ІМУННА РЕАКТИВНІСТЬ ОРГАНІЗМУ ЩУРІВ ПРИ ХРОНІЧНІЙ ДІЇ ЦИКЛОФОСУ

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, м. Київ

Відомо, що специфічною дією фосфорорганічних пестицидів (ФОП) є інгібування активності фермента холінестерази, і цей показник при їх гігієнічній регламентації в об'єктах навколишнього середовища використовується як лімітуючий. Однак, дослідження впливу ФОП на імунобіологічну реактивність лабораторних тварин показали, що деякі з них (хлорофос, малатіон) як при однократному впливі, так і хронічному, пригнічують неспецифічні фактори захисту організму і функціональну активність імунної системи. Зміни імунної реактивності наступають після специфічних ознак інтоксикації, але зберігаються значно довше, ніж антихолінестеразний ефект [1—3]. Показано, що у працюючих з пестицидами та у населення, яке проживає у районах з інтенсивним використанням в сільському господарстві хімічних речовин, спостерігається порушення здоров'я: збільшення випадків алергічних і інфекційних захворювань, імунодефіцит по Т-типу, більш тяжкий перебіг соматичної патології, збільшується ризик виникнення онкологічних хвороб [4—10].

Негативний вплив ксенобіотиків на здоров'я людей може бути пов'язаний з багатьма причинами. Одна із них, за думкою Саноцького І.В., "сложившаяся процедура токсикометрии не отвечает современным требованиям" [11]. Підтвердженням тому є те, що на сучасному етапі токсиколого-гігієнічна регламентація пестицидів проводиться без урахування імунотоксичної дії, що знижує надійність раніше встановлених нормативів.

В зв'язку з цим актуальним є удосконалення системи оцінки токсичності і небезпечності пестицидів для людини, формалізація процедури вибору показників для встановлення порогових і недіючих рівнів ксенобіотиків, коректировка підходів до регламентації хімічних речовин в об'єктах навколишнього середовища за імунологічними критеріями шкідливої дії.

Метою досліджень було вивчення впливу циклофосу на імунну систему при хронічному надходженні в організм щурів і визначення критеріальної значимості імунологічних показників при обгрунтуванні його порогових рівнів шкідливої дії.

Матеріали та методи дослідження

Експерименти проводили на щурах самцях лінії Вістар, які знаходились на стандартному раціоні віварію і отримували питну воду і корм ad libitum. Циклофос, 40% к.е. — О,S-диметил-О-циклогексилтіофосфат (тіоловий ізомер) і О,О-диметил-О-циклогексилтіофосфат (тіоновий ізомер) у співвідношенні 15:25, у вигляді рівномірної емульсії вводили в шлунок тварин (початкова масса тіла 120—130 г) за допомогою металевого зонду в дозах 6,3 мг/кг (1/100 ЛД₅₀) і 0,63 мг/кг (1/1000 ЛД₅₀) впродовж 6 місяців. В дозі 6,3 мг/кг також досліджували стан організму щурів через 1 міс відновного періоду. Контрольну групу складали інтактні тварини, яким вводили в шлунок воду в об'ємі, рівному такому емульсії циклофосу. В кожну групу входило по 6 тварин. В динаміці досліджували інтегральні, специфічні і імунологічні показники стану організму, вміст ізомерів циклофосу у внутрішніх органах щурів. В якості інтегральних показників використані маса імунокомпетентних органів — тимусу і селезінки. Специфічну дію циклофосу оцінювали за активністю ацетилхолінестерази (АХЕ) еритроцитів [12]. Вміст ізомерів у внутрішніх органах щурів визначали газохроматографічним методом спільно із к.х.н. В.М. Письменною.

Імунну реактивність організму оцінювали за активністю лізоциму в сироватці крові турбідиметричним методом [13], функціональною активністю нейтрофілів в реакції з нітросинім тетразолієм (НБТ-тест) [14], рівнем циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) в сироватці крові [15], титром гетерофільних гемагглютининів (ГГА) в реакції Пауля Буннеля [16], реакцією бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ) на дію мітогена фітогемагглютинина (ФГА) [17]. В кінці експерименту проводили морфологічні дослідження тимусу і селезінки загальноприйнятими методами [18]. Дослідження морфоструктури органів щурів виконані спільно з д.м.н. Л.Н. Бадаєвою.

Для оцінки резервних можливостей імунної системи і встановлення порогових рівнів циклофосу за імунологічними критеріями шкідливої дії паралельно з основним експериментом досліджували спроможність імунної системи щурів відповідати на додатковий антигенний стимул — еритроцити барана. Імунізацію тварин проводили внутрішньоочеревинно (через 2 і 6 міс досліджень) загальноприйнятим способом — по 0,5 мл суспензії еритроцитів барана двохкратно з інтервалом 7 діб. На 14 добу, в період активного антитілогенезу, визначали рівень ГГА і ЦІК у сироватці крові, функціональну активність нейтрофілів за НБТ-тестом.

Отримані результати статистично оброблені з використанням t-критерію Ст'юдента [19].

Результати та їх обговорення

Активність ацетилхолінестерази еритроцитів і імунна реактивність організму щурів при хронічній дії циклофосу в дозі 6,3 мг/кг наведені в табл. 1, з якої видно, що циклофос в дозі 6,3 мг/кг чинить виражену антихолінестеразну дію. Інгібування активності АХЕ еритроцитів через 1 міс досліджень становило 79,5%. В подальші терміни досліджень виявлений помірний антихолінестеразний ефект (зниження активності ферменту становило 38,5—48,9% від контролю), у відновний період — 10,2%.

Під впливом циклофосу через 4 міс досліджень вірогідно збільшувались коефіцієнти маси тимусу на 30,2%, селезінки на 29,7%, через 6 міс спостерігалось зниження коефіцієнту маси тимусу на 10,5%, що свідчить про імунотоксичну дію циклофосу. У відновний період у щурів коефіцієнти маси імунокомпетентних органів статистично не відрізнялись від контролю.

Через 1, 2 і 4 міс досліджень циклофос знижував активність лізоциму в сироватці крові на 46,9, 28,2 і 21,0% і кількість диформазан-позитивних нейтрофілів (ДПН) через 1, 2 і 6 міс на 23,3, 24,4 і 23,1%, відповідно. В період вираженої антихолінестеразної дії (1 міс) спостерігалось зменшення рівня ЦІК (на 30,3%). Вірогідних змін титрів ГГА у сироватці крові щурів не виявлено, однак через 1 і 6 міс досліджень ступінь їх зниження становив 50,3 і 54,6%, відповідно, що свідчить про пригнічення функціональної активності В-лімфоцитів. Зниження функціональної активності Т-лімфоцітів через 4 і 6 міс (за РБТЛ на дію ФГА) становило 25,5 і 33,1%, відповідно. Дослідження морфоструктурних змін в тимусі і селезінці через 6 міс показали, що циклофос в дозі 6,3 мг/кг чинить токсичну дію на імунокомпетентні органи щурів. На фоні судинних порушень спостерігались дистрофічні зміни і інфільтрація тканин лімфогістіоцитарними елементами. В тимусі виявлені мікронекрози в мозковому шарі, селезінці — гіпертрофію периферичної частини фолікулів.

У відновний період спостерігалось вірогідне зниження активності лізоциму сироватки крові (на 26,1%), кількості ДПН (на 24,6%) і бласттрансформованих лімфоцитів (на 20,1%), що свідчить про гальмування функції імунокомпетентних клітин. Слід зазначити, що зміни показників неспецифічної резистентності організму передували порушенню функціональної активності Т-лімфоцитів. Зміни імунної реактивності зберігались довше, ніж антихолінестеразний ефект.

Отримані результати досліджень свідчать про те, що циклофос в дозі 6,3 мг/кг чинить виражений антихолінестеразний ефект і імунотоксичну дію, яка поглиблювалась з плином часу.

Дослідження розподілення циклофосу у тканинах організму щурів показало (рисунок), що тіоловий ізомер циклофосу накопичується в більшому ступені, ніж тионовий ізомер. Пік накопичення тіолового ізомера циклофосу в тимусі (0,194 мкг/г), жиру сальника (0,079 мкг/г), селезінці (0,038 мкг/г) приходився на 4 міс досліджень, нирках (0,389 мкг/г), головному мозку (0,0263 мкг/г) і крові (0,0114 мкг/г) — на 6 міс досліджень. У відновний період вміст тіолового ізомера зростав у крові (0,0337 мкг/г), селезінці (0,132 мкг/г) і залишався в значних кількостях в тимусі (0,069 мкг/г), жиру (0,0189 мкг/г), головному мозку (0,0126 мкг/г), в меншій мірі у нирках (0,0069 мкг/г).

Найбільше накопичення тіонового ізомера циклофосу спостерігалось через 4 міс в тимусі (0,185 мкг/г), крові (0,023 мкг/г), селезінці (0,0084 мкг/г), через 6 міс — в нирках (0,222 мкг/г), жиру сальника ((0,04 мкг/г) і мозку (0,013 мкг/г). У відновний період тіоновий ізомер в головному мозку і селезінці не виявлений, в крові він знаходився в незначних кількостях (0,0006 мкг/г), тимусі — 0,024 мкг/г, жиру сальника — 0,0059 мкг/г, нирках — 0,0032 мкг/г.

Коефіцієнт розподілу жир/кров для циклофосу (по сумі ізомерів) через 1, 2, 4, 6 міс, відповідно, становив 0,01; 1,0; 3,8; 5,8; через 1 міс відновного періоду — 0,72.

Як видно з наведених даних, впродовж 1 міс досліджень циклофос не накопичується в організмі, а інтенсивно метаболізується і взаємодіє з холінестеразою. В цей період часу інгібування активності АХЕ еритроцитів щурів було найбільшим (79,5%). В подальші строки досліджень накопичення ізомерів циклофосу в жиру та ліпоїдних органах зменшувало їх рівень в крові, що сприяло менш вираженому інгібуванню АХЕ (на 38,5—39,1%). Інтенсивне виведення циклофосу із організму щурів спостерігається через 6 місяців досліджень. Однак, в цей же період часу зростає вміст тіолоіого ізомера в крові і головному мозку, що сприяло більш вираженому інгібуванню активності АХЕ і пролонгуванню токсичного ефекту. Оскільки спостерігалось значне накопичення ізомерів в тимусі і селезінці, то не виключено, що імунотоксична дія циклофосу може бути обумовлена його прямою дією на імунокомпетентні клітини.

Результати досліджень впливу циклофосу на активність АХЕ еритроцитів і імунну реактивність організму щурів в дозі 0,63 мг/кг наведені в табл. 2. Встановлено, що через 2 і 6 міс досліджень циклофос незначно інгібував активність АХЕ еритроцитів (на 13,5 і 7,6%, відповідно). Змін коефіцієнтів маси імунокомпетентних клітин не виявлено. Встановлено вірогідне збільшення кількості ДПН через 1 і 6 міс на 39,3 і 79,2%, відповідно. Змін активності лізоциму, рівня ГГА і ЦІК у сироватці крові, а також кількості бластних форм лімфоцитів не спостерігалось. Морфоструктурних змін тимусу і селезінки не виявлено. Отримані дані свідчать про те, що в меншій дозі циклофос не чинить імунодепресивної дії.

Результати досліджень імунної відповіді організму щурів на додатковий антигенний стимул (еритроцити барана) надані в табл. 3. Після імунізації тварин, які отримували перорально циклофос в дозі 6,3 мг/кг, через 2 міс виявлено вірогідне зниження титру ГГА, рівню ЦІК у сироватці крові та функціональної активності нейтрофілів. Пригнічення імунної відповіді на еритроцитарний антиген поглиблювалось з часом. Так, через 2 міс титр ГГА становив 1:59 (в контролі 1:107), через 6 міс — 1:36 (в контролі 1:117), що в 1,8 і 3,3 рази менше, ніж в контролі. Виходячи з умовних одиниць зменшення рівня ГГА становило 11% і 24%, відповідно. Ступінь зниження рівню ЦІК в обидва строки досліджень становив 45—44%, кількості ДПН — 32,6—37,3%.

Після імунізації щурів, які отримували циклофос в дозі 0,63 мг/кг, спостерігалась тенденція до зниження титрів ГГА у сироватці крові через 2 міс (1:91 проти контролю 1:128) і 6 місяців досліджень (1:96 проти контролю 1:128). Крім того, через 6 міс виявлено вірогідне збільшення числа ДПН на 58,3%, що на 21% було меншим, ніж у тварин, які не піддавались імунізації.

Отримані результати досліджень свідчать, що при імунізації тварин як в дозі 6,3 мг/кг, так і в дозі 0,63 мг/кг імунна відповідь на додатковий антигенний стимул організму знижується і залежить від дози циклофосу.

При обгрунтуванні порогового рівню впливу циклофосу на організм щурів виходили із сукупності всіх даних, отриманих в експериментах. За специфічною антихолінестеразною дією і впливом на імунну систему доза циклофоса 6,3 мг/кг є токсичною, доза 0,63 мг/кг — за антихолінестеразною дією є підпороговою, оскільки зниження активності АХЕ в еритроцитах становило не більше 25%. Оскільки при імунізації тварин, які отримували циклофос в дозі 0,63 мг/кг, спостерігається тенденція до зниження титрів ГГА на 29%, а також зниження функціональної активності нейтрофілів (на 21%) в порівнянні з групою тварин, які не піддавались імунізації, то виявлені зміни показників свідчать про те, що в указаній дозі не відбувається повної адаптації імунної системи до дії ксенобіотика, тому не можна однозначно стверджувати, що при подальшому надходженні його в організм не виникне порушення функціональної активності імунокомпетентних клітин. В зв'язку з цим, дозу циклофосу 0,63 мг/кг за імунологічними критеріями шкідливої дії можна визнати пороговою.

Таким чином, проведені дослідження свідчать, що при хронічному надходженні в організм циклофос є вираженим інгібітором холінестерази і чинить імунотоксичну дію. Оскільки циклофос накопичується в імунокомпетентних органах, то імунотоксична дія може бути пов'язана з прямим впливом його на імунокомпетентні клітини. Порушення функціональної активності імунної системи спостерігається довше, ніж антихолінестеразний ефект і є критереріально значимими при оцінці порогових рівнів шкідливої дії циклофосу.

Література
1. Repetto R., Baliga S.S. Pesticides and the immune system: The Public Health Risks. —World Resources Institute, 1996. —P. 8-58.
2. Олефир А.И. Действие хлорофоса на иммунобиологическую реактивность животных в эксперименте // Гигиена и санитария. —1971. —№3. —С. 104—105.
3. Thomas I.K., Imamura T. Modulation of cellular and humoral immune responses by O,O,S-trimethyl phosphorodithioate, an impurity of commercial malathion // Toxicol. —1986. —V. 39. —№1. —P. 1—12.
4. Саидов М.З. Орадовская И.В., Мартынов А.И. и др. Клинико-иммунологическая оценка состояния иммунной системы у рабочих химического производства // Иммунология. —1990. —№5. —С. 38—41.
5. Каценович Л.А., Рузыбакиева Р.М., Федорина Л.А. и др. Нарушение иммунологического статуса у больных с интоксикацией пестицидами и его фармакологическая коррекция // Проблемы гигиены и токсикологии пестицидов: Тез. докл. V1 Всесоюзной научн. конф., Киев, 17—19 ноября 1981. —Ч. II. —К.: ВНИИГИНТОКС, 1981. —С. 229.
6. Мамонов А.В. Решетова Н.В. Новые стороны патогенеза иммунодефицитного состояния как фактор риска развития острых пневмоний при отравления ФОИ // 2 Всес. конф. по болезням органов дыхания, Челябинск, 16—19 сентября 1991 г. —Челябинск, 1991. —С. 169.
7. Талаева Ю.Г., Чугунихина Н.В., Хасанова М.И. и др. Влияние интенсивности применения агрохимикатов на заболеваемость населения кишечными инфекциями // Актуальные вопросы токсикологии, гигиены применения пестицидов и полимерных материалов в народном хозяйстве: Тезисы докл. Всесоюзн. научн. конф. (Киев, 30—31 октября 1990 г.) / Под ред. Н.Ф. Мотузинского. —К.: ВНИИГИНТОКС, 1990. —С. 178.
8. Miller K. Review. Immunotoxicology // Clin. Exp. Immunol. —1985. —V. 61, №2. —P. 219—223.
9. Пономарева Л.А. Онкологическая заболеваемость сельского населения в условиях широкого использования агрохимикатов // Актуальные вопросы токсикологии, гигиены применения пестицидов и полимерных материалов в народном хозяйстве: Тезисы докл. Всесоюзн. научн. конф. (Киев, 30—31 октября 1990 г.) / Под ред. Н.Ф. Мотузинского. —К.: ВНИИГИНТОКС, 1990. —С. 179.
10. Allen R.H., Gottlieb M., Clute E., et al. Breast cancer and pesticides in Hawaii: the need for further study // Environ. Health Perspect. —1997. —Apr, 105 Suppl. 3. —Р. 679—683.
11. Саноцкий И.В. Проблемы неизбежного риска в классической и альтернативной токсикометрии // 1-ый съезд токсикологов России (Москва, 17—20 ноября 1998 г.): Тезисы докладов —М.: Нефтяник, 1998. —С. 103.
12. Hestrin S. The reaction of acethylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine and its biological application // J. Biol. Chem. —1949. —V. 180. —P. 249—261.
13. Карпенко В.С., Колесников Г.Ф., Петрунь Н.М. и др. Турбидиметрический метод определения активности лизоцима в сыворотке крови и моче Смолялиса и Гартсела (1949) в модификации Харрисона и соавт. (1968) // Функциональная диагностика в урологии и нефрологии. —К.: Здоровье, 1977. —С. 83—85.
14. Бажора Ю.И., Тимошевский В.Н., Протченко П.З. и др. Упрощенный метод NBT-теста // Лабораторное дело. —1981. —№4. —С. 198—199.
15. Гриневич Ю.А., Алферов А.Н. Определение иммунных комплексов // Лабораторное дело. —1981. —№8. —С. 493—496.
16. Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С. Иммунологические исследования в клинике. —К.: Здоров'я, 1978. —С. 20—21.
17. Биохимические, иммунологические и биофизические методы в токсикологическом эксперименте (методическое руководство) / Под ред. У.А. Кузьминской. —К.: МЗ СССР, ВНИИГИНТОКС, 1989. —С. 73—78.
18. Пирс Е. Гистохимия теоретическая и прикладная. Пер. с англ. —М., 1962. —962 с.
19. Шевченко А.М., Богорад В.С., Яворовский А.П. Программированная обработка результатов токсиколого-гигиенических экспериментов на микро-ЭВМ типа "Электроника Б3-34" / Методические рекомендации. —Киев: Изд. Киевского мединститута, 1987. —22 с.

| Зміст |