УДК 615.357.631:577.611.657

Ю.І. Губський, чл.-кор. АМН Україні, д.м.н., Є.Л. Левицький, д.б.н., Г.Г. Горюшко, к.х.н., О.М. Марченко, к.б.н., В.П. Даниленко, к.х.н., Т.М. Курапова, О.М. Величко, Л.П. Бабенко

АНТИОКСИДАНТНА АКТИВНІСТЬ ТА ГЕНОПРОТЕКТОРНА ДІЯ ПОХІДНОГО ПІРИДИНКАРБОНОВОЇ КИСЛОТИ — СПОЛУКИ ПВ-20 ЗА УМОВ УРАЖЕННЯ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ

Інститут фармакології та токсикології АМН України

Хімічне ураження ядерного геному клітин печінки під впливом ксенобіотиків, у тому числі тетрахлорметану (ТХМ), є молекулярною основою для виникнення ланцюга патологічних змін в організмі. Раніше нами було показано, що їх базою є модифікація процесів ліпопереокислення (ПОЛ) у фракціях транскрипційно активного (ТАХ) і репресованого (РХ) хроматину клітин печінки щурів [1—3]. Ефективним засобом захисту та корекції вільнорадикальних уражень генетичного апарату є сполуки-антиоксиданти — геномопротектори, які так або інакше мають вплив на процеси репарації ДНК, що призводить завдяки нормалізації (ПОЛ) до відновлення структури хроматину [4—5]. У ряді робіт було показано, що такими сполуками є представники нестероїдних протизапальних засобів (ПЗЗ), таких як ацетилсаліцилова кислота [6], а також ряд сполук — похідних піридинкарбонових кислот (ПКК) — препарат амізон та його аналоги. Амізон, завдяки антиоксидантним та гепатопротекторним властивостям, був з успіхом застосован у комплексній терапії хронічного токсичного гепатиту [7], а його аналоги — похідні ПКК (сполуки ПВ-3,ПВ-4 і ПВ-6) за умов їх лікувально-профілактичного введення щурам, отруєним гепатотоксином ТХМ, виявили антиоксидантні властивості у процесах спонтанного та індукованого NADFH і аскорбатом ліпопереокислення у фракціях РХ та ТАХ хроматину [8, 9]. Доведено, що дія даних сполук cупроводжується частковою корекцією або нормалізацією фізико-хімічних і структурно-динамічних показників в РХ і ТАХ фракціях, порушених за умов ураження ТХМ.

Найбільш ефективну геномозахисну дію показала сполука ПВ-4 (хлоргидрат метилового ефіру О-ізоникотиноил саліцилової кислоти).

Орто-(N-метілізонікотіноіл) метілсаліцілат йодиду (ПВ-20) є ізоструктурним аналогом сполуки ПВ-4. Метою даного дослідження є вивчення антиоксидантних властивостей даної сполуки, а також її здатності до структурної модифікації уражених ТХМ ізольованих фракцій ядерного хроматину РХ і ТАХ, корекції іх фізіко-хімічних показників, що відображають структурно-функціональну організацію хроматину клітин печінки.

Матеріали та методи дослідження

Експеріменти проводили на щурах-самцях лінії Вістар віком 3 міс та масою 150—200 г. Сполука ПВ-20 була синтезована в Інституті фармакології і токсикології АМН України. ТХМ вводили внутрішньоочеревинно у дозі 1ЛД₅₀ (1,75 мл/кг маси тіла). Сполуку ПВ-20 вводили також внутрішньоочеревинно у вигляді водної суспензії двічі у дозі 1/10 ЛД₅₀ (5,2 мг/кг маси тіла) за 24 год до отруєння та через 1 год після отруєння щурів ТХМ. Контрольну групу складали інтактні тварини. Дослідні тварини були поділені на дві групи: отруєні ТХМ та отруєні ТХМ на фоні лікувально-профілактичного введення сполуки ПВ-20. Фракції РХ і ТАХ із клітин печінки виділяли, як описано в роботі [10]. Стан процесів ліпопереокислення (ПОЛ), структурну організацію хроматину оцінювали на основі методів, наведених у статтях [6, 8, 9], з використанням флуоресцентних зондів пирену, флуорескаміну, інтеркаляторів ДНК етідій броміду, пропідій йодиду та методом гасіння білкової флуоресценції хроматина акриламідом. Інтенсивність процесів ПОЛ у хроматині визначали протягом двох годин методами спонтанного (за концентрацією дієнових коньюгатів — ДК) і індукованого NADFH та аскорбатом (за швидкістю накопичення малонового діальдегіда-МДА і його похідних). Досліджували також структурний стан хроматину за відсотковим вмістом РХ і ТАХ, величиною співвідношення білок/ДНК.

Антирадикальні властивості (АР) сполуки ПВ-20 визначали спектрофотометрично [11] за результатами комплексоутворення її з стабільним радикалом дифенілпікрілгідразілом (ДФПГ) у спиртових розчинах в еквівалентних концентраціях (С=10^-4 М). Величину АР оцінювали як відношення зміни оптичної щільності розчину ДФПГ (Д₅₂₀) у присутності сполуки ПВ-20 за термін 24 год до його оптичної щільності у відсутності сполуки (Д⁰₅₂₀):

АР(%) = (Д⁰₅₂₀ — Д^т₅₂₀ ) / Д⁰₅₂₀ • 100,

де: Д^т₅₂₀ — оптична щільність розчину ДФПГ через 24 год.

Стабільний радикал ДФПГ був синтезован в ІОХ НАН України. Антиокислювальну активність сполуки ПВ-20 визначали відповідно до [12] за методом залізоініційованої біохемілюмінесценції (БХЛ) ліпопротеїнів яєчного жовтка (ЛПЖ) без додавання і у присутності сполуки ПВ-20 у якості інгібітора вільнорадикальних реакцій. Суспензію ЛПЖ отримували у відповідності з [13, 14], дослідження проводили у середовищі фосфатного буфера (105 мМ KCL, 20 мМ KH₂PO₄, pH 7,48) при 37°С. Виміри проводили на біохемілюминометрі БХЛ-06 з ФЕП-79, спектри поглинання та флуоресценції записували на спектрофотометрі Shimadzu MPS-5000 та спектрофлуориметрі Hitachi MPF-4 (Японія). Одержані результати оброблено методами параметричної та непараметричної статистики [15].

Результати та їх обговорення

Для визначення антиокислювальної активності сполуки ПВ-20 було досліджено ії вплив на процеси вільнорадикального окислення в ліпопротеїнах яєчного жовтка (ЛПЖ) методом залізоініційованої біохемілюмінесценції (БХЛ) [12]. В табл. 1 наведені дані інтенсивності повільного спалаху БХЛ суспензії ЛПЖ (І₂) за термін 9 хв (максимум інтенсивності) та величини площі світлосуми (s) за термін 10 хв з моменту введення fe²⁺ в суспензію ЛПЖ у відсутності (контроль) та після додання сполуки ПВ-20 (дослід) до концентрацій 10^-7, 10^-6, 10^-5 і 10^-4 М (І^д₂, s_д). Сполука ПВ-20 за умов in vitro спричиняє вірогідно інгібуючу дію на процеси ПОЛ в суспензії ЛПЖ в концентраціях 10^-7—10^-5 М. Збільшення концентрації до 10^-4 М сприяє розвіткові ПОЛ в суспензії. В табл. 1 наведені співвідношення (І^к₂—І^д₂)/І^к₂•100 (%), які характерізують величину інгібірування вільнорадикальних реакцій порівняно з контролем, антиокислювальну активність сполуки ПВ-20, яка дорівнює 19,7% (середне арифметичнє значень для концентрацій 10^-7—10^-5 М).

На рис. 1 наведена залежність концентрації ДФПГ (зміни оптичної щільності Д₅₂₀ радикальної форми ДФПГ) від терміну інкубації його у присутності сполуки ПВ-20. Можно бачити, що за термін 24 год концентрація радикальної форми ДФПГ зменьшується на 16,44%, що свідчить про антирадикальні властивості сполуки ПВ-20. Розрахунок константи швидкості у наближенні реакції першого порядку показав, що К₁ дорівнює (6,78±0,56)•10^-5, с^-1.

З метою вивчення сполуки ПВ-20 у якості антиоксиданта-геномостабілізатора досліджували швидкість накопичення МДА у фракціях хроматину клітин печінки щурів за умов пошкодження їх ТХМ та при додаванні іn vitro в суспензію сполуки ПВ-20 у концентраціях 10^-7, 10^-6, 10^-5 М (табл. 2). Сполука ПВ-20 виявляє виражений антиоксидантний ефект як в РХ, так і в ТАХ фракції: має місто зниження показників під впливом ПВ-20 як для інтактних, так і для отруєних щурів. У подальших дослідженнях геномопротекторну дію сполуки ПВ-20 вивчали за умов in vivo при лікувально-профілактичному введенні ії отруєним ТХМ щурам.

У табл. 3 наведені результати визначення швидкості накопичення МДА у фракціях РХ і ТАХ з печінки інтактних щурів, а також за умов отруєння ТХМ та лікувально-профілактичного введення сполуки ПВ-20. Видно, що як і за умов in vitro, при введенні тваринам речовина ПВ-20 проявляє антиоксидантні властивості по відношенню до процесів ПОЛ у фракціях хроматину. У фракції РХ ії дія супроводжується нормалізацією підвищених в результаті інтоксикації процесів аскорбат залежного та неініційованого ПОЛ (АЗП та НК, відповідно). У фракції ТАХ отруєних тварин подібну дію ПВ-20 спричиняє по відношенню до процесів nadfh- та аскорбат-залежного ПОЛ.

Антиоксидантна дія сполуки ПВ-20 була встановлена і при визначенні проміжних продуктів ПОЛ- дієнових коньюгатів у фракціях хроматину клітин печінки інтактних та отруєних щурів. Результати цих експериментів наведені у табл. 4. Отруєння тварин ТХМ підвищує рівень концентрації дієнових коньюгатів у фракції РХ(екстрагованих як у гептановий, так і у ізопропанольний шари ліпідного екстракту). Лікувально-профілактичне введення отруєним тваринам сполуки ПВ-20 призводить до значної нормалізації процесів ПОЛ у ядерному хроматині клітин печінки отруєних ТХМ щурів. Введення даної сполуки знижує рівень дієнових коньюгатів у фракції ТАХ отруєних тварин майже вдвічі у порівнянні з контролем.

У табл. 5 наведені результати вивчення структурних властивостей фракцій РХ і ТАХ печінки інтактних, отруєних ТХМ щурів та за умов лікувально-профілактичного введення отруєним тваринам сполуки ПВ-20. Як можно бачити, введення інтактним щурам ТХМ призводить до різкої зміни співвідношення між фракціями РХ і ТАХ у хроматині. При цьому майже вдвічі зростає доля ТАХ та, відповідно, зменшується з 87,7 до 78,6% доля фракції РХ. Лікувально-профілактичнє введення ПВ-20 призводить до нормалізації цього показника у хроматині як найбільш загального, що характеризує структурово-функціональну організацію ядерного хроматину в цілому. Тобто у даному випадку, зважаючи на наведені вище результати наявності у цієї речовини антиоксидантних властивостей, можна стверджувати, що ПВ-20 має геномопротекторну активність по відношенню до клітин печінки за умов отруєння щурів ТХМ.

Цей висновок підтверджується результатами визначення фізіко-хімічних властивостей фракцій хроматину РХ і ТАХ з клітин печінки інтактних, отруєних ТХМ щурів та за умов лікувально-профілактичного введення речовини ПВ-20 (табл. 6).

Зміни у значеннях показників — власної триптофановой флуоресценції F₃₃₀, рівень флуоресценції флуорескаміну F_фк при вбудовуванні його у РХ та ТАХ за умов ураження ТХМ у порівнянні з контролем свідчать про структурні пертурбації у білкових молекулах гістонів та негістонових білків. Зменшення значень даних параметрів під впливом лікувально-профілактичної дії ПВ-20 свідчить про часткову корекцію цих показників, нормалізацію кількості позитивно заряджених e-аміногруп залишків лізіну у гістонах.У той же час показник F₃₃₀ після введення сполуки ПВ-20 не змінюється, що може бути наслідком ії комплексоутворення з білковими флуорофорами негістонових білків та гістонами.Під впливом сполуки ПВ-20 in vivo нормалізується також значення показника гасіння флуоресценції акриламідом константи Штерна-Фольмера-Кsv, здатність гасника до діфузії у білкові молекули, що характеризує ступінь розпушеності структури білків.

Раніше відмічалося [2, 5], що за умов інтоксикації ТХМ порушується конформація ДНК у фракціях РХ і ТАХ зі зміною ії структурово-функціональної організації. Нами були проведені дослідження з використанням флуоресцентних зондів етідію броміду (ЕВ) та пропідію йодиду (РІ), які вбудовуються між ниткам подвійного ланцюга ДНК у фракціях РХ і ТАХ і є структуровими аналогами фенантридинових інтеркаляторів.

Отримані дані свідчать (табл. 6), що зміни інтенсивності флуоресценції F_ЕВ та F_РІ у фракції ТАХ під впливом інтоксикації ТХМ зумовлені зростанням ступеня спіралізації молекул ДНК у хроматині і частково коригуються сполукою ПВ-20. Що стосується фракції РХ, то отримані дані є недостовірними.

Про геномозахисну дію ФАР ПВ-20 свідчать також результати спектрофотометричного дослідження. У фракції РХ має місце часткова корекція параметру D₂₁₀/D₂₆₀, що характеризує стан білків та ліпідів по відношенню до ДНК, яка має максимум поглинання при 260 нм. У той же час у фракції ТАХ цей показник ще більше знижується після введення тваринам сполуки ПВ-20, що може свідчити про ії комплексоутворення з білковими молекулами (гістонами) цієй фракції. Про взаємодію фракцій хроматину зі сполукою ПВ-20 in vitro свідчать ії диференційні спектри (рис. 2)

Зміни оптичної щільності ПВ-20 за умов інкубації у суспензії РХ(а) та ТАХ(б) інтактних тварин (1), після отруєння ТХМ(2) та лікувально-профілактичного введення ПВ-20 (3) свідчать про те, що взаємодія ПВ-20 з фракціями хроматину супроводжується незначним гіпохромним ефектом для РХ та гіперхромним — для ТАХ(кріві 1).Інтоксикація призводить до зростання DD_l, тоді як введення тваринам сполуки ПВ-20 знижує значення цього показника у порівнянні з інтоксикацією ТХМ у бік контрольних значень.

Таким чином, наведені дані свідчать про те, що введення отруєним ТХМ тваринам сполуки ПВ-20 у значній мірі нормалізує значення фізіко-хімічних показників, які відображають структуровий стан фракцій РХ і ТАХ, порушений у результаті отруєння щурів ТХМ, і свідчать про наявність геномозахисної дії у даної сполуки, котра є складової ії гепатопротекторного впливу на клітини печінки.

Гепатопротекторна дія ФАР ПВ-20 знаходить підтвердження у зниженні показника смертності експериментальних тварин (щурів) під впливом ТХМ. Лікувально-профілактичне введення отруєним ТХМ щурам сполуки ПВ-20 має наслідком зменшення цього показника з 49,0% (отруєння ТХМ без ПВ-20) до 14,7% (лікувально-профілактичне введення отруєним ТХМ щурам сполуки ПВ-20), тобто у 3,3 рази.

Література
1. Губський Ю.І. Вільно-радикальні реакції у ядерному хроматині // Вісник АМН України. —1996. —№1. —С. 18—24.
2. Левицкий Е.Л., Губский Ю.И. Свободно-радикальные повреждения ядерного генетического аппарата клетки.// Укр.биохим.журн. —1994. —Т. 66, №4. —С. 18—30.
3. Губський Ю.І. ДНК ядерного хроматину. Вільно-радикальні механізми хімічного пошкодження // Мед. хімія. —1999. —Т. 1. —С. 7—14.
4. Губский Ю.И., Левицкий Е.Л. Фармакокорекция генотоксических повреждений клеток печени природными и синтетическими антиоксидантами // II Нац. з'їзд фармакологів України. Тези доп. —Днепропетровск, 2001. —С. 68.
5. Губський Ю.І., Левицький Е.Л. Перекисно-антиоксидантний механізм регуляції активності хроматину // Журн. АМН України. —1997. —Т. 3, №2. —С. 275—282.
6. Левицький Е.Л., Горюшко Г.Г., Примак Р.Г. та ін. Механізм геномозахисної дії аспірину за умов отруєння щурів тетрахлорметаном // Ліки. —1998. —№3. —С. 53—57.
7. Фролов В.М., Терьошин В.О., Бухтіарова Т.А. та ін. Ефективність нового українського препарату "АМІЗОН" при хронічному токсичному гепатиті та його вплив на показники пероксидації ліпідів і системи антиоксидантного захисту // Ліки. —2000. —№5. —С. 3—6.
8. Губський Ю.І., Левицький Е.Л., Горюшко Г.Г., Марченко О.М. та ін. Взаємодія нових похідних піридинкарбонових кислот з ізольованими фракціями ядерного хроматину клітін печінки інтактних та отруєних тетрахлорметаном щурів//Современные проблемы токсикологии. —2002. —№2. —С. 26—32.
9. Губський Ю.І., Левицький Е.Л., Горюшко Г.Г. та ін. Біохімічні механізми геномозахисної дії нових похідних піридинкарбонових кислот за ураження клітин тетрахлорметаном // Укр. біохім. журн. —2001. —Т. 73, №5. —С. 100—107.
10. Левицкий Е.Л., Губский Ю.И., Чабанный В.Н. и др. Биохимическая характеристика фракций транскрипционно-активного и репрессированного хроматина печени крыс // Биополимеры и клетка. —1993. —Т. 9, №6. —С. 13—21.
11. Починок Т.В.,Тараховский М.Л.,Портнягина В.А. Экспрес-метод определения антиокислительной активности лекарственных веществ // Хим. фарм. журн. —1985. —Т. 19, №5. —С. 565—569.
12. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., Азимбаев Т.К. Оценка антиокислительной активности веществ и биологических объектов с помощью железоинициированной хемилюминесценции // Биофизика. —1992. —Т. 37, №6. —С. 1041—1047.
13. Глушков Р.Г., Гуськова Т.А., Голиков П.П. и др. Изучение антиокислительных свойств арбидола // Хим. фарм. журн. —1996. —Вып. 1. —С. 3—5.
14. Губский Ю.И., Горюшко А.Г., Вистунова И.Е. и др. Антирадикальные и антиокислительные свойства нестероидных противовоспалительных средств — производных пиридинкарбоновых кислот // Укр. биохим. журн. —1999. —Т. 75, №5. —С. 85—89.
15. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов // Л: ЛГУ, 1975. —78 с.