НАКОПЛЕНИЕ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СВИНЦА В УЛЬТРАСТРУКТУРАХ ГЕПАТОЦИТОВ КРЫС

Украинский НИИ промышленной медицины МОЗ, г. Кривой Рог, Украина

Возникновение многих патологических процессов, в том числе экзогенного химического генеза, часто связывают с нарушениями проницаемости клеточных и субклеточных мембран. Взаимодействие токсичных химических веществ, в том числе и тяжелых металлов, с компонентами клеточных органел и мембран лежит в основе механизма их биологического действия [1, 2]. В этой связи на современном этапе оправдано изучение пато- и морфогенеза заболеваний экзохимической природы, а также проведение экспериментальных исследований патологических процессов на уровнях клетки, субклеточных структур, мембранных и ферментных систем [3—5].

Свинец, как глобальный химический загрязнитель внешней среды, способен оказывать токсическое действие на организм лишь при условии его проникновения в различные клетки тканей и органов. От того, в каком количестве и каким образом накапливается металл в тех или иных субклеточных структурах, зависит степень повреждения самой клетки, её систем, а, следовательно, тканей, органов и всего организма [3, 6].

В литературе встречаются лишь единичные разрозненные, противоречивые данные о путях и механизмах проникновения свинца в клетки различных тканей и органов, внутриклеточной кумуляции металла и взаимодействии его с различными внутриклеточными структурами [2, 3, 7]. В связи с этим нет полной и объективной картины, дающей представление о процессах внутриклеточной токсикокинетики свинца и механизмах его токсического действия на уровне клетки [3,6]. Сказанное выше явилось основной предпосылкой нашего исследования.

Цель предпринятого эксперимента — изучить с помощью специально разработанного метода ультрагистохимии внутриклеточное накопление и распределение свинца в ультраструктурах гепатоцитов при введении его в организм белых крыс.

Материалы и методы исследования

Опыты проведены на 28 имбредных половозрелых белых крысах самцах, массой 180—220 г, которые содержались в виварии на стандартном пищевом и водном режиме. Животные были разделены на 2 группы — опытную (n=18) и контрольную (n=6). Животным опытной группы одноразово внутрибрюшинно вводили 1% водный раствор ацетата свинца в дозе 62,5 мг/кг. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор. Эвтаназию крыс опытной группы осуществляли через 1, 5 и 10 дней после начала эксперимента (по 6 на каждый срок опыта), а контрольных — в конце опыта. Материалом для ульрагистохимического исследования служила печень животных, которую извлекали из брюшной полости после предварительной обработки. Для этого крыс наркотизировали теопенталом натрия (40 мг/кг), после чего проводили катетеризацию воротной и канюлизацию печеночной вены. Через катетер осуществляли перфузию органа сначала теплым (+37°C) раствором Рингера, а затем раствором фиксатора, содержащего 4% раствор параформа, 2,5% раствор глютарового альдегида и 3% раствор бихромата калия, приготовленного ex temporae на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2—7,4). После предварительной фиксации органа животных умерщвляли декапитацией и вырезали кусочки печени размером 1х1х1 мм, которые фиксировали в двух порциях фиксатора, обрабатывали в двух сменах 3% раствора бихромата калия, промывали трижды в 0,05 М кокадилатном буфере (рН 7,2—7,4), после чего дополнительно фиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия. После фиксации их трижды промывали в 0,05 М кокадилатном буфере, обезвоживали в ацетонах возрастающей крепости и заливали общепринятым способом в смесь эпона и аралдита [8]. Для ультрагистохимических исследований использовали материал от 3 подопытных (на каждом сроке интоксикации) и 3-х контрольных крыс. Для контроля специфичности ультрагистохимической реакции на каждый срок исследования использовали по 3 оставшихся животных, у которых аналогичным образом проводили обработку печени фиксаторами и соответствующими реагентами, которые не содержали хромата. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме LKB Ш (Швеция). Оценку ультрагистохимической реакции проводили на неконтрастированных ультратонких срезах, а изучение ультраструктурных изменений гепатоцитов — после контрастирования их растворами уранилацета и цитрата свинца по Рейнолдсу в электронном микроскопе ПЭМ-125.

Результаты и их обсуждение

Выраженные изменения ультраструктуры и ультрагистохимических особенностей гепатоцитов обнаруживались уже на первые сутки после воздействия свинца. Наиболее чувствительными оказались митохондрии, гладкая и зернистая эндоплазматическая сеть, пластинчатый комплекс, а так же ядро. При ультрагистохимическом исследовании в митохондриях гепатоцитов обнаруживалось образование электронно-плотного осадка в виде полиморфных гранул хромата свинца. Мелкие с четкими контурами гранулы диаметром от 5 до 10 нм, часто располагались на внутренней поверхности внутренних мембран митохондрий. Нередко, сливаясь, они образовывали довольно крупные округлой или неправильной формы гранулярные конгломераты с четким контуром, которые достигали размера 100—120 нм (рисунок, а). При наличии в митохондриях признаков частичной или полной деструкции крист, единичные, крупные, электронноплотные гранулы хромата свинца часто встречались в их матриксе. В некоторых митохондрииях выявлялось практически полное заполнение матрикса электронноплотным гранулярным или аморфным материалом. Как правило, в таких органеллах на неконтрастированных ультратонких срезах не обнаруживались даже единичные фрагменты крист, что было обусловлено их заполнением электронноплотным гранулярным и аморфным материалом. Наружные мембраны митохондрий сохраняли свою целостность на всем протяжении.

Нередко рядом с поврежденными и "нафаршированными" электронноплотным материалом митохондриями располагались единичные органелы с явными признаками повреждения в виде отека матрикса, сопровождающегося деструкцией крист, но не содержащих ни на мембранах, ни в матриксе электронноплотных гранул хромата свинца или аналогичного по электронной плотности материала (рисунок, б). Это может свидетельствовать о том, что существуют какая-то избирательность в отношении накопления свинца в митохондриях. Для объяснения этого явления были детально проанализированы ультратонкие срезы печени подопытных крыс, обработанные общепринятым методом. Результаты показали, что такое же число митохондрий в гепатоцитах имели уплотненный матрикс, в котором встречались мелкие, электронноплотные включения кальций-фосфатных комплексов. Наличие последних обычно свидетельствует о повышенной функциональной активности этих внутриклеточных структур [9, 10]. Сравнительный анализ ультраструктуры митохондрий и их ультрагистохимических особенностей позволил сделать предположение о том, что свинец способен накапливаться и обнаруживаться предложенным ультрагистохимическим методом только в тех структурах, где для этого создан "соответствующий плацдарм". Повышенная функциональная активность митохондрий, сопровождающаяся изменениями проницаемости мембран, может явиться одной из причин, по которой может осуществляться конкурентное взаимодействие ионов кальция и свинца на участках связывания ионов в структуре молекул мембран и/или матрикса [11].

На 5 сутки свинцовой интоксикации число митохондрий с включениями хромата свинца заметно возростало. Зачастую большая часть поверхности внутренних мембран и внутреннего матрикса этих структур содержали электронноплотные гранулы хромата свинца, которые не всегда имели четкие и правильные контуры, а их электронная плотность была заметно сниженной. Такая ультрагистохимическая картина, вероятно, может свидетельствовать о частичной елиминации свинца из митохондрий.

Сопоставление ультраструктурных и ультрагистохимических характеристик гепатоцитов крыс на 1 и 5 сутки интоксикации свидетельствует, что в клетках заметно увеличивалось общее количество митохондрий. При этом, наряду с поврежденными органелами с выраженным отеком и просветлением матрикса, дискомплексацией и деструкцией крист, часто располагались "молодые" их формы, которые имели некрупные размеры, плотный матрикс и единичные кристы. Такое "омоложение" митохондрий в гепатоцитах подопытных животных по сравнению с предыдущим сроком интоксикации может свидетельствовать об активации компенсаторно-приспособительных процессов, которые направлены, преимущественно, на структурное обеспечение утраченных функций [9].

Об активации компенсаторно-приспособительных реакций в клетках на данном сроке интоксикации может свидетельствовать и существенное увеличение в гепатоцитах числа лизосомальных ультраструктур, роль которых в процессах клеточной адаптации хорошо известна [9, 12]. Увеличение их количества в клетках происходило, преимущественно, за счет увеличения аутофагических вакуолей, содержащих малоизмененные сегрегированные участки цитоплазмы еще без примеси лизосомальных гидролаз, вторичных лизосом с гомогенным электронноплотным содержимым и включениями липофусцина, а также остаточных телец, основную часть которых образовывали включения липофусцина. Ультрагистохимически было обнаружено, что в немногочисленных первичных лизосомах свинец практически не накапливался. В противоположность этому, во вторичных лизосомах и остаточных тельцах его присутствие всегда обнаруживалось в виде небольшого количества аморфного, электронноплотного материала и мелких гранул хромата свинца (рисунок, в). Это подчеркивает ведущую роль лизосомального аппарата клеток в обеспечении внутриклеточных механизмов токсикокинетики свинца [13]. Особую роль лизосомальный аппарат клетки занимает в процессах биодеградации макромолекулярных комплексов [14], в том числе, вероятно, содержащих свинец. О том, что на эти сроки интоксикации в гепатоцитах активно включаются процессы биодеградации и элиминации свидетельствуют обнаруженные в перисинусоидальных пространствах и просветах желчных капилляров многочисленные остаточные и миелиноподобные тельца, содержащие в своей структуре мелкие, электронноплотные гранулы хромата свинца (рисунок, г). Обнаружение металла в просветах желчных капилляров, вероятно, не случайно, ибо имеются убедительные данные о взаимодействии этого металла с желчными кислотами и различными компонентами желчи на этапах её синтеза в гепатоцитах [6, 7].

Свинец, как показали ультрагистохимические исследования, способен в значительных количествах накапливаться в цитоплазме гепатоцитов. Однако, в цитозоле клеток ультрагистохимическим методом он не обнаруживался, его наличие исключительно определялось в структуре миелиноподобных телец, образующихся в очагах парциального некроза цитоплазмы.

На 10 день интоксикации электронно-микроскопическая картина распределения свинца в гепатоцитах несколько отличалась от предыдущего срока опыта, но характер накопления металла во внутриклеточных ультраструктураx оставался однотипным. Ультраструктурные особенности гепатоцитов крыс на этом сроке воздействия ацетата свинца характеризовались активно протекающими компенсаторно-приспособительными и восстановительными процессами в виде внутриклеточного обновления, гиперплазии и гипертрофии ультраструктур, а так же пролиферации отдельных гепатоцитов с появлением в ткани "молодого" пула клеток.

Что касается обнаружения свинца в структуре ядра, то данным методом ультрагистохимии выявить его не всегда удавалось. На 5 и 10 сутки опыта в единичных ядрах гепатоцитов наблюдали появление не характерных для контроля единичных гранулярных внутриядерных включений, представленных или мелкими электронноплотными гранулами, собранными в конгломераты без ограничивающей мембраны, или электронноплотными, гомогенными образованиями преимущественно округлой формы. Если в мелкогрануллярных включениях можно было иногда на фоне менее электронноплотного материала выявить более плотные включения, напоминающие отложения хромата свинца, то в гомогенных электронноплотных внутриядерных включениях они не определялись.

Данные ультрагистохимического исследования свидетельствуют, что свинец в гепатоцитах выявляется лишь в поврежденных внутриклеточных ультраструктурах, что имеет своё логическое объяснение. Например, повреждение митохондрий в клетках всегда сопровождается нарушениями окислительного фосфорилирования и проницаемости наружных и внутренних мембран. В этих процессах обязательное участие принимают ионы кальция и фосфора, являющиеся структурным компонентом биомолекул [15, 16]. Токсические эффекты свинца, как известно, обусловлены нарушением этих процесов, в результате которых кальций, учитывая его биологический антагонизм со свинцом, легко может замещаться свинцом, который и выявляется ультрагистохимически в виде труднорастворимого, сложного кальций-фосфат-свинец-хроматного комплекса, имеющего по сравнению с другими сложными биокомплексами высокую электронную плотность. Вызывая ряд физико-химических изменений в структуре биомолекул клеток, которые подлежат биодеградации и элиминации из клетки с помощью лизосомального аппарата, металл обнаруживается в составе этих субклеточных структур. Качественные и количественные характеристики высокоспециализированных внутриклеточных структур могут позволить проследить за интенсивностью внутриклеточных процессов биодеградации и элиминации свинца.

Таким образом, в результате проведенных ультраструктурных исследований с применением оригинального метода ультрагистохимии показано, что свинец в гепатоцитах после однократного внутрибрюшинного введения крысам ацетата свинца в дозе 62,5 мг/кг обнаруживается преимущественно в митохондриях уже на первые сутки после его поступления в организм. В дальнейшем количество его в этих структурах заметно уменьшается пропорционально длительности восстановительного периода. Наряду с этим, в динамике восттановительного периода в гепатоцитах значительно повышается количество лизосомальных ультраструктур, содержащих свинец, особенно вторичных лизосом и остаточных телец, что свидетельствует о компенсаторном усилении в клетках процессов внутриклеточной детоксикации. Единичные находки внутриядерных гранулярных включений незначительных количеств свинца свидетельствуют, вероятно, о высокой стойкости "ядерных барьеров" к проникновению этого металла.

Литература
1. Трахтенберг И.М., Колесников В.С., Луковенко В.П. Тяжелые металлы во внешней среде (современные гигиенические и токсикологические аспекты). —Минск: Навука и техника, 1994. —285 с.
2. Иммунофармакология микроэлементов. / А.В. Кудрин, А.В. Скальный, А.А. Жаворонков, М.Г. Скальная и др. —М.: Из-во КМК, 2000. —537 с.
3. Микроэлементозы человека: этиология, классификация, органопатология / А.П. Авцын, А.А. Жаворонков, М.А. Риш, Л.С. Строчкова. —М.: Медицина, 1991, —496 с.
4. Зербіно Д.Д., Сердюк А.М. Чернівецька хімічна хвороба: Нове екологічне захворювання? (Нариси з епідеміології, клініки, етіології. Версії виникнення, документи). —Львів: Місіонер, 1998. —280 с.
5. Проданчук Н.Г., Левицкий Е.Л. Приоритетные проблемы токсикологии. (К итогам состоявшегося І съезда токсикологов Украины) // Соврем. проблемы токсикологии. —2001. —№4. —С. 85—88.
6. Гигиенические критерии состояния окружающей среды: Свинец. —Женева: ВОЗ, 1980. —Вып. 3. —192 с.
7. Луговской С.П., Легкоступ Л.А. Механизмы биологического действия свинца на пищеварительную систему // Соврем. проблемы токсикологии. —2002. —№2. —С. 45—50.
8. Гайер Г. Электронная гистохимия: Пер. с нем. —М.: "Мир", 1974. —485 с.
9. Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций / Под ред. Д.С. Саркисова. —М.: Медицина, 1987. —448 с.
10. Авцын А.П., Шахламов В.А. Ультраструктурные основы патологии клетки. —М.: Медицина, 1979. —320 с.
11. Бакеева Л.Е., Ченцов Ю.С. Митохондриальный ретикулум: строение и некоторые функциональные свойства // Итоги науки и техники. ВИНИТИ., сер. Общая биология, 1989. —9. —104 с.
12. Панин Л.Е., Маянская Н.Н. Лизосомы: роль в адаптации и восстановлении. —Новосибирск: Наука, 1987. —196 с.
13. Чекунова М.П., Фролова А.Д. Роль лизосом в токсикологии металлов // Структура и функция лизосом. Мат. Всесоюзн. симпозиума. —М., 1986. —288 с.
14. Ступина А.С., Терман А.К., Квитницкая-Рыжова Т.Ю. и др. Возрастные особенности аутофагоцитоза в различных тканях лабораторных животных // Цитология и генетика. —1994. —№6. —С. 15—20.
15. Зинченко В.П., Ким Ю.В., Караджов Ю.С. Транспорт Са²⁺ в митохондриях. Регуляция внутримитохондриального уровня Са²⁺ / Молекулярные механизмы клеточного гомеостаза. —Новосибирск: Наука, 1987. —С. 76—87.
16. Мусил Я. Основы биохимии патологических процессов: Пер. с чешск. —М.: Медицина, 1985, 432 с.

| Зміст |