УДК 575.085.1+577.152.199.2(0.43.3)

С.Э. Огурцова, А.М. Войтович, к.б.н., К.Г. Елисеева, к.б.н., В.Д. Трусова, к.б.н., Э.В. Крупнова, к.б.н., В.Ю. Афонин, к.б.н.

РОЛЬ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ В ИЗМЕНЕНИИ ДИНАМИКИ ИНДУКЦИИ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА МЫШЕЙ РАЗЛИЧНЫМИ МУТАГЕНАМИ

Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, г. Минск

При изучении мутагенной активности различных химических веществ большое значение играет учет модификаций метаболической активации. В экспериментах in vivo подобные исследования проводятся редко, как правило, их осуществляют in vitro. Многие индукторы метаболизма находятся в окружающей среде как компоненты промышленного загрязнения, например b-нафтофлавон, или присутствуют в продуктах питания в качестве консервантов, как t-бутилгидрохинон (t-BHQ) [1]. Хроническое поступление подобных агентов в организм может изменять профиль мутагенных метаболитов изучаемых веществ. Это обстоятельство следует учитывать как при тестировании мутагенов in vivo, так и при проведении химиотерапии в медицинской практике, где эффективность многих препаратов определяется их воздействием на генетические структуры опухолевых клеток.

Поэтому основной задачей нашего исследования явилось сравнительное изучение динамики уровня аберрантных клеток костного мозга в условиях метаболической активации при введении в организм животных химиотерапевтического препарата диазиридинилбензохинона (AZQ) и известного мутагена 7,12-диметилбензантрацена (ДМБА). AZQ является хинонсодержащим препаратом, его используют в медицинской практике при химиотерапии опухолей [2]. AZQ оказывает цитотоксическое действие только после биоредуктивной активации, которая приводит к образованию реактивных метаболитов, повреждающих молекулу ДНК [3]. ДМБА является типичным представителем полициклических углеводородов, для которых хорошо известны метаболические пути с участием монооксигеназ [4].

Материалы и методы исследования

Эксперимент выполнен на половозрелых самцах мышей линии С57BL/6j с массой тела 20—25 г. Эти мыши относятся к "Ah-чувствительным" линиям и реагирует на введение индукторов метилхолантренового типа увеличением содержания в микросомах бензпиренгидроксилазы. Именно этот тип индукции связан с Ah-батареей генов. В качестве индукторов промутагенов использовали b-нафтофлавон и t-BHQ. b-нафтофлавон растворяли в кукурузном масле и вводили внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг в течение 3-х дней ежедневно. t-BHQ растворяли в льняном масле, вводили перорально в течение 5-ти дней в дозе 220 мг/кг. Через 1 сут после последней инъекции индукторов внутрибрюшинно вводили AZQ (в дозе 1 мг/кг) и ДМБА (75 мг/кг). Непосредственно перед введением AZQ растворяли в фосфатном буфере, а ДМБА в кукурузном масле. Мутагенный эффект определяли путем учета аберраций хромосом в клетках костного мозга.

Цитогенетические препараты костного мозга готовили согласно общепринятой методике [5] с предварительным введением колхицина, гипотонической обработкой KCl (0,56%), фиксацией в смеси метанол и уксусной кислоты (1:3). Статистическая обработка произведена с применением стандартных методов [6].

Результаты и их обсуждение

Для выбора точки фиксации, соответствующей максимальному выходу аберраций хромосом после введения одного мутагена, нами была получена кривая зависимости выхода аберраций хромосом от времени фиксации препаратов после введения AZQ. Как видно из рис. 1, частота аберрантных метафаз достигает своего максимума через 18 ч после введения azq. Именно в эти сроки фиксации после обработки мутагеном большинство клеток в отсутствие задержки клеточного цикла предположительно вступает в первый митоз и лишь незначительное число — во второй митоз [5]. Через 24, 30 и 36 ч наблюдается постепенное снижение выхода аберрантных клеток, очевидно, вследствие общего снижения профиля мутагенных метаболитов. В связи с этим для изучения модифицирующего действия индукторов выбрана фиксация через 18 ч. Динамика выхода аберрантных клеток после введения ДМБА была иной и максимальный уровень аберрантных клеток наблюдался через 48 ч (рис. 1). Подобная картина могла быть обусловлена задержкой части клеток в клеточном цикле, что подтверждается увеличением числа мультиаберрантных клеток при фиксации через 48 ч. Вероятно, гибель клеток с потенциальными повреждениями ДНК в этом случае была менее выражена.

При исследовании влияния индукции ферментов метаболизма ксенобиотиков необходимо было учесть вклад самих индукторов на цитогенетический эффект AZQ. Поэтому наряду с контрольной серией мышей, которым вводили только масло (контроль), исследованы 2 серии животных, которым вводили индукторы. Установлено (табл. 1), что 3-х кратное введение b-нафтофлавона не вызвало статистически значимого увеличения частоты аберрантных клеток (1,73±0,34%) по сравнению с контролем (0,83±0,35%). Пероральное введение в течение 5-ти дней t-bhq также не привело к статистически достоверному увеличению частоты аберрантных клеток. Поэтому при исследовании модифицирующего действия индукторов на мутагенный эффект azq, вкладом индукторов в частоту аберраций в клетках костного мозга можно пренебречь. Однако следует отметить, что небольшое увеличение уровня аберрантных клеток может косвенно свидетельствовать о вовлеченности дополнительного числа клеток в процессы пролиферации.

Из представленных данных (табл. 1.) видно, что процент аберрантных клеток костного мозга мышей через 18 ч после обработки AZQ составил 32,36±1,41, что во много раз выше по сравнению с контролем. Индукция экспрессии генов Ah-батареи b-нафтофлавоном привела к уменьшению цитогенетического эффекта AZQ. Это не согласуется с данными литературы, где b-нафтофлавон приводил к увеличению мутагенного эффекта ряда других противоопухолевых химиотерапевтических препаратов [7]. b-Hафтофлавон является эффективным индуктором цитохрома Р-450 и относится к бифункциональным индукторам, повышающим активность ферментов первой и второй фазы биотрансформации ксенобиотиков. Однако степень индукции ферментов второй фазы значительно ниже индукции цитохрома Р-450. Монооксигеназная система во многих случаях вызывает изменение биологических эффектов изначально инертных ксенобиотиков путем превращения их в токсические или реактивные продукты. Последние, в свою очередь, способны повреждать внутриклеточные макромолекулы и приводить к токсическим, мутагенным и канцерогенным эффектам [8].

Из табл. 1 видно, что в вариантах, где AZQ вводили на фоне индукции монооксигеназ t-BHQ, частота аберрантных клеток была статистически достоверно ниже, чем в вариантах без предварительной индукции. Процент аберрантных клеток снизился с 32,36±1,41 до 22,00±096. Индукция транскрипции Ah-батареи генов t-BHQ привела не только к уменьшению выхода аберрантных клеток, но и к снижению нагруженности их аберрациями за счет уменьшения количества клеток с 2, 3 и более аберрациями (рис. 2). Поэтому при введении azq на фоне индукции t-bhq наблюдалось снижение среднего числа аберраций хромосом как на аберрантную, так и на исследованную клетку (табл. 1).

Предварительная индукция Ah-батареи генов b-нафтофлавоном и t-BHQ фактически привела к уменьшению мутагенного эффекта AZQ в той точке фиксации, где следовало ожидать максимальной реализации цитогенетических повреждений. Можно предположить, что AZQ на фоне индукции b-нафтофлавоном вызывает апоптоз части клеток в первые часы после введения промутагена и основная масса клеток с повреждениями ДНК гибнет в первые часы после воздействия AZQ. Поэтому при более поздних сроках фиксации не наблюдается увеличение выхода клеток с аберрациями. Для окончательных выводов необходимы дополнительные исследования по изучению цитогенетического действия AZQ на фоне индукции b-нафтофлавоном в более ранние сроки фиксации. Подобное исследование было выполнено в эксперименте с использованием ДМБА.

Как видно из табл. 2, предварительная индукция монооксигеназ b-нафтофлавоном привела к статистически достоверному увеличению процента аберрантных клеток через 12 ч после введения промутагена. Через 48 ч этот индуктор оказал обратное действие, снизив цитогенетический эффект ДМБА. Усиление цитогенетического эффекта ДМБА через 12 ч на фоне индукции монооксигеназ b-нафтофлавоном объяснимо, если исходить из того, что этот индуктор активирует транскрипцию гена Р-4501А1 с последующим синтезом арилуглеводородгидроксилазы, что направляет метаболизм ДМБА по "мутагенному" диол-эпоксидному пути, а также увеличивает скорость образования реактивных метаболитов [4]. Это привело к появлению максимума в более ранние сроки и снижению эффекта к 48 ч,что стало причиной уменьшения частоты аберраций к этому времени.

Таким образом, индукторы метаболизма способны оказывать значительное воздействие на мутагенную активность соединений хинонового ряда в те сроки фиксации, когда можно ожидать максимальный уровень аберрантных клеток костного мозга. Это обстоятельство следует учитывать при скрининге потенциальных мутагенов и в клинической практике.

Литература
1. Stuckey B.N. Antioxidants as food stabilizers // Hand book of food additives. Ed. by Furia T.E. —OH.: Cleveland, 1968. —P. 209—245.
2. Ross D., Beall H., Traver R.D. Bioactivation of quinones by DT-disphorase, molecular, biochemical, and chemical studies // Onc. Res. —1994. —V. 6. —P. 493—500.
3. Ross D., Siegel D., Beall H. DT-diaphorase un activation and detoxification of quinones // Cancer and Met. Rev. —1993. —V. 12. —P. 83—101.
4. Glatt E., Oesch F. Structural and metabolic parameters governing the mutagenicity of polycyclic aromatic hydrocarbons // Chemical Mutagens. Prin. and Methods for Their Detection. —1986. —V. 10. —P. 73—127.
5. Preston R.J., Dean B.J., Gallaway S. Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells // Mutat. Res. —1987. —V. 189. —P. 157—165.
6. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. —Минсн: Вышэйшая школа, 1973. —320 c.
7. Елисеева К.Г., Араж А.Б., Смаль С.Э. Роль генов АH-батареи в биоактивации митомицина С // Докл. АН БССР. -1991. —Т. 35. —С. 1034—1036.
8. Williams G.M., Mori H. Structure-activity relationships in the rat hepatocyte DNA-repair test for 300 chemicals // Mutat. Res. —1989. —V. 221. —P. 263—286.