ИЗУЧЕНИЕ КАНЦЕРОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ДИЭТИЛЭТАНОЛАМИННОЙ СОЛИ ХЛОРСУЛЬФОКСИМ-МЕТИЛА (ЭЛЛИПС, 12,5% в.р.) В ХРОНИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА КРЫСАХ И МЫШАХ

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, г. Киев

Разработка и внедрение новых фиторегуляторов с малой токсичностью и низкими нормами расхода является важным фактором снижения химического пресса на окружающую среду и организм человека. Вместе с тем, высокая биологическая активность регуляторов роста растений (РРР), заключающаяся в регулировке пролиферативных процессов в растительных тканях, не исключает возможности промоторного эффекта на ткани организма животных. Высокая биологическая активность на уровне очень низких количеств РРР объясняется тем, что все они являются либо естественными метаболитами растений (физиологические аналоги эндогенных фитогормонов), либо их синтетическими аналогами.

Например, механизм действия наиболее изученных и широко применяемых РРР — производных хлорфеноксиуксусной кислоты заключается в образовании в растениях путем бета-окисления 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), которая в высоких дозах проявляет гербицидное действие, в низких — стимулирующее благодаря структурному сходству с эндогенным гормоном [1].

Несмотря на то, что гербициду 2,4-Д посвящено более 40000 научных публикаций и технических отчетов, до сих пор достаточно сложно сделать определенные выводы о наличии либо отсутствии канцерогенной активности препарата [2].

Данные об изучении онкогенного потенциала других РРР крайне ограничены. Имеются сведения о потенциальной дозо-зависимой канцерогенной активности производного фумаровой кислоты РРР Фумара при хроническом пероральном поступлении в организм белых крыс в дозах 1/10, 1/20 и 1/50 ЛД₅₀, оцененной среднесрочным методом опухолеспецифических антигенов. Установлено, что у крыс при поступлении препарата в дозах 1/10 и 1/20 ЛД₅₀ наблюдается сенсибилизация к опухолевым органоспецифическим антигенам лейкоза, саркомы, молочной железы, желудочно-кишечного тракта и легких. Недействующей является доза 1/50 ЛД₅₀ [1].

Канцерогенная активность РРР Триман-1, относящегося к производным N-оксидов пиридина, изучена в традиционном хроническом 2-летнем эксперименте на крысах в диапазоне доз от близкой к максимально переносимой (МПД) в хроническом эксперименте до близкой к дозам, которые могут реально поступать в окружающую среду. Несмотря на статистически не достоверное увеличение частоты опухолей у подопытных животных (по 23% в обоих подопытных группах против 17% в контроле), анализ частоты опухолей по полу позволил выявить достоверное повышение этого показателя у самок, получавших МПД, за счет увеличения частоты доброкачественных опухолей гипофиза. На основании общего анализа спектра опухолей, их частоты, времени появления, латентного периода, соотношения доброкачественных и злокачественных форм, множественности опухолей был сделан вывод об отсутствии канцерогенной активности препарата Триман-1 для крыс [3].

Характерной особенностью РРР и гербицидов, в частности производных дегидроаспарагиновых и фумаровой кислот, сульфонилмочевин, лутидинов, стероидных гликозидов растительного происхождения и других, является отсутствие зависимости "доза-эффект", смена направленности эффектов, появление повторного токсического эффекта на уровне малых и сверхмалых доз. В связи с этим, изучение механизмов "парадоксальных эффектов" должно быть одним из приоритетных исследований современной токсикологии пестицидов [4].

В настоящее время используется больше десятка препаратов — производных сульфонилмочевины, характеризующихся широким спектром гербицидного действия и выраженной селективностью при низких нормах расхода. Причина высокой биологической активности этих соединений до сих пор не выяснена, что требует тщательного анализа при оценке их опасности для человека и окружающей среды. Все соединения этого класса относятся к средне- и малотоксичным с отсутствием видовой и половой чувствительности, малокумулятивным (коэффициент кумуляции >5 по показателю гибели животных). При длительном поступлении малых доз у экспериментальных животных выявлено изменение показателей, характеризующих состояние печени, почек, морфологического состава крови, углеводного обмена, что свидетельствует о наличии функциональной кумуляции. Наличие функциональной кумуляции политропного характера, а также широта зон хронического и биологического действия (соединения этого класса по токсикологическому параметру "зона хронического действия" относятся к веществам 1 класса опасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76) свидетельствуют о возможности отдаленного токсического эффекта при длительном воздействии малых доз этих соединений [5].

Одним из представителей относительно нового поколения РРР — производных сульфонилмочевины является препарат Эллипс, 12,5% в.р. из класса хлорсульфуронов, синтезированный в ВНИИХСЗР (Россия). Данные о канцерогенной активности как препарата Эллипс, 12,5% в.р., так и его близких аналогов отсутствуют.

Целью настоящей работы явилось изучение возможной канцерогенной активности действующего вещества (д.в.) РРР Эллипса, 12,5% в.р. — диэтилэтаноламинной соли хлорсульфоксим-метила.

Материалы и методы исследования

Хронический эксперимент по изучению канцерогенных свойств препарата проведен в соответствии с Методическими указаниями по гигиенической оценке новых пестицидов [6] с учетом международных подходов [7].

Исследования проведены на нелинейных белых крысах и мышах обоего пола в возрасте 1,5—2 мес разводки питомника нашего Института. В опыт было взято 480 крыс и столько же мышей (обоего пола поровну), разделенных на 3 подопытные, в зависимости от величины вводимой дозы, и контрольную группы. В качестве максимальной дозы исследовали МПД, установленную в 6-месячном эксперименте по критерию массовых коэффициентов печени, повышению активности монооксигеназ, изменению функции почек [8]. Учитывая особенности изучаемого РРР — биологическую активность в дозе 5 мг/га, следовательно — очень низкие нормы расхода и невозможность поступления в окружающую среду токсических доз, а также вероятность "пародоксальных" эффектов на уровне низких доз, функциональную кумуляцию политропного характера, средняя и минимальная дозы выбраны как 1/10 и 1/100 МПД. Таким образом, дозы для крыс составили: 13,8 мг/кг (1 группа), 3,4 мг/кг (2 группа), 0,3 мг/кг (3 группа) и 0 мг/кг (4 группа — контроль), дозы для мышей: 9,6 мг/кг (1 группа), 2,4 мг/кг (2 группа), 0,24 мг/кг (3 группа) и 0 мг/кг (4 группа — контроль). Крысы содержались по 6 животных в клетке, мыши — по 10, контрольные и подопытные животные размещались в одной клетке. Подопытные животные получали исследуемый препарат 5 раз в неделю путем свободного спаивания. В период интенсивного роста (в течение первого года исследований) ежемесячно проводили коррекцию доз с учетом изменения массы тела. По окончании двухлетнего периода введения препарата крысам и полуторалетнего периода введения мышам животных умерщвляли под эфирным наркозом. Павших в течение эксперимента и умерщвленных в агональном состоянии животных подвергали патологоанатомическому вскрытию, результаты которого заносили в индивидуальный протокол вскрытия. Органы и ткани, в которых были выявлены изменения, отбирали для последующего гистологического анализа. Образцы тканей фиксировали в 10% формалине, обезвоживали и заливали в парафин обычным способом. Срезы готовили с помощью санного микротома МС-1 и окрашивали гематоксилином и эозином.

Гистологическая диагностика выявленных опухолей осуществлялась с использованием классификации опухолей лабораторных животных, представленной в IARC Scientefic Publications [9—10].

Статистический анализ на наличие канцерогенных свойств вещества проводили несколькими методами по обеим количественным характеристикам эффекта — частоте опухолей и их латентному периоду. Попарное сравнение каждой группы с контролем по отношению наблюдаемых/ожидаемых чисел с помощью скорректированного на интеркуррентную смертность теста проведено с комбинированием таблиц контингентности 2х2 по срокам обнаружения опухолей и двухстороннего критерия Х² с поправкой Йетса на непрерывность [11]. Частоту опухолей сравнивали по критерию Пирсона (Х²) и с помощью оценки кумулятивной вероятности возникновения опухолей, рассчитанной по методике Каплан-Мейера [11]. Выбор данной методики продиктован относительно небольшим количеством животных с опухолями и трудностью выбора достаточно показательных интервалов для "life-table" метода.

Результаты и их обсуждение

В ходе исследований не зафиксировано нарушений физиологического состояния крыс и мышей всех групп. Не установлено существенных изменений массы тела и гибели подопытных животных по сравнению с контрольными. Основной причиной гибели животных на протяжении срока исследований явились интеркуррентные заболевания, не связанные с воздействием препарата, поскольку имели неспeцифический характер и одинаково часто встречались как у подопытных, так и контрольных животных.

При анализе данных, полученных в результате хронического эксперимента на крысах, установлено, что время обнаружения первой опухоли сопоставимо в подопытных и контрольной группах (табл. 1). Следует оговорить, что сроки обнаружения указанных новообразований явились практически сроками гибели животных. Первой опухолью в эксперименте на крысах была аденома простаты у самца 2-ой группы, которая не классифицируется как фатальная (т.е. приведшая к гибели) и выявлена при вскрытии животного, погибшего от абсцедирующей пневмонии. Поэтому обнаружение данной опухоли на 216 дней раньше, чем первой опухоли в контрольной группе, не может оцениваться как сокращение латентного периода при действии препарата.

Патоморфологический анализ опухолей показал, что наиболее часто у крыс всех групп возникали опухоли молочных желез, гипофиза и органов репродуктивной системы (табл. 2), что характерно для спонтанного спектра опухолей интактных животных.

Среди опухолей молочных желез, развившихся преимущественно у самок, чаще всего диагностированы доброкачественные новообразования. Это были фиброаденомы периканаликулярного типа, часть из которых — секретирующие. Опухоли характеризовались относительной структурной мономорфностью. Железистые протоки были сходны по величине и форме, в выстилающем их эпителии митозы практически не встречались. Значительно реже были выявлены фибромы и аденокарциномы молочных желез. Ткань опухолей, диагностированных как фибромы, была представлена обширными участками сформированной высокодифференцированной фиброзной ткани, образующей плотные узлы хрящеватой консистенции, аденоматозные структуры железы отсутствовали. Выявлено два случая аденокарциномы молочных желез (табл. 2). Микроскопически опухоли отличались инфильтрирующим ростом, структурной и клеточной атипией и полиморфизмом. Железистые ходы разной формы и размеров перемежались солидными полями эпителиоцитов. В клетках, составляющих паренхиму, часто обнаруживали фигуры митозов, в том числе атипичные. Метастазирования не отмечено.

Среди второй по величине группы опухолей, развившихся в органах репродуктивной системы, наиболее частыми были новообразования яичников. Выялено 4 случая фибромы яичников, представленных разрастаниями дифференцированной фиброзной ткани. Диагностирована также гранулезоклеточная карцинома, ткань которой представляла собой обширные поля пролифирирующих фибробластоподобных клеток, обильно васкуляризированная и содержащая ложные фолликулы, заполненные эозинофильными белковыми массами. Тубулярная карцинома яичника имела характерную железистую структуру. Протоки отличались полиморфной формой, их просветы были заполнены эритроцитами, лейкоцитами с примесью плазматических клеток. Соединительнотканная строма обильно проростала кровеносными сосудами.

У самки 1-ой группы найдена лютеома яичника, состоящая из массивных пролифератов крупных, светлых, "пенистых" клеток, содержащих в цитоплазме большое количество липидных вакуолей. Клетки структурировались альвеолярно.

Из опухолей матки была выявлена тубулярная аденокарцинома тела. Опухоль состояла из эпителиальных клеток, исходящих из эндометрия, образующих аденоматозные структуры различной величины и формы.

Из более редко встречающихся опухолей для данного вида животных в печени диагностированы мультицентричный холангиофиброз, цистхолангиома, тубулярная гепатоцеллюлярная карцинома, метастазирующая в ткань легкого, а также новообразование цимбаловой железы, мезотелиома почки и ангиосаркома органов брюшной полости.

Выявлено также 3 случая опухолей поджелудочной железы, среди них — низкодифференцированная карцинома, практически полностью замещавшая нормальную ткань органа. Среди растущих солидными пластами опухолевых клеток сохранялись дистрофически измененные островки Лангерганса.

Однако, данные новообразования встречались единично и были выявлены как в опыте, так и в контроле (табл. 2).

Статистическая оценка по критерию Х² (критическое значение критерия для уровня значимости a=0,05 при числе степеней свободы К=1 равно 3,8) позволила установить отсутствие достоверных различий по частоте опухолей у подопытных животных по сравнению с контролем (табл. 2).

Количественная оценка возможного онкогенного потенциала препарата проведена исходя из эффективного числа животных, расчитанного для каждой группы с целью избежать заниженной оценки частоты опухолей из-за гибели животных в начальные сроки эксперимента.

Для количественного учета мультицентричного опухолевого роста, а также возникновения нескольких опухолей у одного животного использован коэффициент множественности (отношение количества опухолей к числу животных с опухолями в группе). Данный показатель был выше в контрольной группе и в наименьшей дозе (3 группа) в основном за счет мультицентричности фиброаденом молочных желез (табл. 3). Частота злокачественных опухолей не изменяется во всех исследуемых группах (8—10), при этом количество доброкачественных (мультицентричных фиброаденом молочной железы) новообразований ниже у крыс, получавших максимальную и среднюю дозы препарата (табл. 3). Приведенные количественные показатели оценки онкогенного эффекта на крысах позволяют констатировать отсутствие увеличения частоты опухолей по сравнению с контролем.

Таким образом, выявленные в результате морфологических исследований в хроническом эксперименте на крысах новообразования как у подопытных, так и контрольных животных чаще всего развивались в молочных железах, гипофизе и органах репродуктивной системы, органотропность действия отсутствует. У подопытных крыс не обнаружено различий по локализации, спектру и гистологическому типу опухолей. При действии препарата не происходит учеличения количества животных с опухолями, коэффициента множественности и роста частоты злокачественных новообразований.

Статистический анализ данных, полученных в эксперименте на крысах с расчетом кумулятивной вероятности возникновения опухолей по методике Каплана-Мейера [2], демонстрирует отсутствие различий между величинами эффекта в опыте и контроле (рис. 1), а также отсутствие изменения их латентного периода под влиянием препарата.

С целью выявления "скрытого" канцерогенного эффекта результаты эксперимента были проанализированы при помощи "logrank"-теста с составлением таблиц контингентности по интервалам времени эксперимента и расчетом ожидаемых чисел для каждого интервала при попарном сравнении с контролем по критерию Х² (табл. 4). Использование данного теста было вызвано стремлением учесть несколько различающуюся по группам интеркуррентную смертность при оценке онкогенного потенциала вещества. Анализ проведен по временным интервалам (срокам гибели животных с опухолью), при этом интервалы выбирались таким образом, чтобы наблюдаемые числа (число животных с опухолью) не были равны нулю. Ожидаемые числа (Е) рассчитывали с учетом числа животных с опухолями и общего количества животных в подопытной группе и контроле (попарно для каждой группы и интервала отдельно). Отношение наблюдаемых/ожидаемых чисел (относительный риск) для отдельной группы не может служить основанием для суждения о достоверности, хотя является наглядным качественным тестом. Отношение величин относительных рисков подопытной и контрольной групп принято считать мерой соотношения относительных рисков (rr).

Как видно из данных табл. 4, практически совпадают рассчитанные величины относительного риска. Мера соотношения относительных рисков для разных групп колеблется от 0,76 до 1,06. Это свидетельствует о том, что риск гибели от опухолей в подопытных группах не возрастает по сравнению с риском гибели от спонтанных опухолей. Проведенный статистический анализ по критерию Х², расчитанному на основе наблюдаемых и ожидаемых количеств животных с опухолями, суммированным по всем интервалам, не выявил достоверного увеличения частоты опухолей у подопытных животных. Различия наблюдаются только между 1-ой группой и контролем, однако за счет более высокой частоты опухолей в контроле (22,1% против 16,8%).

В отличии от крыс, в эксперименте на мышах в каждой группе опухоли возникали единично. Применение вышеуказанных статистических методов в такой ситуации нецелесообразно. Анализ выживаемости по группам свидетельствует о достаточно высокой смертности животных в течение эксперимента, однако не выявлено существенных различий данного показателя в зависимости от дозы (рис. 2), что позволяет исключить влияние препарата. Вместе с тем, это объясняет заниженый процент опухолей в эксперименте. В табл. 5 суммированы данные по частоте и локализации выявленных новообразоваий. Все развившиеся в течение эксперимента у подопытных и контрольных мышей опухоли являются характерными для данного вида животных. Количественные показатели эксперимента приведены в табл. 6. Различия наблюдаются во времени обнаружения первой опухоли, вероятнее всего случайные, поскольку спонтанные новообразования, как правило, возникают у мышей в возрасте 8—12 месяцев. Частота опухолей в разных группах не различается.

Таким образом, анализ данных хронического эксперимента по изучению канцерогенной активности препарата на крысах и мышах выявил отсутствие повышения частоты опухолей, изменения их спектра и гистоструктуры, сокращения латентного периода, что дает основание полагать, что д.в. РРР Эллипс, 12,5% в.р. — диэтилэтаноламинная соль хлорсульфоксим-метила не обладает потенциальной онкогенной опасностью.

Литература
1. Богорад В.С. Комплексная гигиеническая регламентация нового регулятора роста растений фумара в объектах окружающей среды. Дис. … канд. мед. наук. —Киев, 1991. —322 с.
2. A Comprehensive, Integrated Revivw and Evaluation of the Scientific Evidence Relating to the Safety of the Herbicide 2,4-D / I.C. Munro, G.L. Carlo, J.C. Orr, K.G. Sung, R.M. Wilson, E. Kenneponl, B.S. Lynch, M. Jablinske & N.L. Lee // Jornal of the American College of Toxicology. —1992. —V. 11, N5. —P. 559—664.
3. Баглій Є.А., Недопитанська Н.М., Решавська О.В., Лісовська В.С. Вивчення канцерогенної активності регулятору росту рослин "Триман-1" // Сучасні проблеми токсикології. —2002. —№2. —С. 62—67.
4. Повякель Л.И., Жминько П.Г., Любинская Л.А., Жминько О.П. Вопросы гигиенического нормирования регуляторов роста растений// Тези І з'їзду Токсикологів України, 11-13 жовтня 2001 р. —Київ, 2001. —С. 49.
5. Любинская Л.А., Повякель Л.И. Токсикологическая характеристика производных сульфонилмочевины // Современные проблемы токсикологиии. —2000. —№2. —С. 28—32.
6. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов / Сост. Е.А. Антонович, Ю.С. Каган, Е.И. Спыну и др. —Киев, 1988. —С. 212.
7. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risk of chemicals to human. Suppl.2. Long-term and short-term screening assays for carcinogens: a critical appraisol —Lyon, 1980. —P. 426.
8. Данилюк В.П. Токсикология новых регуляторов роста (эллипс, харелли) и гигиеническая регламентация их применения в сельском хозяйстве. Автореф. дис. … канд. мед. наук. —Киев, 1991. —22 с.
9. Pathology of tumours in laboratory animals. Vol. 1 —Tumors in the rat. Second Edetion. Edited by V.S.Turusov and U.Mohr. —Lyon: IARC Scientefic Publications №99. —1990. —P. 754.
10. Pathology of tumours in laboratory animals. Vol. 2 —Tumors in the mouse. Editor-in-chief V.S. Turusov. —Lyon: IARC Scientefic Publications №23, 1979. —P. 661.
11. Турусов В.С., Парфенов Ю.Д. Методы выявления и регламентирования химических канцерогенов. —М.: Медицина, 1986. —С. 125.

| Зміст |