БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ (ЭНДОТОКСИНОВ) RALSTONIA SOLANACEARUM

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев

Биополимеры клеточной поверхности являются первым барьером, защищающим бактерии от антимикробных веществ и стрессов, вызванных изменениями в окружающей среде. Многие из этих молекул при взаимодействии бактерий с клетками животных или растений являются детерминантами вирулентности, патогенности, токсичности, антигенности и др. Для выяснения молекулярных основ взаимодействия бактерий с клетками хозяина необходимо знать молекулярную структуру клеточной поверхности бактерий, что даст возможность выяснить, как бактерии модифицируют эту структуру в ответ на изменения в окружающей среде.

Такими молекулами поверхности, которые подвергаются структурным изменениям, являются липополисахариды (ЛПС) — основные компоненты внешней мембраны грамотрицательных бактерий.

Несмотря на то, что ЛПС (эндотоксины) были описаны более 100 лет назад [1], интерес к их изучению с годами не ослабевает. Являясь интегральной частью внешней мембраны грамотрицательных бактерий, они проявляют широкий спектр биологической активности, сочетающей в себе как вредные, так и полезные свойства. Так, они являются основными антигенами бактериальной клетки; играют важную роль в определении специфичности каналов, ответственных за транспорт необходимых для роста клетки веществ; защищают ее от летального действия детергентов, ядов, некоторых антибиотиков; являются рецепторами для ряда специфических бактериофагов и бактериоцинов, эффективными иммуностимуляторами; играют ключевую роль в процессах межклеточного узнавания. ЛПС являются носителями биологической информации, которая закодирована в структурах сложных углеводов и расшифровывается при взаимодействии с комплементарными участками на углеводсвязывающих белках (лектинах) [2—5].

С другой стороны, ЛПС играют ведущую роль в патогенезе многих инфекционных заболеваний. Они являются наиболее мощными индукторами локальной и генерализованной реакции, включая сепсис, от которого в мире погибает от 30 до 80% больных [6]. ЛПС являются также одним из факторов вирулентности в системе растение-патоген.

Это далеко не полный перечень биологических реакций, в которых принимают участие ЛПС. Такие уникальные биологические свойства определяются своеобразной химической структурой молекулы ЛПС, в частности таких компонентов как О-специфический полисахарид (О-ПС), олигосахарид кора и липид А. Так, тонкие вариации в структуре О-специфических полисахаридных цепей определяют серологическую специфичность грамотрицательных бактерий и могут использоваться как молекулярная основа при создании внутривидовых классификационных схем микроорганизмов. Липид А является эндотоксическим центром молекулы ЛПС и отвечает за большинство реакций, протекающих во время воспалительного процесса, вызванного грамотрицательными микроорганизмами, таких как летальность, пирогенность, адьювантность, митогенная стимуляция и др. [7].

Целью нашей работы было изучить зависимость биологической активности ЛПС от их структурных особенностей.

Материалы и методы исследования

Исследования проводили на 8 штаммах Ralstonia solanacearum: ICMP 767, 4157, 5712, 7944, 7945, 7955, 8089 и 8110. Все культуры были любезно предоставлены куратором Международной коллекции фитопатогенных бактерий (ICMP) доктором J. Young (Новая Зеландия).

Культивирование бактерий проводили на жидкой синтетической среде N [8], содержащей как источник углерода — глюкозу, а азота — хлористый аммоний, при 28°С на качалках (240 об./мин) в течение 48—72 часов в зависимости от штамма.

Выделение и очистку липополисахаридов проводили по методу [9]. ЛПС экстрагировали из высушенных ацетоном и эфиром клеток 45%-ным водным фенолом при 65—68°С. Водный слой диализировали против водопроводной, затем — дистиллированной воды, очищали от нуклеиновых кислот путем осаждения ТХУ или трехкратного центрифугирования при 144.000g х 40 мин, после чего лиофилизировали.

Антисыворотки к прогретой в течение 2,5 ч при 100°С культуре R. solanacearum ICMP 767, 4157, 5712, 7944, 7945, 7955, 8089 и 8110, получали в результате трех внутримышечных инъекций кроликов возрастающими дозами суспензии микробных тел с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) (8&149;10⁹ кл./мл, от 0,5 до 0,7 мл) и одной внутривенной иммунизации (1&149;10⁶ кл./мл) с интервалами между инъекциями 3—7 суток. Забор крови у животных проводили на седьмой день после последней иммунизации.

Двойную иммунодиффузию в агаре проводили согласно [10], используя 1,2% агар Дифко в 0,9% NaCl.

Иммуноэлектрофорез [11] осуществляли в 1% агарозном геле в 0,05 М веронал-мединаловом буфере, рН 8,6 при напряжении 80—95 V на пластину (12 мА), после чего немедленно вносили в соответствующие бороздки нативную антисыворотку и инкубировали в течение ночи до появления преципитационных линий.

Ракетный электрофорез [12] проводили в 1% агарозном геле в трис-глициновом буфере, рН 8,3. Гель содержал 2,5—3,5%, в зависимости от штамма, соответствующей сыворотки. Электрофорез проводили при 80—100 V (10—18 мА) на протяжении 2 ч.

При постановке ELISA [13] и ELISA-ингибирования [14] использовали полистирольные планшеты Linbro/Titertek (США). Исследования проводили как в гомологичных, так и в гетерологичных системах.

Раствор антигена (10 мкг/мл) в забуференном физиологическом растворе (PBS) вносили в лунки планшетов для иммуноферментного анализа. Сорбцию антигена проводили в течение ночи при 4°С, после чего трижды промывали PBS. Исследуемую антисыворотку разводили в PBS с 0,05% твином-20 (TBS), вносили в лунки и инкубировали 2 ч при 37°С, трижды промывали PBS. Для выявления связанных антител в лунку вносили по 100 мкл коньюгата антител к кроличьим IgG с пероксидазой из хрена, и инкубировали 2 ч при 37°С. В качестве субстрата пероксидазы использовали 0,013% Н₂О₂ с 0,45% раствором ортофенилендиамина в 0,05 М натрий-калий-фосфатном буфере, рН 6,0. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 8 М Н₂SO₄. Планшеты фотометрировали при длине волны 490 нм в двухволновом режиме.

ELISA-ингибирование проводили идентично ELISA. Однако в лунки после икубирования антигена вносили 100 мкл смеси, содержащей 50% раствора ЛПС в PBS в серийном разведении ЛПС (1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл, 16 мкг/мл) и 50% антисыворотки в разведении 1:800 в 0,1% растворе казеина в 0,05 М TBS, рН 8,0, и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Ингибирующий эффект определяли, используя формулу:

где ОП₄₉₀ — оптическая плотность раствора при длине волны 490 нм.

Ингибирующую дозу (ИД₅₀), при которой наблюдается 50% ингибирования, определяли по экспоненциальной кривой, построенной на основании полученных результатов. Электрофорез в полиакриламидном геле в системе додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) проводили соответственно [15] с использованием 5% концентрирующего и 12% разделяющего акриламидных гелей при постоянной силе тока 30 мА. Гели окрашивали азотнокислым серебром по Tsai [16].

Иммуноблоттинг проводили по методу [17] с переносом ЛПС из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher-Schuell, размер пор 0,45 мкм) в режиме 150 мА на протяжении 4 ч. В качестве субстрата и хромогена выступали Н₂О₂ и 3,3'-диаминобензидин, соответственно.

Токсическое действие ЛПС изучали на здоровых белых мышах весом 19—21 г, предварительно сенсибилизированных 3,2% D-галактозамингидрохлоридом в непирогенном стерильном растворе 0,9% NaCl, после чего немедленно вводили внутривенно подогретый до 37°С раствор ЛПС со скоростью 0,1 мл/с. В серии разведений ЛПС (50—300 мкг/мл) определяли дозу препарата, вызывающую гибель 50% животных (ЛД₅₀), которую использовали для оценки токсичности. Каждую серию разведений ЛПС исследовали на 10 мышах. Контрольной группе животных (10 мышей) вводили вместе с -галактозамингидрохлоридом стерильный раствор 0,9% NaCl. Наблюдение за животными проводили на протяжении 48 ч [18].

Пирогенное действие ЛПС изучали на кролях весом 2—3,5 кг путем внутривенного введения минимальной пирогенной дозы (МПД), установленной в серии разведений ЛПС (0,01—0,005 мкг ЛПС/мл непирогенного 0,9% NaCl), с последующей термометрией животных на протяжении 3 ч [19]. ЛПС считали непирогенным, если сумма повышения температуры у 3-х кролей была меньше или равнялась 1,4°С; если эта сумма превышала 2,2°С — ЛПС считали пирогенным [20].

Модифицированные ЛПС получали путем О-деацилирования (гидролиз в 0,2 N NaOH в 99% этаноле, 18 ч, 50°С), NO-деацилирования (гидролиз в безводном гидразине, 40 ч, 100°С) [21] и дефосфорилирования (гидролиз в 40% растворе HF, 24 ч, комнатная температура) [22].

Результаты и их обсуждение

В результате изучения структуры О-ПС 25 штаммов R. solanacearum, представителей разных биоваров, выделенных из различных географических зон и различных растений-хозяев, было установлено, что по моносахаридному составу [23] они могут быть отнесены к четырем хемотипам, причем 6 штаммов являются представителями І и ІІ-го хемотипа, а ІІІ-й и IV-й — представлены только по одному штамму.

Методами структурного анализа (метилирование, ¹³С- и ¹Н-ЯМР-спектроскопия, распад по Смиту) ранее [24] было установлено 8 различных типов структуры О-ПС R. solanacearum (табл. 1). Структурные отличия их заключаются в следующем: 1) О-ПС большинства исследованных штаммов характеризуются линейными тетрасахаридными повторяющимися звеньями, включающими три остатка l-рамнозы и один остаток glcnac (структуры 1 и 2). При этом имеются очень тонкие различия в структурах, которые обусловлены либо конфигурацией [(a- или b-) (структуры 1 и 2)] glcnac или типом связи [(1—>2) (структура 1) или (1—>3) (структура 4)] с соседним остатком рамнозы; 2) О-ПС ряда штаммов характеризуются разветвленными пентасахаридными повторяющимися звеньями, которые представляют ксилозированную форму структуры 1 или структуры 2 (структуры 5 и 3, соответственно) или рамнозилированную форму структуры 1 (структура 6); 3) структуры О-ПС двух штаммов r. solanacearum принципиально отличались от остальных исследованных штаммов и были представлены трисахаридными повторяющимися звеньями: линейными (штамм 8089, структура 7), построенными из двух остатков d-рамнозы (d-rha) (в то время как у остальных присутствует l-рамноза), а также одного остатка gаlnac, либо разветвленными (штамм 4157, структура 8), включающими остатки glcnАс и gаlnАс, а также d-арабинозы (d-ara) в виде латерального заместителя; 4) установлен ранее крайне редко обнаруживаемый факт присутствия в одном и том же штамме бактерий более, чем одного типа структурно отличающихся олигосахаридных звеньев.

Сегодня еще не известна биологическая роль такого разнообразия. Однако наличие модифицированных молекул с О-антигенной активностью, которая является важной для взаимодействия бактериальной клетки с окружающей средой, вероятно, дает ей преимущества в условиях постоянно изменяющейся внешней среды.

Поскольку О-ПС определяет О-антигенную специфичность бактерий, химическое разнообразие его структур является основой при составлении внутривидовых классификационных схем микроорганизмов, необходимых как в иммунодиагностике, так и в систематике. Первая такая схема, созданная Кауфманом и Уайтом в 1956 г. [25], показала, что серологическая специфичность представителей рода Salmonella обусловлена присутствием заместителей при маннозе или галактозе в трисахаридном повторяющемся звене. В последующие годы исследователи для ряда видов грамотрицательных бактерий (Escherihia coli, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Pseudomonas syringae и др.) установили корреляцию между структурой О-ПС и принадлежностью штамма к определенной серогруппе. Что касается R. solanacearum, до настоящего времени не разработана внутривидовая серологическая схема, основанная на О-антигенности ЛПС. Такие исследования по серотипированию были проведены нами с использованием таких серологических методов, как двойная иммунодиффузия в агаре по Оухтерлони, иммуноэлектрофорез и ракетный иммуноэлектрофорез, ELISA и ELISA-ингибирование как в гомологичных, так и в гетерологичных системах. Полученные данные представлены в табл. 2, 3. Штаммы r. solanacearum являются представителями пяти серогрупп. Первая включает как типовой 5712, так и три других штамма (8110, 7945 и 7955), ЛПС которых взаимодействовали как с гомологичными, так и с гетерологичными О-антисыворотками. Перекрестные взаимодействия свидетельствуют о наличии общих антигенных детерминант и, как предполагают исследователи [26], обнаружившие перекрестные реакции у klebsiella pneumoniae 22535 и shigella flexneri серотип 6, а также plesiomonas shigelloides и k. flexneri серотип 6, эти взаимодействия могут быть обусловлены общими структурными дисахаридными элементами:

a–L–Rha–(1>2)–a–L–Rha и
b–D–GlcNac–(1>3)–b–L–Rha.

Во вторую, третью, четвертую и пятую серогруппы вошли штаммы, характеризующиеся только одним типом структур, а именно штаммы 767, 7944, 8089 и 4157 (структуры 2, 6, 7 и 8, соответственно).

Таким образом, для представителей первой серогруппы нами не установлено прямой корреляции между структурой О-специфического полисахарида и серотипированием.

Поскольку антигенными и иммуногенными свойствами обладают олигосахарид кора и липид А, хотя, конечно, в значительно меньшей степени, чем О-специфические полисахаридные цепи, которые выставлены наружу клеточной поверхности и, в первую очередь, антитела образуются именно к ним, перекрестные серологические реакции между штаммами могут осуществляться не только за счет О-цепи, но и олигосахарида кора и липида А. В пользу этого предположения свидетельствуют данные электрофореза в полиакриламидном геле в системе додецилсульфата натрия и иммуноблоттинга, показавшие взаимодействие в S-, SR-, а для представителей первой серогруппы и в R-зонах.

Если О-ПС являются наиболее вариабельной частью молекулы ЛПС, которая стремится "обмануть" иммунную систему хозяина, изменяя в процессе эволюции состав и структуру и, тем самым, защищает бактерии от неблагоприятных условий окружающей среды, то липид А считается наиболее консервативной частью молекулы ЛПС, ответственной за его эндотоксические свойства. Липид А представляет собой бифосфорилированной 1,6-связанный дисахарид глюкозамина, несущий жирные кислоты. Своеобразие жирнокислотного состава липида А, как наиболее консервативной части молекулы ЛПС, используется в качестве дополнительного таксономического критерия при дифференциации отдельных видов микроорганизмов с неопределенным систематическим положением, причем диагностическую значимость имеют 2- и 3-оксикислоты. К таким микроорганизмам относится и R. solanacearum. Об этом свидетельствует тот факт, что за последние десять лет этот вид дважды переклассифицировали. Долгое время представителей R. solanacearum относили к роду Pseudomonas [27], однако в 1992 г. японские исследователи предложили перенести его в род Burkholderia [28], а позднее (в 1995) — в новый род Ralstonia [29]. Но, вместе с тем, было отмечено, что гетерогенность штаммов R. solanacearum требует дальнейших исследований для определения таксономического положения представителей этого вида.

Изучение жирнокислотного состава исследованных штаммов R. solanacearum показалo (табл. 4), что они являются гетерогенными также по этому показателю. Так, 3-окситетрадекановая, 2-оксигексадекановая и 2-оксиоктадеценовая кислоты, описанные в литературе для представителей r. solanacearum, присутствуют не во всех исследованных штаммах. Более того, вторая группа штаммов содержала в составе липида А короткоцепочечные жирные оксикислоты — 3-оксидекановая, 2- и 3-оксидодекановая, которые характерны для липидов А представителей фитопатогенного вида p. syringae и сапрофитного p. fluorescens.

Интерес к изучению биологических свойств R. solanacearum обусловлен сообщениями в научных изданиях последних лет о том, что ряд микроорганизмов, которые раньше считались патогенными только для растений, также оказывают влияние на человека, поскольку, попадая в него с продуктами питания, могут вызывать нарушения иммунореактивности организма. R. solanacearum относится именно к таким микроорганизмам, так как поражает ряд экономически важных сельскохозяйственных культур, в том числе томаты, картофель, сладкий перец, бананы и др., то есть те, которые входят в ежедневный рацион человека. Ранее [30—32] было установлено митогенное, интерфероногенное, противоопухолевое, антилейкозное действие ЛПС R. solanacearum. Однако наряду с высокой иммунотропной активностью ЛПС грамотрицательных бактерий прoявляют токсичность и пирогенность, что затрудняет их внедрение в медицинскую практику.

Для оценки токсичности ЛПС исследованных штаммов R. solanacearum (767, 4157, 5712, 7944, 7945, 7955, 8089 и 8110) определяли дозу препарата ЛПС, которая при внутривенном введении галактозамингидрохлорид-сенсибилизированным мышам вызывала гибель 50% экспериментальных животных (ЛД₅₀).

Исследованные препараты ЛПС проявляли различный уровень токсичности, что отображено в показателях ЛД₅₀ (табл. 5). При анализе полученных результатов штаммы можно разделить на две группы: более токсичными оказались ЛПС штаммов 7955, 7945, 8110 и 5712 (ЛД₅₀ которых составила от 8 до 12 мкг/мышь), менее токсичны ЛПС штаммов 7944, 767, 4157 и 8089, ЛД₅₀ которых приблизительно втрое больше (от 30 до 40 мкг/мышь). Следует отметить, что полученные результаты указывают на относительную нетоксичность ЛПС r. solanacearum при сравнении с ЛПС других фитопатогенов. Так, согласно данным литературы [33], подобную токсическую активность проявляли только некоторые штаммы pseudomonas fluorescens, в то время как ЛПС pseudomonas wieringae в 30 раз, а ЛПС pseudomonas syringae — в 500 раз токсичнее ЛПС исследованных штаммов r. solanacearum.

Оценку пирогенного действия ЛПС проводили согласно биологическому методу качественного контроля относительно присутствия бактериальных эндотоксинов в медицинских препаратах. Для проведения сравнительной оценки пирогенных характеристик исследуемых ЛПС при внутривенном введении кролям в серии разведений была установлена минимальная пирогенная доза, которая составила 7,5&149;10^-3 мкг ЛПС/мл непирогенного изотонического раствора.

Результаты термометрии (табл. 5) показали, что повышение температуры у экспериментальных животных более чем на 0,45°C (что выходит за пределы физиологической нормы здоровых животных), вызывали растворы ЛПС штаммов R. solanacearum 5712, 7945, 7955 и 8110. На протяжении первого часа их введение приводило к резкому повышению температуры у животных. На второй час наблюдалось некоторое понижение температуры с тенденцией к нормализации, а через 3 ч значения температуры возвращались к исходным показателям.

По проявлению пирогенного влияния при внутривенном введении МПД эти штаммы были подобны "Пирогеналу" — фармацевтическому препарату, действующим компонентом которого является ЛПС Shigella typhi [34].

При внутривенном введении животным минимальной пирогенной дозы растворов ЛПС штаммов R. solanacearum 767, 7944, 4157 и 8089 — повышение температуры не наблюдалось, что может свидетельствовать об отсутствии пирогенного действия ЛПС в исследованной концентрации.

Известно, что за проявление эндотоксических свойств ответственна липид А часть молекулы ЛПС, которая представлена жирными кислотами, глюкозамином и остатками фосфорной кислоты.

По современным представлениям проявление биологических свойств ЛПС коррелирует с количеством остатков и длиной жирных оксикислот, их симметричностью или асимметричностью в 1-ом и 2-ом глюкозамине, присутствием насыщенных и ненасыщенных жирных кислот.

Полученные данные при изучении пирогенного и токсического эффекта исследуемых ЛПС и состава их жирных оксикислот указывают на то, что проявление ЛПС биологических свойств коррелирует с длиной жирных оксикислот липида А: более токсичными и пирогенными оказались ЛПС штаммов R. solanacearum, содержащие более длинные углеродные цепи. Изучение жирнокислотного состава пока еще не дает возможности определить наличие каких жирных кислот является необходимым для проявления токсических и пирогенных свойств, однако можно предположить, что 2—ОН—С_16:0 и 2—ОН—С_18:0 могут играть в этих процессах определенную роль. В подтверждение этого предположения свидетельствуют данные относительно зависимости проявления биологической активности ЛПС от длины цепей жирных кислот его липида А. Так, ЛПС Rhodocyclus gelatinosus, у которого оба остатка глюкозамина несут более короткие по сравнению с ЛПС E. сoli жирные кислоты, проявляют меньшую степень пирогенности и токсичности [35].

Одним из наиболее актуальных вопросов современной гликобиологии является выяснение ответственности химических группировок в составе ЛПС за проявление того или иного вида биологической активности, что может быть полезным при создании новых лекарственных препаратов и получении химически модифицированных ЛПС, которые бы сохраняли высокую иммунотропную активность, но не проявляли токсичность и пирогенность.

Для решения этой задачи нами были получены модифицированные препараты ЛПС типового штамма 5712 R. solanacearum путем О-деацилирования, NО-деацилирования и дефосфорилирования.

Установлено, что при химической модификации ЛПС утрачивали как пирогенную, так и токсическую активности (табл. 6). Это может свидетельствовать о том, что за проявление таких свойств ответственны как ацильные, так и фосфатные группы. Подтверждают это предположение и данные [36] о том, что ЛПС и дифосфорил липида А salmonella typhimurium g30/c21 в 100 раз более токсичны и в 40 раз более пирогенны, чем монофосфорил salmonella minnesota r595.

Литература
1. Westphal O., Luderitz O., Rietschel E., Galanos C. Bacterial lipopolysaccharide and its lipid A component: some historical and some chemical aspects // Biochem. Soc. Trans. —1981. —9, №3. —P. 191—195.
2. Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability// Microbiol. Rev. —1985. —49. —P. 1—32.
3. Luderitz O., Freudenberg M., Galanos C., Zehman K., Rietschel E., Shaw D.H. Lipopolysaccharide of gram-negative bacteria // Curr. Top. Membr. Transport. —1982. —17. —P. 79—134.
4. Vaara M. Antibiotic-supersusceptible mutants of Escherichia coli and Salmonella typhimurium // Antimicrob. Agents. Chemother. —1993. —37. —P. 2255—2260.
5. Seydel U., Schromm A., Blunk R., Brandenburg K. CD14 in the inflammatory response (Jack R.S. ed) // Chem.Immun.Basel.Karger. —2000. —74. —P. 5—24.
6. Малов В.А., Пак С.Г., Суджян Е.В. Синдром интоксикации в инфекционной патологии: новый взгляд на старую проблему // ЖМЭИ. —1994. —№5. —С. 105—109.
7. Захарова И.Я., Варбанец Л.Д. Углеводсодержащие биополимеры мембран бактерий. —К: "Наукова Думка", 1983. —128 с.
8. Vidaver A. Synthetic and complex media for the rapid detection of fluorescence of phytopathogenic pseudomonas:effect of the carbon source // Appl. Microbiol. —1967. —15, N16. —P. 1523—1524
9. Westphal O. and Jann K. Bacterial lipopolysaccharides extraction with phenol-water and further application of the procedure / In: Methods in Carbohydrate Chemistry (Whistler, R.L. and Wolfrom, M.L., Eds.) —Academic Press, New York. —1965. —5. —P. 83—91.
10. Ouchterlony O. Diffusion — in — gel methods for immunological analysis // Prog. Allergy. —1962. —6. —P. 3—15.
11. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. —М: "Мир", 1982. —446 с.
12. Weeke B. Rocket immunoelectrophoresis // Scand. J. Immunol. —1973. —2. —P. 37—46.
13. Engvall E., Jonsson K., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobin G, by means of enzyme-labeled antigen and antibody-coated tubes // Biochem. Biophys. Acta. —1971. —271. —P. 427—435.
14. Sengupta P., Bhattacharyya T., Majumder M. et all. Determination of the O-antigenic polysaccharide from Escherichia coli O128 by ELISA-inhibition study // FEMS Immunol. Med. Microbiol. —2000. —28, N2. —P. 133—137.
15. Laemmli U.K. Cleavage of proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. —227. —P. 680—685.
16. Tsai C.M., Frash C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrilamide gels // Anal. Biochem. —1982. —119. —P. 115—119.
17. Pyle S.W., Shill W.B. Rapid serological analysis of bacterial lipopolysaccharides by electrotransfer to nitrocellulose // J. Immunol. Methods. —1985. —85. —P. 371—382.
18. Takahashi K., Morikawa A., Kato Y. et al. Flavonoids protect mice from two types of lethal shock induced by endotoxin // FEMS Immun.Microbiol. —2001. —31. —P. 29—33.
19. Глазова Н.В. О внедрении современных методов контроля пирогенности фармацевтических объектов // Фарм.производителю. —2001. —17, №3. —С. 23—26.
20. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. —11-е изд., доп. —М: "Медицина", 1989. —400 с.
21. Tanamoto K., Ishibashi N. Succinilated lipid A is potent specific inhibitor of endotoxin mitogenicity // J. General Microbiol. —1992. —138. —P. 2503—2508.
22. Шашков А.С., Стрешинская Г.М., Наумова И.Б. и др. Фосфорсодержащий полисахарид клеточной стенки Actinoplanes sp. UNA 3697 // Биохимия. —1993. —58, №2. —С. 202—210.
23. Варбанец Л.Д., Гвоздяк Р.И., Мурас В.А. и др. Характеристика липополисахарида Ralstonia solanacearum ІСМР 6189 // Микробиол. журн. —1998. —60, №4. —С. 15—25.
24. Kocharova N.A., Knirel Yu.A., Varbanets L.D. et al. Studies of O-specific polysaccharide chains of Pseudomonas solanacearum lipopolysaccharides consisting of structurally different repeating units // Carbohydr. Res. —1993. —250. —P. 277—285.
25. Варбанец Л.Д., Винарская Н.В. Структура, функция, биологическая активность эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Совр. проблемы токсикологии. —2002. —№1. —С. 33—45.
26. Ansaruzzman M., Albert M., Holme T. et al. Klebsiella pneumoniae strain that shares a type-specific antigen with Shigella flexneri serotype 6 // Eur. J. Biochem. —1996. —237. —P. 786—791.
27. Palleroni N.J. Genus Pseudomonas Migula 1894 // Bergey's manual of systematic bacteriology / Ed.R. Noel., Krieg J.G. Holf. —Baltimore, London: Williams Wilkins, 1984. —1. —P. 141—198.
28. Yabuuchi E., Kosako Y., Oyaizu H. et all. Proposal of Burkholderia gen.nov. and transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group II to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia (Palleroni and Holmes, 1981) comb.nov. // Microbiol.Immunol. —1992. —136, №12. —P. 1251—1275.
29. Yabuuchi E., Kosako Y., Yano I. et al. Transfer of two Burkholderia and an Alcaligenes species to Ralstonia gen.nov.: Proposal of Ralstonia picketii (Ralston, Palleroni and Doudorff, 1973) comb.nov. and Ralstonia eutropha (Davis, 1969) comb.nov. // Microbiol.Immunol. —1995. —39, №11. —Р. 897—904.
30. Варбанец Л.Д., Рыбалко С.Л, Маричев И.Л. и др. Митогенная активность гликополимеров Clavibacter (Corynebacterium) michiganes и Pseudomonas solanacearum // Микробиол.журн. —1989. —51, №5. —С. 75—79.
31. Варбанец Л.Д., Прокопьева А.А., Прокопьев С.А., Кетлинский С.А. Исследование индукции фактора некроза опухоли и интерлейкина-1 под воздействием гликополимеров, выделенных из Pseudomonas solanacearum и Clavibacter michiganense // Микробиол. журн. —1990. —52, №5. —С. 17—23.
32. Варбанец Л.Д., Барабой В.А. Противолучевое действие Clavibacter michiganense // Микробиол. журн. —1993. —55, №5. —С. 56—59.
33. Zdorovenko G., Vodyanik M., Yakovleva L., Chernyshov V. Biologycal activities on mammals of Pseudomonas syringae lipopolysaccharides in connection with structural features of macromolecule // 10th Europ. Carbohydr. Symp. —Proc. (Galway, Ireland, 11—16 July, 1999). —Galway, 1999. —P. 134.
34. Дранник Г.Н., Гриневич Ю.А., Дизик Г.М. Иммунотропные препарты. —К: "Здоров'я", 1994. —288 с.
35. Branderburg K., Mayer H., Koch M. et al. Influence of the supramolecular structure of lipid A on its biological activity // Eur. J. Biochem. —1993. —218. —P. 555—563.
36. Seydel U., Branderburg K., Rietchel E. et al. A case for endotoxin conformation bacterial endotoxins: Basis science to anti-sepsis strategies // Progress in clinical and biological research. —1994. —388. —P. 17—30.

| Зміст |