную деградацию ЛПС. С другой стороны, водно-фенольный метод используется и для выделения нуклеиновых кислот, которые экстрагируются в фенольный слой смеси, в то время как ЛПС — в водный слой. Такой метод получения препаратов ЛПС может обусловливать повышенное содержание в нем нуклеиновых кислот в качестве примесей. Эта проблема эффективно решается при использовании нескольких циклов ультрацентрифугирования и/или осаждения насыщенным раствором ТХУ, образующей с нуклеиновыми кислотами нерастворимые комплексы. В очищенных препаратах ЛПС шт. 95U003 и 95U004 R. aquatilis содержалось углеводов 64 и 85,5%, белка 0,8 и 1,6%, нуклеиновых кислот — 0,4 и 0,6%, соответственно (табл. 1). Изучение моносахаридного состава ЛПС исследуемых штаммов R. aquatilis (табл. 2) показало, что доминирующими моносахаридами являются галактоза, манноза и глюкоза. Содержание рамнозы в ЛПС шт. 95u004 приблизительно в 4 раза выше, а арабинозы — ниже, чем в ЛПС шт. 95u003. Из гексозаминов обнаружен глюкозамин 0,5 и 4,7% в шт. 95u003 и 95u004, соответственно, галактозамин присутствовал только в составе ЛПС шт 95u004 (0,7%). В ЛПС исследуемых штаммов R. aquatilis были выявлены компоненты олигосахарида кора: L-глицеро-D-манногептоза и 2-кето-3-дезокси-D-маннооктоновая кислота (КДО), которые редко встречаются в других природных биополимерах (табл. 2). Содержание гептоз в ЛПС исследуемых штаммов R. aquatilis 95U003 и 95U004, составило 2,2 и 6,3%, соответственно. КДО в препаратах недеградированных ЛПС была выявлена в следовых количествах — 0,07 и 0,03%, соответственно. КДО является единственным структурным компонентом, который присутствует во всех ЛПС, независимо от их бактериального происхождения. Бактерии с дефектом в биосинтезе КДО не являются жизнеспособными. Это указывает на то, что КДО абсолютно необходима для структурной и функциональной целостности бактериальной клетки. Однако неспособность выявить КДО в недеградированном ЛПС обусловлена сложностью ее структуры. Она является полифункциональной сахарной кислотой с 8 атомами углерода, несущими карбоксильную, гидроксильную, кето- и дезоксигруппы. Этот факт объясняет чрезвычайную чувствительность КДО к действию кислот и других химических реактивов. Анализ состава аминокислот ЛПС R. aquatilis (табл. 3) показал, что эти вещества присутствуют в незначительных количествах: от 0,10 до 1,32%. Преобладающими для ЛПС шт.95u003 r. aquatilis были глутаминовая кислота, гистидин, глицин и аланин, а для шт.95u004 — глутаминовая кислота, глицин, аспарагиновая кислота, гистидин и аланин. ЛПС представляет собой комплексную молекулу, в которой углеводная часть присоединена к липиду А гликозидной связью остатка КДО. Эта связь отличается высокой кислотолабильностью, поэтому она может быть избирательно расщеплена в условиях мягкого кислотного гидролиза. Благодаря этому ЛПС можно легко разделить на нерастворимый в воде липид А и водорастворимый углеводный материал (так называемый деградированный липополисахарид). Характерным свойством ЛПС штаммов 95U003 и 95U004 R. aquatilis является то, что для расщепления связи между углеводной частью и липидом А необходимы более жесткие условия гидролиза (4% уксусная кислота, 12—14 ч, 100°С) по сравнению с ЛПС других грамотрицательных бактерий (1% уксусная кислота, 1,5—2 ч, 100°С). Это свидетельствует об устойчивости кетозидной связи в ЛПС исследованных штаммов R. aquatilis. Выход липида А в результате деградации незначительный (5,2 и 7,8%, соответственно для шт. 95U003 и 95U004). Другие структурные компоненты — О-специфический полисахарид Изучение моносахаридного состава Как и в исходных молекулах ЛПС исследуемых штаммов, так и в их До недавнего времени считали, что аминокислоты, которые определяются в ЛПС, являются следствием загрязнения его белком при выделении. Однако в последние годы установлено, что аминокислоты могут входить в состав ЛПС. Так, установлено [16], что необычным свойством Proteus mirabilis О27 является присутствие в ДСН-ПААГ электрофорез ЛПС исследуемых штаммов показал типичное для ЛПС S-формы бимодальное распределение. ЛПС в клетках представлены гетерогенной популяцией, которая включает два основных типа молекул: высокомолекулярный При исследовании антигенных свойств ЛПС шт. 95U003 и 95U004 R. aquatilis в качестве антител использовали поликлональную О-антисыворотку, полученную к убитой нагреванием культуре типового штамма 33071 R. aquatilis. В реакциях двойной иммунодиффузии в агаре по Оухтерлони, иммуноэлектрофореза и ракетного иммуноэлектрофореза ЛПС R. aquatilis штаммов 95U003 95U004 перекрестно реагировали с антисывороткой к типовому штамму R. aquatilis ATCC 33071 (рис. 4, 5 и 6), что свидетельствует о наличии у них общих антигенных детерминант, то-есть о принадлежности исследуемых штаммов к одной и той же серогруппе, что и типовой штамм. Таким образом, из двух штаммов R. aquatilis, выделенных из испражнений больных диареей, изолированы липополисахариды (эндотоксины), проведена их химическая идентификация, изучен мономерный состав. Показано, что R. aquatilis 95U003 и 95U004 проявляют перекрестные серологические реакции с типовым штаммом 33071. Эти данные дают основание предположить аналогию в структуре их О-специфических полисахаридных цепей, которые являются ответственными за О-антигенную специфичность липополисахаридов. Литература |